CN104694525A - 一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法和应用。首先分别筛选出高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化，分别得到被驯化的Kuenenia.Anammoxidans，Ochrobactrum.sp和Flavobacterium mizutaii。再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷高效复合降解菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷高效降解菌包埋复合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。应用于低温高盐条件氨氮和石油烃污染水体的净化，微生物量大。显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷复合菌种，其载体材料来源广泛，制法简单，易于产业化，机械强度高，处理效果好，费用低，对环境也不会造成二次污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法与应用，具体利用固定化厌氧氨氧化、反硝化和石油降解菌混合菌种按一定比例混合在低温高盐条件下联合降解氨氮和石油烃。
背景技术
目前，我国部分河流水体受到严重的氨氮和石油烃污染，使得水体恶臭、生境破坏。针对同时受石油烃和氨氮污染自然水体治理难的原因在于石油烃抑制了水体富氧，使得好氧微生物活性降低或衰亡。已有氨氮和石油烃污染常采用的方法有物理方法、化学方法和生物方法，虽然生物方法被认为是最安全、有效的处理方法，但对于自然水体并没有一种高效的去除氨氮和石油烃的方法。诸如一种石油污染治理用生物降解剂(ZL201110000155.1)的中国发明专利，虽能够有效的降解石油烃，最佳降解率为81.3％，但并不能去除氨氮污染。石油烃污染造成的厌氧环境和石油烃的毒性是制约生物脱氮的主要原因；另有一种厌氧氨氧化污泥包埋固定化方法(ZL201310359764.5)，解决了厌氧条件对氨氮的去除问题，对低浓度氨氮的去除率达99％，但该方法只单纯的解决了氨氮污染问题，并未涉及对石油烃的降解。目前并没有一种同时降解氨氮和石油烃的生物方法，显然提供一种固定化耐盐耐冷混合菌种联合降解氨氮和石油烃的方法是十分必要的。
在氨氮废水处理过程中，氨氮在好氧微生物的作用下将氨氮转化为硝态氮，而需在厌氧微生物的参与下转化为氮气。采用厌氧微生物治理受污水体存在厌氧微生物生长环境苛刻，易受外界环境影响，在自然水体中容易流失等问题。另外，厌氧氨氧化细菌世代周期长，生长缓慢，低浓度的厌氧氨氧化细菌很难发挥其作用。
研究已表明，高效降解菌的应用受环境影响大，极端环境成为良好降解效果的限制因素。我国北方地区较长一段时间处于寒冷状态，低温条件下不利于微生物的生长，使得利用生物手段降解污染物受到限制。又河口地区水体盐度介于淡水和海水之间，淡水中的微生物很难适应高盐度水体，不能在高盐度水体中发挥作用，甚至生存。已有研究耐低温石油降解菌株、培养方法、培养基及其应用(ZL201010239621.7)，该方法筛选出的石油降解菌在温度为25℃，盐度为5g/L的环境下降解率高于40％，但不能适应高盐度环境。可见就现有技术主要集中在单一的耐冷性或耐盐性研究，显然同时提供耐盐耐冷复合菌种固定化方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法，以克服现有技术存在的问题。
研究表明，采用生物手段同时去除氨氮和石油烃的方法受到如下因素限制：石油烃密度小于水浮于水体表面，阻碍了水体的富氧，硝化过程中需要氧气作为电子受体，石油污染造成水体中好氧硝化细菌难以生存，所以很难实现好氧硝化、反硝化和石油降解菌联合降解氨氮和石油烃。因此就以上问题筛选出厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌的复合菌种，联合降解水体中的氨氮和石油烃。又考虑到北方河口地区低温高盐的实际情况，对筛选出的菌株进行耐盐耐冷性驯化，得到相应的耐性降解菌。本发明还考虑到在高效菌应用过程中存在厌氧微生物生长环境苛刻，易受外界环境影响，在自然水体中容易流失等问题，所以采用固定化技术以保证微生物的浓度，最终实现了水体中氨氮和石油烃的同时去除。
因此本发明的耐盐耐冷复合菌种固定化方法，首先筛选出高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌，然后对上述厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌进行耐盐和耐冷性驯化分别得到耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌、耐盐耐冷反硝化细菌和耐盐耐冷石油降解菌，又将生物炭球置于耐盐耐冷高效降解菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球与耐盐耐冷高效降解菌包埋复合液混合，最后将复合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。
所述的高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌的筛选方法，包括如下步骤：
(1)石油降解菌富集培养与分离：称取干重10g-20g的受石油污染沉积物，加入到盛有100mL石油降解菌富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个石油降解菌富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，得到石油降解菌富集液；将上述石油降解菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养3-7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种石油降解菌；上述石油降解菌富集培养基：柴油10g，(NH4)2SO45g，CaCO35g，NaCl 2g，MgSO40.5g，K2HPO41g，MnSO40.01g，FeSO40.04g，蒸馏水1000mL，5％Na2CO3调节pH＝7.2；
(2)厌氧氨氧化菌富集培养：称取10g-20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL厌氧氨氧化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，得到厌氧氨氧化菌富集液；将上述厌氧氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃-30℃条件下密封培养3-7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种厌氧氨氧化菌；上述厌氧氨氧化富集培养基：NH4HCO30.044g，NaNO20.017g，KH2PO40.057g，MgCl2·6H2O 0.165g，CaCl2·2H2O0.3g，NaHCO30.105g，EDTA 0.02g，FeCl2·4H2O 0.005g，ZnCl20.255mg，CoCl2·6H2O 0.3mg，MnCl2·4H2O 1.238mg，CuCl2·2H2O 0.213mg，NiCl2·6H2O 0.238mg，H3BO30.014mg，Na2MO4·2H2O 0.304mg，NaWO4·2H2O 0.063mg，NaSeO30.061g，蒸馏水1000mL，调节p H值为7.0～7.2；
(3)反硝化细菌富集培养：称取10g-20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL反硝化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，得到反硝化细菌富集液；将上述反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃-30℃条件下密封培养3-7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种纯种反硝化细菌氨氧化菌；上述反硝化富集培养基：KNO31.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 1.0g，1％溴百里酚蓝酒精溶液(BTB)5mL，KH2PO41.0g，CaCl2·2H2O 8.5g，柠檬酸钠8.5g，蒸馏水1000mL，调节p H值为7.0～7.2。
上述固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸提物5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节p H值为7.0～7.2。
所述的厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌进行耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：
(1)石油降解菌耐盐耐冷性驯化：将上述分离得到多株纯种石油降解菌菌挑取到一个石油降解菌富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到厌氧氨氧化菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对石油烃降解效果好的石油降解菌即为耐盐石油降解菌；将上述筛选出的耐盐石油降解菌以富集液与富集培养基5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的石油降解菌富集培养基中富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对石油烃降解效果好的石油降解菌即为耐盐耐冷石油降解菌；
(2)厌氧氨氧化菌耐盐耐冷性驯化：在氩气保护下将上述分离得到多株纯种厌氧氨氧化菌菌挑取到一个厌氧氨氧化菌富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，分别得到厌氧氨氧化菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，筛选出对氨氮降解效果好的厌氧氨氧化细菌即为耐盐厌氧氨氧化细菌；在氩气保护下将上述筛选出的耐盐厌氧氨氧化菌厌氧氨氧化菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下密封震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的厌氧氨氧化细菌即为耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌；
(3)反硝化细菌耐盐耐冷性驯化：在氩气保护下将上述分离得到多株纯种反硝化细菌菌挑取到一个反硝化细菌富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，分别得到反硝化细菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对硝态氮降解效果好的反硝化细菌即为耐盐反硝化细菌；在氩气保护下将上述筛选出的耐盐反硝化细菌以富集液与富集培养基5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的反硝化细菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下密封震荡培养数天，筛选出对硝态氮降解效果好的反硝化细菌即为耐盐耐冷反硝化细菌。
上述生物炭球挂膜方法：将生物炭球置于上述耐盐耐冷高效降解菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球，上述耐盐耐冷高效降解菌富集液在氩气保护下将上述耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌富集液、耐盐耐冷反硝化细菌富集液和耐盐耐冷石油降解菌的富集液按4：1.5：4.5的比例混合而成的；
上述耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球：将上述挂膜生物炭球与耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球，上述的耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液是2％海藻酸钠与12％聚乙烯醇的水溶液与湿菌体按体积比(2-5)：1的比例混合得到包埋混合液，上述湿菌体是取50ml-100ml的上述耐盐耐冷高效降解菌富集液经5000-8000r/min离心10-15min,去除上清液后，在氩气保护下用无菌水清洗若干次次后得到的。
本发明的生物炭球的制备方法，包括如下步骤：
(1)取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛，得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；
(2)将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将上述的化学改性生物炭置于频率40Hz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；
(3)再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；
(4)将上述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为(0.5-1)：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，上述硅酸钠与粘土质量比为3％，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5％。
上述的马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min,温度为300℃-400℃和保温时间180min，恒温干燥是在60℃-80℃条件下干燥8h-12h。
上述的耐盐厌氧氨氧化细菌、耐盐反硝化细菌和耐盐石油降解菌应用于高盐条件污染水体净化，耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌、耐盐反硝化细菌和耐盐石油降解菌应用于低温高盐条件污染水体净化。
上述的复合菌液应用于低温高盐条件受石油烃和氨氮污染水体净化。
上述的挂膜生物炭球应用于低温高盐条件受低浓度石油烃和氨氮污染水体净化，复合菌种固定化生物炭球应用于低温高盐条件受高浓度石油烃和氨氮污染水体净化。
上述的厌氧氨氧化细菌是被驯化后的Kuenenia.Anammoxidans；上述反硝化细菌是被驯化后的Ochrobactrum.sp；上述石油降解菌被驯化后的Flavobacterium mizutaii。
显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷复合菌种，可以广泛地应用于低温高盐条件氨氮和石油烃污染水体的净化，微生物量大。其载体材料来源广泛，制法简单，而且易于产业化，机械强度高，处理效果好，费用低，对环境也不会造成二次污染，因此具有良好的社会效益和经济效益。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明具体对受污的辽河口湿地水体进行降解，水质为：NH4-N浓度达35mg/L，NO2-N浓度为12mg/L，NO3-N的浓度为28mg/L，TN浓度为85mg/L，石油烃的浓度为20mg/L控制盐度为10‰，采用以固定化耐盐耐冷混合菌种联合降解氨氮和石油烃的方法在温度为10℃的条件下进行震荡处理，包括步骤如下：
(1)生物炭球的制备：称取玉米秸秆200g，用去离子水洗净，烘干至恒重，用植物秸秆粉碎机将芦苇秸秆粉碎后过20目筛，得到芦苇秸秆粉末，经过马弗炉烧制成为生物炭。马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min,温度为300℃和保温时间180min；为增加生物炭的比表面积，即为增加生物炭的孔隙度，去除生物炭内的灰分，采用物化联合手段对上述生物炭进行表面改性：向烧制好的5g生物炭中加入0.1mol/L的硝酸溶液，充分混匀，在室温200r/min的条件下在磁力搅拌器下搅拌24h，用去离子水清洗生物炭至中性，使得生物炭得到化学改性。将化学改性后的生物炭置于微波清洗机中以频率40Hz的微波震荡40min，进一步去除灰分和增加其孔隙度。物化改性后的生物炭经过滤后置于60℃干燥箱中恒温干燥8h，烘干后制成物化生物炭置于避光保存；将100g辽河口湿地粘土在60℃的恒温干燥箱中干燥12h，过100目筛，得到粘土粉末,置于棕色瓶中备用；将硅酸钠和碳酸氢钠分别按粘土质量比为3％和1.5％用去离子水溶解混匀，将物化改性的生物炭烘干后与粘土粉末按1:10的例混合加入到硅酸钠和碳酸氢钠混合液中，用制球机制成直径为0.8cm-1.0cm的球粒后置于80℃的恒温干燥箱中干燥8h，得到干燥炭球颗粒；将制好的生物炭球置于马弗炉在升温速度10℃/min,温度为400℃和保温时间180min的条件下烧制。
(2)高效降解菌的筛选：为得到高效石油降解菌，称取干重10g的受石油污染沉积物，加入到盛有100mL石油降解菌富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min，28℃的条件下震荡培养7天后吸取10mL至另一个石油降解菌富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，得到石油降解菌富集液；为得到厌氧氨氧化菌，称取10g的厌氧沉积物加入到盛有100mL厌氧氨氧化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min，28℃的条件下密封震荡培养7天，得到厌氧氨氧化菌富集液；为得到反硝化细菌，称取10g的厌氧沉积物加入到盛有100mL反硝化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min，28℃的条件下密封震荡培养7天，得到反硝化细菌富集液。为得到单一的高效降解菌将得到的高效降解菌进行分离纯化，将上述石油降解菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃培养3天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种石油降解菌；其次将上述厌氧氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃条件下密封培养3天，待菌落长成后，在氩气保护下挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种厌氧氨氧化菌；最后将上述反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃条件下密封培养3天，待菌落长成后，在氩气保护下挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种反硝化细菌氨氧化菌。
(3)高效降解菌的耐盐性驯化：将上述纯种石油降解菌菌挑取到一个石油降解菌富集培养基中于150r/min，28℃的条件下震荡培养7天，得到单菌株石油降解菌富集液。待菌株进入对数增长期(上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6)时，以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，得到耐盐石油降解菌富集液；为得到耐盐的厌氧氨氧化菌，在氩气保护下将上述纯种厌氧氨氧化菌菌挑取到一个厌氧氨氧化菌富集培养基中于150r/min，28℃的条件下密封震荡培养7天，得到单菌株厌氧氨氧化菌富集液。待菌株进入对数增长期(上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6)时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，得到耐盐厌氧氨氧化菌富集液；为得到耐盐的反硝化细菌在氩气保护下将上述纯种反硝化细菌菌挑取到一个反硝化细菌富集培养基中于150r/min，28℃的条件下密封震荡培养7天，得到单菌株反硝化细菌富集液。待菌株进入对数增长期(上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6)时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，得到耐盐反硝化细菌富集液。
(4)高效降解菌的耐冷性驯化：将上述筛选出的耐盐石油降解菌以5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的油降解菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min的条件下震荡培养7天，得到耐盐耐冷石油降解菌富集液；在氩气保护下将上述筛选出的耐盐厌氧氨氧化菌以5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的厌氧氨氧化菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min的条件下密封震荡培养7天，得到耐盐耐冷厌氧氨氧化菌富集液；为得到耐冷反硝化细菌在氩气保护下将上述筛选出的耐盐反硝化细菌以5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的反硝化细菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min的条件下密封震荡培养7天，得到耐盐耐冷反硝化细菌富集液；
(5)以生物炭球为载体的耐盐耐冷高效降解菌固定化方法：在氩气保护下按4：1.5：4.5的比例将上述耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌富集液、耐盐耐冷反硝化细菌富集液和耐盐耐冷石油降解菌的富集液混合，得到复合菌液；将上述生物炭球置于上述复合菌液中密封浸泡4天，得到挂膜生物炭球；取50ml的上述复合菌液经8000r/min离心15min,去除上清液后，在氩气保护下用无菌水清洗3次后得到湿菌体；将2％海藻酸钠与12％聚乙烯醇的水溶液与上述湿菌体按体积比2：1的比例混合得到包埋混合液；再将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。
将挂膜生物炭球置于受污辽河口湿地水体中在温度为15℃的条件下进行震荡处理，包埋菌球与受污界面充分接触，震荡时间为10d，10d后NH4-N的去除率为48.27％，TN的去除率为39.34％，石油烃的去除率为43.95％。该方法对氨氮和石油烃具有很好的去除效果。
将耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球置于受污辽河口湿地水体中在温度为15℃的条件下进行震荡处理，包埋菌球与受污界面充分接触，震荡时间为10d，10d后NH4-N的去除率为76.42％，TN的去除率为68.83％，石油烃的去除率为59.35％。该方法对氨氮和石油烃具有很好的去除效果。
实施例2
对受到氨氮和石油烃污染某河流进行采样，通过检测NH4-N浓度达5.6mg/L，NO2 —N浓度为1.9mg/L，NO3 —N的浓度为3.8mg/L，TN浓度为16.6mg/L，石油烃的浓度为2.1mg/L控制盐度为10‰，采用以固定化耐盐耐冷混合菌种联合降解氨氮和石油烃的方法在温度为15℃的条件下进行震荡处理，包括步骤如下：
(1)生物炭球的制备：生物炭球的制备：称取芦苇秸秆100g，用去离子水洗净，烘干至恒重，用植物秸秆粉碎机将芦苇秸秆粉碎后过20目筛，得到芦苇秸秆粉末，经过马弗炉烧制成为生物炭。马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min,温度为400℃和保温时间180min；为增加生物炭的比表面积，即为增加生物炭的孔隙度，去除生物炭内的灰分，采用物化联合手段对上述生物炭进行表面改性：向烧制好的10g生物炭中加入0.1mol/L的硝酸溶液，充分混匀，在室温200r/min的条件下在磁力搅拌器下搅拌24h，用去离子水清洗生物炭至中性，使得生物炭得到化学改性。将化学改性后的生物炭置于微波清洗机中以频率40Hz的微波震荡60min，进一步去除灰分和增加其孔隙度。物化改性后的生物炭经过滤后置于80℃干燥箱中恒温干燥8h，烘干后制成物化生物炭置于避光保存；基于对辽河口湿地原生态环境的保护和经济性考虑，采用辽河本地粘土作为原材料。将110g辽河口湿地粘土在80℃的恒温干燥箱中干燥8h，过100目筛，得到粘土粉末,置于棕色瓶中备用；将硅酸钠和碳酸氢钠分别按粘土质量比为3％和1.5％用去离子水溶解混匀，将物化改性的生物炭烘干后与粘土粉末按0.5:10的例混合加入到硅酸钠和碳酸氢钠混合液中，用制球机制成直径为0.8cm-1.0cm的球粒后置于80℃的恒温干燥箱中干燥8h，得到干燥炭球颗粒；将制好的生物炭球置于马弗炉在升温速度10℃/min,温度为400℃和保温时间180min的条件下烧制。
(2)高效降解菌的筛选：为得到高效石油降解菌，称取干重20g的受石油污染沉积物，加入到盛有100mL石油降解菌富集培养基的250mL锥形瓶中，于180r/min，30℃的条件下震荡培养7天后吸取10mL至另一个石油降解菌富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，得到石油降解菌富集液；为得到厌氧氨氧化菌，称取20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL厌氧氨氧化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于180r/min，30℃的条件下密封震荡培养7天，得到厌氧氨氧化菌富集液；为得到反硝化细菌，称取20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL反硝化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于180r/min，30℃的条件下密封震荡培养7天，得到反硝化细菌富集液。为得到单一的高效降解菌将得到的高效降解菌进行分离纯化，将上述石油降解菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于30℃培养3天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种石油降解菌；其次将上述厌氧氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于30℃条件下密封培养3天，待菌落长成后，在氩气保护下挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种厌氧氨氧化菌；最后将上述反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于30℃条件下密封培养3天，待菌落长成后，在氩气保护下挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种反硝化细菌氨氧化菌。
(3)高效降解菌的耐盐性驯化：将上述纯种石油降解菌菌挑取到一个石油降解菌富集培养基中于180r/min，30℃的条件下震荡培养7天，得到单菌株石油降解菌富集液。待菌株进入对数增长期(上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6)时，以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，得到耐盐石油降解菌富集液；为得到耐盐的厌氧氨氧化菌，在氩气保护下将上述纯种厌氧氨氧化菌菌挑取到一个厌氧氨氧化菌富集培养基中于180r/min，30℃的条件下密封震荡培养7天，得到单菌株厌氧氨氧化菌富集液。待菌株进入对数增长期(上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6)时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，得到耐盐厌氧氨氧化菌富集液；为得到耐盐的反硝化细菌在氩气保护下将上述纯种反硝化细菌菌挑取到一个反硝化细菌富集培养基中于180r/min，30℃的条件下密封震荡培养7天，得到单菌株反硝化细菌富集液。待菌株进入对数增长期(上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6)时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，得到耐盐反硝化细菌富集液。
(4)高效降解菌的耐冷性驯化：将上述筛选出的耐盐石油降解菌以5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的油降解菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，170r/min的条件下震荡培养7天，得到耐盐耐冷石油降解菌富集液；在氩气保护下将上述筛选出的耐盐厌氧氨氧化菌以5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的厌氧氨氧化菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，170r/min的条件下密封震荡培养7天，得到耐盐耐冷厌氧氨氧化菌富集液；为得到耐冷反硝化细菌在氩气保护下将上述筛选出的耐盐反硝化细菌以5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的反硝化细菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min的条件下密封震荡培养7天，得到耐盐耐冷反硝化细菌富集液；
(5)以生物炭球为载体的耐盐耐冷高效降解菌固定化方法：在氩气保护下按4：1.5：4.5的比例将上述耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌富集液、耐盐耐冷反硝化细菌富集液和耐盐耐冷石油降解菌的富集液混合，得到复合菌液；将上述生物炭球置于上述复合菌液中密封浸泡5天，得到挂膜生物炭球；取50ml的上述复合菌液经5000r/min离心25min,去除上清液后，在氩气保护下用无菌水清洗若4次后得到湿菌体；将2％海藻酸钠与12％聚乙烯醇的水溶液与上述湿菌体按体积比3：1的比例混合得到包埋混合液；再将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。
将挂膜生物炭球置于受污水体中在温度为10℃的条件下进行震荡处理，包埋菌球与受污界面充分接触，震荡时间为10d，10d后NH4-N的去除率为62.63％，TN的去除率为59.63％，石油烃的去除率为35.24％。具有很好的去除效果。
将固定化菌球置于受污水体中在温度为10℃的条件下进行震荡处理，包埋菌球与受污界面充分接触，震荡时间为10d，10d后NH4-N的去除率为83.54％，TN的去除率为79.34％，石油烃的去除率为65.28％。具有很好的去除效果。
显然本发明材料来源广泛，方法简单，而且易于产业化，成本低，利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷复合菌种，可以广泛地应用于低温高盐条件氨氮和石油烃污染水体的净化，微生物量大。对环境也不会造成二次污染，因此具有良好的应用前景。
Claims (11)
1.一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法，首先分别筛选出高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌，然后对上述厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌进行耐盐和耐冷性驯化分别得到耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌、耐盐耐冷反硝化细菌和耐盐耐冷石油降解菌，又将生物炭球置于耐盐耐冷高效复合降解菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球与耐盐耐冷高效降解菌包埋复合液混合，最后将复合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。
2.如权利要求1所述的高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌的筛选方法，包括如下步骤：
(1)石油降解菌富集培养与分离：称取干重10g-20g的受石油污染沉积物，加入到盛有100mL石油降解菌富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个石油降解菌富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，得到石油降解菌富集液；将上述石油降解菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养3-7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种石油降解菌；上述石油降解菌富集培养基：柴油10g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，NaCl 2g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 1g，MnSO4 0.01g，FeSO4 0.04g，蒸馏水1000mL，5％Na2CO3调节pH＝7.2；
(2)厌氧氨氧化菌富集培养：称取10g-20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL厌氧氨氧化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，得到厌氧氨氧化菌富集液；将上述厌氧氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃-30℃条件下密封培养3-7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种厌氧氨氧化菌；上述厌氧氨氧化富集培养基：NH4HCO3 0.044g，NaNO2 0.017g，KH2PO4 0.057g，MgCl2·6H2O 0.165g，CaCl2·2H2O0.3g，NaHCO3 0.105g，EDTA 0.02g，FeCl2·4H2O 0.005g，ZnCl2 0.255mg，CoCl2·6H2O 0.3mg，MnCl2·4H2O 1.238mg，CuCl2·2H2O 0.213mg，NiCl2·6H2O 0.238mg，H3BO3 0.014mg，Na2MO4·2H2O 0.304mg，NaWO4·2H2O 0.063mg，NaSeO3 0.061g，蒸馏水1000mL，调节p H值为7.0～7.2；
(3)反硝化细菌富集培养：称取10g-20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL反硝化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，得到反硝化细菌富集液；将上述反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃-30℃条件下密封培养3-7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种纯种反硝化细菌氨氧化菌；上述反硝化富集培养基：KNO3 1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 1.0g，1％溴百里酚蓝酒精溶液(BTB)5mL，KH2PO4 1.0g，CaCl2·2H2O 8.5g，柠檬酸钠8.5g，蒸馏水1000mL，调节pH值为7.0～7.2；
上述固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸提物5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节p H值为7.0～7.2。
3.如权利要求1所述的厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌进行耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：
(1)石油降解菌耐盐耐冷性驯化：将上述分离得到多株纯种石油降解菌菌挑取到一个石油降解菌富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到厌氧氨氧化菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对石油烃降解效果好的石油降解菌即为耐盐石油降解菌；将上述筛选出的耐盐石油降解菌以富集液与富集培养基5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的石油降解菌富集培养基中富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对石油烃降解效果好的石油降解菌即为耐盐耐冷石油降解菌；
(2)厌氧氨氧化菌耐盐耐冷性驯化：在氩气保护下将上述分离得到多株纯种厌氧氨氧化菌挑取到一个厌氧氨氧化菌富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，分别得到厌氧氨氧化菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，筛选出对氨氮降解效果好的厌氧氨氧化细菌即为耐盐厌氧氨氧化细菌；在氩气保护下将上述筛选出的耐盐厌氧氨氧化菌厌氧氨氧化菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下密封震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的厌氧氨氧化细菌即为耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌；
(3)反硝化细菌耐盐耐冷性驯化：在氩气保护下将上述分离得到多株纯种反硝化细菌菌挑取到一个反硝化细菌富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下密封震荡培养数天，分别得到反硝化细菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，在氩气保护下以5％的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对硝态氮降解效果好的反硝化细菌即为耐盐反硝化细菌；在氩气保护下将上述筛选出的耐盐反硝化细菌以富集液与富集培养基5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的反硝化细菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下密封震荡培养数天，筛选出对硝态氮降解效果好的反硝化细菌即为耐盐耐冷反硝化细菌。
4.如权利要求1所述生物炭球挂膜，其特征在于生物炭球的挂膜方法为：将生物炭球置于上述耐盐耐冷高效降解菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球，上述耐盐耐冷高效降解菌富集液在氩气保护下将上述耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌富集液、耐盐耐冷反硝化细菌富集液和耐盐耐冷石油降解菌的富集液按4：1.5：4.5的比例混合而成的。
5.如权利要求1所述耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球：将上述挂膜生物炭球与耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球，上述的耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液是2％海藻酸钠与12％聚乙烯醇的水溶液与湿菌体按体积比(2-5)：1的比例混合得到包埋混合液，上述湿菌体是取50ml-100ml的上述耐盐耐冷高效降解菌富集液经5000-8000r/min离心10-15min,去除上清液后，在氩气保护下用无菌水清洗2-3次后得到的。
6.如权利要求1或4所述的生物炭球的制备方法，包括如下步骤：
(1)取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛，得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；
(2)将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性数天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将上述的化学改性生物炭置于频率40Hz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；
(3)再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；
(4)将上述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为(0.5-1)：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，上述硅酸钠与粘土质量比为3％，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5％。
7.如权利要求6所述的生物炭球的制备方法，其特征在于上述马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min,温度为300℃-400℃和保温时间180min，恒温干燥是在60℃-80℃条件下干燥8h-12h。
8.权利要求3所述的高效降解菌的耐盐耐冷性驯化方法，其特征在于上述耐盐厌氧氨氧化细菌、耐盐反硝化细菌和耐盐石油降解菌应用于高盐条件污染水体净化，耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌、耐盐反硝化细菌和耐盐石油降解菌应用于低温高盐条件污染水体净化。
9.权利要求4所述生物炭球挂膜方法，其特征是上述复合菌液应用于低温高盐条件受石油烃和氨氮污染水体的净化。
10.权利要求5所述的耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球，其特征在于上述挂膜生物炭球应用于低温高盐条件受低浓度石油烃和氨氮污染水体净化，复合菌种固定化生物炭球应用于低温高盐条件受高浓度石油烃和氨氮污染水体净化。
11.如权利要求1所述的一种固定化耐盐耐冷混合菌种联合降解氨氮和石油烃的方法，其特征在于上述的厌氧氨氧化细菌是Kuenenia.Anammoxidans；上述反硝化细菌是Ochrobactrum.sp；上述石油降解菌Flavobacterium mizutaii。
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