CN111542304B - 可用于使头发和皮肤着色的ppd衍生物 - Google Patents

Abstract

提供了式I或II的化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物：其中R1至R3、R13和R14是如本文定义的。本文还公开了使用在合适的组合物中的式I或II的化合物(或其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物)使头发染色或(临时)文身皮肤的方法。

Description

可用于使头发和皮肤着色的PPD衍生物

技术领域

本发明涉及可用于向受试者的皮肤或头发提供着色的化合物和含有所述化合物的组合物。本文公开的化合物在受试者中较不容易引起过敏应答或其他免疫应答。

背景技术

头发和临时皮肤着色是当今最广泛使用的美容处理之一。这些处理中使用的许多染料都含有不稳定的二/三官能芳香族胺，这些胺经受氧化聚合以提供期望的色素沉着。然而，深色染料中的主要组分——对苯二胺(PPD)或这种二胺的氧化和酶促变体，可能是刺激物和非常强效的接触性过敏原。这些潜在威胁生命的过敏可能表现为局部或泛发性接触过敏，其中有时形成严重的水疱、痒和面部肿胀，并可能发展全身性反应，诸如淋巴结病、哮喘或高铁血红蛋白血症以及发烧。

对苯二胺在2006年被提名为“年度过敏原”。它是尤其用于染发剂和非永久性文身中的常见的含胺化合物。PPD可以容易地渗透通过皮肤，在这里它可以损坏有活力的表皮的细胞并与皮肤中的免疫细胞相互作用。对于通过皮肤中的代谢过程或通过非电离辐射(紫外光/可见光/红外光)产生的PPD衍生物也是如此。另外，PPD及其衍生物与角质层中的角蛋白蛋白质的相互作用可形成储库(depot)，延长PPD到皮肤更深处的释放，并使特别是对PPD的过敏反应成为危险且持久的病症。

如下讨论的，PPD(32A)可以使用过氧化氢容易地被氧化，从而产生几种产物。从PPD氧化中分离出的主要产物是PPD的三聚体形式，通常称为班德罗斯基(Bandrowski)碱(BB,32)。除了BB之外，还分离了少量的对硝基苯胺(33)和4,4'-二氨基偶氮苯(34)(图1)。

使用1％PPD溶液根据标准化美发斑贴测试系列(Chemotechnique)的我们自己的实验示出，当PPD包含在石蜡中(如供应的)时，可防止其受到氧化。即使在斑贴测试的2天之后也是如此，因为测试区域依然是无色的。我们的质谱测量已经示出，即使在空气中几天后，石蜡中的PPD斑贴测试配制品也不会在这种配制品中显示出任何班德罗斯基碱或其他氧化/代谢衍生物——仅存在母体化合物PPD。然而，致敏患者对这种PPD配制品产生明确的局部接触性皮炎反应。这表明通过半抗原化或由于其自身(可能是通过Toll样受体激活)，PPD本身是主要过敏原。因此，施加无法穿越皮肤屏障且不含有任何PPD的有色聚合物可潜在地避免染发剂和临时文身对皮肤和免疫细胞造成的严重有毒和致过敏作用。因此，仍然需要避免此类过敏应答并且可能适合用于对常规着色材料表现出敏感性的受试者的头发和临时皮肤着色。

附图说明

图1描绘了PPD与过氧化氢形成许多反应产物的反应。

图2：在杜尔贝科氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)介质中分析之后，对苯二胺(PPD；m/z 109.20-92.0)、N-乙酰基-对苯二胺(MAPPD；m/z 151.40-92.0)、班德罗斯基碱(BB；m/z 319.23-303.30)、N,N'-二乙酰基-对苯二胺(DAPPD；m/z 193.20-109.10)和内标物2-氨基-5-硝基吡啶(ANP；m/z 140.20-94.20)的多重反应监测色谱图。

图3：在DPBS介质中分析之后，N-(4-氨基苯基)苯-1,4-二胺(二聚体；m/z 198.20-182.0)、N-[4-(4-氨基苯胺基)苯基]乙酰胺(单乙酰基二聚体；m/z 242.30-142.20)、N,N'-[氮烷二基二(1,4-亚苯基)]二乙酰胺(二乙酰基二聚体；m/z 284.30-107.0)和内标物2-氨基-5-硝基吡啶(ANP；m/z 140.20-94.20)的多重反应监测色谱图。

图4：在实验结束时，用于鉴定接收者DPBS介质中的PPD(m/z[M+H]⁺109.2)，以及代谢物MAPPD(m/z[M+H]⁺151.4)、DAPPD(m/z[M+H]⁺193.2)和BB(m/z[M+H]⁺319.2)的LCMS谱。对比DPBS介质在相应m/z值下没有示出任何信号。

图5：在实验结束时，用于鉴定接收者DPBS介质中的PPD(m/z[M+H]⁺198.2)，以及代谢物：单乙酰基二聚体(m/z[M+H]⁺242.30)和二乙酰基二聚体(m/z[M+H]⁺284.30)的LCMS谱。对比DPBS介质在相应m/z值下没有示出任何信号。

图6：在37℃下温育72小时后，PPD及其类似物对HaCaT细胞的浓度依赖性细胞毒性。

图7：(a)PPD和相关代谢物(b)班德罗斯基碱、(c)二乙酰基-PPD和(d)单乙酰基-PPD的累积量分布图(n＝3)。

图8：并置了PPD衍生物及其代谢物(单乙酰基和二乙酰基)渗透(a.PPD衍生物1、b.PPD衍生物2、c.PPD衍生物3、d.PPD衍生物4)

图9：(a)PPD，ME PPD对比PPD衍生物1-4、6和15的累积量分布图的对比。未可检测到PPD衍生物5，因为它根本不渗透皮肤。

图10：(a)PPD和(b)PPD-1溶液(1％w/v，水中)在溶液中不同深度处的拉曼光谱。

图11：PPD-1溶液(1％w/v，水中)在皮肤器官型培养中在深度(a)0.5至30.5μm和(b)36.5至40.5μm处的拉曼光谱。

图12：在20min和24hr温育处的直接半胱氨酸(1:10)/赖氨酸(1:50)平均肽反应性。推荐的平均肽消耗阈值(6.38％、22.62％、42.47％、100％)，注意：对于20min DPRA处的致敏电位没有分类。一式三份进行实验。

图13描绘了在初步ELISA研究中由PPD衍生物和商业染料引起的相对IL8释放。

图14和15描绘了细胞因子标志物(MHC-I、ILT3、CD86和CD54)分析的结果。

具体实施方式

本发明通过使用保留染色效果(有或没有氧化)但避免了与PPD和/或其氧化产物有关的致敏问题的PPD类似物克服了以上确定的问题。即，当用于使头发染色或使皮肤着色的目的时，下文公开的化合物可能不会引起受试者的过敏或其他免疫反应。

因此，根据本发明的第一方面,提供了式I的化合物：

其中：

R¹和R²独立地表示H或C_5-10烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(该基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^4a、NR^4bR^4c、芳基和Het¹)；

Cy¹(该Cy¹基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^5a、S(O)_qR^5b、S(O)₂NR^5cR^5d、NR^5eS(O)₂R^5f、NR^5gR^5h)；

Het^a(该Het^a基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^6a、S(O)_qR^6b、S(O)₂NR^6cR^6d、NR^6eS(O)₂R^6f、NR^6gR^6h)；以及

OR^7a、S(O)_qR^7b、S(O)₂NR^7cR^7d、NR^7eS(O)₂R^7f和NR^7gR^7h，

R³表示H、C_1-10烷基、OC_1-10烷基、C(O)OC_1-10烷基或OC(O)C_1-10烷基，其中后四个基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(该基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^8a、NR^8bR^8c、芳基和Het²)；

Cy²(该Cy²基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^9a、S(O)_qR^9b、S(O)₂NR^9cR^9d、NR^9eS(O)₂R^9f、NR^9gR^9h)；

Het^b(该Het^b基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^10a、S(O)_qR^10b、S(O)₂NR^10cR^10d、NR^10eS(O)₂R^10f、NR^10gR^10h)；以及

OR^11a、S(O)_qR^11b、S(O)₂NR^11cR^11d、NR^11eS(O)₂R^11f和NR^11gR^11h，

Het¹和Het²在每次出现时独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团，该杂环基团可包含一个、两个或三个环，并且可被选自OR^12a和C_1-10烷基的一个或多个取代基取代，其中后一基团是未取代的；

Cy¹和Cy²在每次出现时独立地表示3-元至6-元芳香族完全饱和的或部分不饱和的碳环；

R^4a至R^4c、R^5a至R^5h、R^6a至R^6h、R^7a至R^7h、R^8a至R^8c、R^9a至R^9h、R^10a至R^10h、R^11a至R^11h在每次出现时独立地表示H或C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自C_1-6烷基、OR^12b的一个或多个取代基取代)，或者R^5-7c和R^5-7d、R^9-11c和R^9-11d、R^5-7g和R^5-7h、R^9-11g和R^9-11h与它们所附接的氮原子一起表示3-元至14-元杂环，该杂环可以是芳香族完全饱和的或部分不饱和的并且可附加地含有选自O、S和N的一个或多个杂原子，该杂环任选地被选自卤素、硝基、CN和C_1-6烷基的一个或多个取代基取代；

Het^a和Het^b独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团；

R^12a-b在每次出现时独立地表示H或C_1-4烷基，

n表示0至4，或其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物，前提是当R¹和R²是H，并且n是0、1或2时，R³不是H。

在根据本发明的第二方面，提供了使头发染色或施加临时文身的方法，该方法包括将包含式I的化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物的组合物施加到受试者的头发或皮肤上，其中式I的化合物具有以下结构：

其中：

R¹和R²独立地表示H或C_5-10烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(该基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^4a、NR^4bR^4c、芳基和Het¹)；

Cy¹(该Cy¹基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^5a、S(O)_qR^5b、S(O)₂NR^5cR^5d、NR^5eS(O)₂R^5f、NR^5gR^5h)；

Het^a(该Het^a基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^6a、S(O)_qR^6b、S(O)₂NR^6cR^6d、NR^6eS(O)₂R^6f、NR^6gR^6h)；以及

OR^7a、S(O)_qR^7b、S(O)₂NR^7cR^7d、NR^7eS(O)₂R^7f和NR^7gR^7h，

R³表示H、C_1-10烷基、OC_1-10烷基、C(O)OC_1-10烷基或OC(O)C_1-10烷基，其中后四个基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(该基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^8a、NR^8bR^8c、芳基和Het²)；

Cy²(该Cy²基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^9a、S(O)_qR^9b、S(O)₂NR^9cR^9d、NR^9eS(O)₂R^9f、NR^9gR^9h)；

Het^b(该Het^b基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^10a、S(O)_qR^10b、S(O)₂NR^10cR^10d、NR^10eS(O)₂R^10f、NR^10gR^10h)；以及

OR^11a、S(O)_qR^11b、S(O)₂NR^11cR^11d、NR^11eS(O)₂R^11f和NR^11gR^11h，

Het¹和Het²在每次出现时独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团，该杂环基团可包含一个、两个或三个环，并且可被选自OR^12a和C_1-10烷基的一个或多个取代基取代，其中后一基团是未取代的；

Cy¹和Cy²在每次出现时独立地表示3-元至6-元芳香族完全饱和的或部分不饱和的碳环；

R^4a至R^4c、R^5a至R^5h、R^6a至R^6h、R^7a至R^7h、R^8a至R^8c、R^9a至R^9h、R^10a至R^10h、R^11a至R^11h在每次出现时独立地表示H或C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自C_1-6烷基、OR^12b的一个或多个取代基取代)，或者R^5-7c和R^5-7d、R^9-11c和R^9-11d、R^5-7g和R^5-7h、R^9-11g和R^9-11h与它们所附接的氮原子一起表示3-元至14-元杂环，该杂环可以是芳香族完全饱和的或部分不饱和的并且可附加地含有选自O、S和N的一个或多个杂原子，该杂环任选地被选自卤素、硝基、CN和C_1-10烷基的一个或多个取代基取代；

Het^a和Het^b独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团；

R^12a-b在每次出现时独立地表示H或C_1-4烷基，

n表示0至4，或其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物，前提是当R¹和R²是H，并且n是0时，R³不是H。

本文(在本发明的任何方面或实施方式中)对式I的化合物的提及包括对此类化合物本身、此类化合物的互变异构体以及此类化合物的生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物的提及。

可以提及的生理学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。此类盐可以通过常规手段形成，例如通过使式I的化合物的游离酸或游离碱形式与一当量或多当量的适当的酸或碱任选地在溶剂中或在其中盐是不可溶的介质中反应，然后使用标准技术(例如在真空中，通过冻干或通过过滤)除去所述溶剂或所述介质。也可以通过例如使用合适的离子交换树脂将盐形式的式I的化合物的反离子与另一反离子交换来制备盐。

生理学上可接受的盐的实例包括从矿物酸和有机酸衍生的酸加成盐，和从诸如钠、镁或优选地钾和钙的金属衍生的盐。

酸加成盐的实例包括用以下形成的酸加成盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸和对甲苯磺酸)、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己烷氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙基磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖醛酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-L-苹果酸)、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、偏磷酸、甲烷磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一烯酸和戊酸。

盐的具体实例是以下盐，所述盐衍生自矿物酸，诸如盐酸、氢溴酸、磷酸，偏磷酸、硝酸和硫酸；衍生自有机酸，诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸；以及衍生自金属，诸如钠、镁或优选地钾和钙。

如以上提及的，式I还包括化合物及其盐的任何溶剂化物。优选的溶剂化物是通过将无毒药学上可接受的溶剂(以下称为溶剂化溶剂)的分子掺入本发明的化合物的固态结构(例如晶体结构)中而形成的溶剂化物。此类溶剂的实例包括水、醇(诸如乙醇、异丙醇和丁醇)和二甲亚砜。可以通过用溶剂或含有溶剂化溶剂的溶剂混合物使本发明的化合物重结晶来制备溶剂化物。在任何给定的实例中，可以通过使用众所周知的且标准的技术(诸如热重分析(TGE)、差示扫描量热法(DSC)和X射线晶体学)对化合物的晶体进行分析来确定溶剂化物是否已经形成。

溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，并且水合物的实例包括半水合物、一水合物和二水合物。

对于溶剂化物以及用于制造和表征它们的方法的更详细讨论，参见Bryn et al.,Solid-State Chemistry of Drugs,Second Edition,published by SSCI,Inc of WestLafayette,IN,USA,1999,ISBN 0-967-06710-3。

如本文所定义的式I的化合物的“氧化衍生物”是可以从暴露于氧化剂(诸如过氧化氢)的式I的化合物获得的化合物。应当理解，所得氧化化合物可以类似于PPD的氧化产物。

为了简洁起见，式I的化合物，以及此类化合物的生理学上可接受的盐、溶剂化物和氧化衍生物在下文中一起被称为“式I的化合物”。

式I的化合物可含有双键并且因此可作为围绕各个单独双键的E(异侧)和Z(同侧)几何异构体存在。所有此类异构体和其混合物都包括在本发明的范围内。

式I的化合物可作为区域异构体存在并且还可以展现出互变异构现象。所有互变异构形式和其混合物都包括在本发明的范围内。

式I的化合物可含有一个或多个不对称碳原子，并且因此可展现出光学和/或非对映异构现象。非对映异构体可以使用常规技术(例如色谱法或分步结晶)来分离。各种立体异构体可以通过使用常规的例如分步结晶或HPLC技术分离化合物的外消旋或其他混合物来分离。可替代地，期望的光学异构体可通过使适当的光学活性起始材料在不会引起外消旋或差向异构的条件下反应来制得(即‘手性源’法)，通过使适当的起始材料与可以随后在合适的阶段通过衍生化(即，拆分，包括动态拆分)除去的‘手性助剂’(例如与纯手性酸)反应，接着通过常规手段(诸如色谱法)分离非对映异构衍生物来制得，或通过与适当的手性试剂或手性催化剂均在技术人员已知的条件下反应来制得。所有立体异构体和其混合物都包括在本发明的范围内。

为了避免疑问，在本发明的上下文中，术语“染色”和“文身”指的是将美容处理施加到受试者的身体部分，诸如皮肤(文身的情况下)或头发(染色的情况下)。

如本文使用的，术语“受试者”是本领域中公认的，并且本文用于指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，并且最优选人。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，旨在包括成年和新生(在某些情况下)受试者，无论是雄性还是雌性。

应当理解，有效量的式I的化合物可用于进行受试者的染色和/或临时文身。术语“有效量”指的是化合物的量，其赋予经处理的受试者期望的着色效果(例如足以使头发染色或临时文身皮肤)。效果可以是客观的(即，通过一些测试或标志物可测量的)或主观的(即，受试者可以看到差异)。

当在本文中使用时，术语“卤素”包括对氟、氯、溴和碘的提及。

除非另外说明，否则当在本文中使用时，术语“芳基”包括C_6-14(诸如C_6-10)芳基基团。此类基团可以是单环、二环或三环的，并且具有在6与14之间的环碳原子，其中至少一个环是芳香族的。芳基基团的附接点可以经由环体系的任何原子。然而，当芳基基团是二环或三环的时，它们经由芳香族环连接到分子的其余部分上。C_6-14芳基基团包括苯基、萘基等，诸如1,2,3,4-四氢萘基、茚满基、茚基和芴基。可以提及的本发明的实施方式包括其中芳基为苯基的那些。

除非另外说明，否则术语“烷基”指的是非支链或支链的、环状的、饱和或不饱和的(如此形成，例如，烯基或炔基)烃基基团，其可以是取代的或未取代的(具有例如一个或多个卤素原子)。当术语“烷基”指的是非环状基团时，优选地是C1-10烷基，并且更优选地C1-6烷基(诸如乙基、丙基(例如正丙基或异丙基)、丁基(例如支链或非支链的丁基)、戊基，或更优选地甲基)。当术语“烷基”是环状基团时(其可以是指定基团“环烷基”的情况)，优选地是C3-12环烷基，并且更优选地C5-10(例如C5-7)环烷基。

当在本文中使用时，术语“杂芳基”指的是含有优选地选自N、O和S的一个或多个杂原子(例如一个至四个杂原子)的芳香族基团(如此形成，例如，单环、二环或三环杂芳香族基团)。杂芳基基团包括具有5至14(例如10)个成员并且可以是单环、二环或三环的那些，前提是至少一个环是芳香族的。然而，当杂芳基基团是二环或三环的时，它们经由芳香族环连接到分子的其余部分上。可以提及的杂环基团包括苯并噻二唑基(包括2,1,3-苯并噻二唑基)、异硫代苯并二氢吡喃基(并且更优选地，吖啶基)、苯并咪唑基、苯并二噁烷基、苯并二氧杂环庚烯基、苯并间二氧杂环戊烯基(包括1,3-苯并间二氧杂环戊烯基)、苯并呋喃基、苯并呋吖基、苯并噻唑基、苯并噁二唑基(包括2,1,3-苯并噁二唑基)、苯并噁嗪基(包括3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪基)、苯并噁唑基、苯并吗啉基、苯并硒二唑基(包括2,1,3-苯并硒二唑基)、苯并噻吩基、咔唑基、苯并二氢吡喃基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吲唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基(包括1,6-萘啶基，或优选地，1,5-萘啶基和1,8-萘啶基)、噁二唑基(包括1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基和1,3,4-噁二唑基)、噁唑基、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹嗪基、喹喔啉基、四氢异喹啉基(包括1,2,3,4-四氢异喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基)、四氢喹啉基(包括1,2,3,4-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢喹啉基)、四唑基、噻二唑基(包括1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基和1,3,4-噻二唑基)、噻唑基、硫代苯并二氢吡喃基、硫代乙氧苯基、噻吩基、三唑基(包括1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基和1,3,4-三唑基)等。杂芳基基团上的取代基在适当时可位于包括杂原子的环体系中的任何原子上。杂芳基基团的附接点可以经由包括(在适当时)杂原子(诸如氮原子)的环体系中的任何原子、或可以作为环体系的一部分存在的任何稠合碳环上的原子。杂芳基基团还可以呈N-或S-氧化形式。特别优选的杂芳基基团包括吡啶基、吡咯基、喹啉基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、异噻唑基、咪唑基、嘧啶基、吲哚基、吡嗪基、吲唑基、嘧啶基、硫代乙氧苯基、苯硫基、吡喃基、咔唑基、吖啶基、喹啉基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、噌啉基和蝶啶基。特别优选的杂芳基基团包括单环杂芳基基团。

在某些实施方式中，本文可以提及的式I的化合物包括其中R¹和R²中的至少一个不是H的化合物。

在本文可以提及的式I的实施方式中：

(a)R¹和R²可独立地表示H或C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基选自C_1-3烷基、Cy¹(该Cy¹基团是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^5a的一个或多个取代基取代)、Het^a(该Het^a基团是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^6a的一个或多个取代基取代)、和OR^7a(例如R¹和R²表示H或C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被苯环取代，该苯环是未取代的或被选自硝基、甲基、OH和OCH₃的一个或多个取代基取代，任选地其中R²表示H)；

(b)R³可表示H、C_1-6烷基、O-C_1-6烷基或C(O)OC_1-6烷基，其中后两个基团是未取代的或被选自C_1-3烷基的一个或多个取代基取代；

(c)Cy¹当存在时独立地表示苯环。

(d)R^4a至R^4c、R^5a至R^5h、R^6a至R^6h、R^7a至R^7h、R^8a至R^8c、R^9a至R^9h、R^10a至R^10h、R^11a至R^11h当存在时在每次出现时独立地表示H或C_1-6烷基；

(e)n表示1至3。

在式I的另外的实施方式中：

(a)R¹和R²独立地表示H或C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被苯环取代，该苯环是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^5a的一个或多个取代基取代，或者

R¹可表示C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基选自C_1-3烷基、Cy¹(该Cy¹基团是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^5a的一个或多个取代基取代)、Het^a(该Het^a基团是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^6a的一个或多个取代基取代)和OR^7a，并且

R²可表示H或C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基选自C_1-3烷基、Cy¹(该Cy¹基团是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^5a的一个或多个取代基取代)、Het^a(该Het^a基团是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^6a的一个或多个取代基取代)和OR^7a；

(b)n表示0至3。

本身可以提及的其他式I的化合物包括下文所述实例的化合物。因此，可以提及的本发明的实施方式包括其中式I的化合物是选自以下列表的化合物的那些：

(i)4-氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺；

(ii)[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯；

(iii)4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺；

(iv)4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺；

(v)N¹-[4-(4-甲苯基氨基甲基)苯基]-N⁴-(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺；

(vi)N⁴-[(4-硝基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-硝基苯基)甲基氨基]苯基]-苯-1,4-二胺；

(vii)N⁴-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-乙氧基苯基)甲基氨基]-苯基]苯-1,4-二胺；

(viii)N⁴-(对甲苯基甲基)-N¹-[4-(对甲苯基甲基氨基)苯基]苯-1,4-二胺；以及

(ix)4-[[4-[4-[(4-羟基苯基)甲基氨基]苯胺基]苯胺基]甲基]苯酚。

类似地，可以在上文所述的方法中使用的式I的化合物可以包括其中式I的化合物是选自以下列表的化合物的那些：

(a)N¹,N⁴-双(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺；(b)4-氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺；

(c)[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯；

(d)4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺；

(e)4,4′-双[(4-氨基苯基)氨基]二苯胺；

(f)4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺；

(g)N¹-[4-(4-甲苯基氨基甲基)苯基]-N⁴-(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺；

(h)N⁴-[(4-硝基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-硝基苯基)甲基氨基]苯基]-苯-1,4-二胺；

(i)N⁴-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-乙氧基苯基)甲基氨基]-苯基]苯-1,4-二胺；

(j)N⁴-(对甲苯基甲基)-N¹-[4-(对甲苯基甲基氨基)苯基]苯-1,4-二胺；以及

(k)4-[[4-[4-[(4-羟基苯基)甲基氨基]苯胺基]苯胺基]甲基]苯酚。

类似地，关于方法本文可以提及的式I的化合物可以包括其中式I的化合物是选自以下列表的化合物的那些：

(a)4,4′-双[(4-氨基苯基)氨基]二苯胺；

(b)4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺；以及

(c)N¹-[4-(4-甲苯基氨基甲基)苯基]-N⁴-(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺。

本身或关于方法本文可以提及的式I的特定化合物是[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯。

本发明的额外的化合物可以具有不同的结构，同时仍然提供将在本文更详细讨论的益处。因此，根据本发明的第三方面，提供了式II的化合物：

其中：

R¹³表示H或C_6-10烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(该基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^15a、NR^15bR^15c、芳基和Het³)；

Cy³(该Cy³基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^16a、S(O)_qR^16b、S(O)₂NR^16cR^16d、NR^16eS(O)₂R^16f、NR^16gR^16h)；

Het^c(该Het^c基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^17a、S(O)_qR^17b、S(O)₂NR^17cR^17d、NR^17eS(O)₂R^17f、NR^17gR^17h)；以及

OR^18a、S(O)_qR^18b、S(O)₂NR^18cR^18d、NR^18eS(O)₂R^18f和NR^18gR^18h，

R¹⁴表示H、C_1-10烷基、OC_1-10烷基、C(O)OC_1-10烷基或OC(O)C_1-10烷基，其中后四个基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(所述基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^19a、NR^19bR^19c、芳基和Het⁴)；

Cy⁴(所述Cy⁴基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^20a、S(O)_qR^20b、S(O)₂NR^20cR^20d、NR^20eS(O)₂R^20f、NR^20gR^20h)；

Het^d(该Het^d基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^21a、S(O)_qR^21b、S(O)₂NR^21cR^21d、NR^21eS(O)₂R^21f、NR^21gR^21h)；以及

OR^22a、S(O)_qR^22b、S(O)₂NR^22cR^22d、NR^22eS(O)₂R^22f和NR^22gR^22h，

Het³和Het⁴在每次出现时独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团，该杂环基团可包含一个、两个或三个环，并且可被选自OR^23a和C_1-10烷基的一个或多个取代基取代，其中后一基团是未取代的；

Cy³和Cy⁴在每次出现时独立地表示3-元至6-元完全饱和的或部分不饱和的碳环；

R^15a至R^15c、R^16a至R^16h、R^17a至R^17h、R^18a至R^18h、R^19a至R^19c、R^20a至R^20h、R^21a至R^21h、R^22a至R^22h在每次出现时独立地表示H或C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自C_1-6烷基、OR^23b的一个或多个取代基取代)，或者R^16-18c和R^16-18d、R^20-22c和R^20-22d、R^16-18g和R^16-18h、R^20-22g和R^20-22h与它们所附接的氮原子一起表示3-元至14-元杂环，该杂环可以是芳香族完全饱和的或部分不饱和的并且可附加地含有选自O、S和N的一个或多个杂原子，该杂环任选地被选自卤素、硝基、CN和C_1-6烷基的一个或多个取代基取代；

Het^c和Het^d独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团；

R^23a-b在每次出现时独立地表示H或C_1-4烷基或其氧化衍生物，前提是当R¹³是H时，R¹⁴不是正己基。

在根据本发明的第四方面，提供了使头发染色或施加临时文身的方法，该方法包括将包含式II的化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物的组合物施加到受试者的头发或皮肤上，其中式II的化合物具有以下结构：

其中：

R¹³表示H或C_6-10烷基，其中后一基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(该基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^15a、NR^15bR^15c、芳基和Het³)；

Cy³(该Cy³基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^16a、S(O)_qR^16b、S(O)₂NR^16cR^16d、NR^16eS(O)₂R^16f、NR^16gR^16h)；

Het^c(该Het^c基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^17a、S(O)_qR^17b、S(O)₂NR^17cR^17d、NR^17eS(O)₂R^17f、NR^17gR^17h)；以及

OR^18a、S(O)_qR^18b、S(O)₂NR^18cR^18d、NR^18eS(O)₂R^18f和NR^18gR^18h，

R¹⁴表示H、C_1-10烷基、OC_1-10烷基、C(O)OC_1-10烷基或OC(O)C_1-10烷基，其中后四个基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自：

C_1-10烷基(所述基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自OH、硝基、CN、OR^19a、NR^19bR^19c、芳基和Het⁴)；

Cy⁴(所述Cy⁴基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-6烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)，以及OR^20a、S(O)_qR^20b、S(O)₂NR^20cR^20d、NR^20eS(O)₂R^20f、NR^20gR^20h)；

Het^d(该Het^d基团是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基选自硝基、CN、C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自OH、═O、卤素、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的一个或多个取代基取代的)、OR^21a、S(O)_qR^21b、S(O)₂NR^21cR^21d、NR^21eS(O)₂R^21f、NR^21gR^21h)；以及

OR^22a、S(O)_qR^22b、S(O)₂NR^22cR^22d、NR^22eS(O)₂R^22f和NR^22gR^22h，

Het³和Het⁴在每次出现时独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团，该杂环基团可包含一个、两个或三个环，并且可被选自OR^23a和C_1-10烷基的一个或多个取代基取代，其中后一基团是未取代的；

Cy³和Cy⁴在每次出现时独立地表示3-元至6-元完全饱和的或部分不饱和的碳环；

R^15a至R^15c、R^16a至R^16h、R^17a至R^17h、R^18a至R^18h、R^19a至R^19c、R^20a至R^20h、R^21a至R^21h、R^22a至R^22h在每次出现时独立地表示H或C_1-10烷基(其中后一基团是未取代的或被选自C_1-6烷基、OR^23b的一个或多个取代基取代)，或者R^16-18c和R^16-18d、R^20-22c和R^20-22d、R^16-18g和R^16-18h、R^20-22g和R^20-22h与它们所附接的氮原子一起表示3-元至14-元杂环，该杂环可以是芳香族完全饱和的或部分不饱和的并且可附加地含有选自O、S和N的一个或多个杂原子，该杂环任选地被选自卤素、硝基、CN和C_1-6烷基的一个或多个取代基取代；

Het^c和Het^d独立地表示含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的4-元至14-元杂环基团；

R^23a-b在每次出现时独立地表示H或C_1-4烷基，或其氧化衍生物。

本文(在本发明的任何方面或实施方式中)对式II的化合物的提及包括对此类化合物本身、此类化合物的互变异构体以及此类化合物的生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物的提及。

类似地，术语“生理学上可接受的盐和溶剂化物”和“氧化衍生物”采取与上文对于式I的化合物提供的定义相同的含义。

式II的化合物可含有双键并且因此可作为围绕各个单独双键的E(异侧)和Z(同侧)几何异构体存在。所有此类异构体和其混合物都包括在本发明的范围内。式II的化合物可作为区域异构体存在并且还可以展现出互变异构现象。所有互变异构形式和其混合物都包括在本发明的范围内。

式II的化合物可含有一个或多个不对称碳原子，并且因此可展现出光学和/或非对映异构现象。非对映异构体可以使用常规技术(例如色谱法或分步结晶)来分离。各种立体异构体可以通过使用常规的例如分步结晶或HPLC技术分离化合物的外消旋或其他混合物来分离。可替代地，期望的光学异构体可通过使适当的光学活性起始材料在不会引起外消旋或差向异构的条件下反应来制得(即‘手性源’法)，通过使适当的起始材料与可以随后在合适的阶段通过衍生化(即，拆分，包括动态拆分)除去的‘手性助剂’(例如与纯手性酸)反应，接着通过常规手段(诸如色谱法)分离非对映异构衍生物来制得，或通过与适当的手性试剂或手性催化剂均在技术人员已知的条件下反应来制得。所有立体异构体和其混合物都包括在本发明的范围内。

应当理解，有效量的式II的化合物可用于进行受试者的染色和/或临时文身。术语“有效量”指的是化合物的量，其赋予经处理的受试者期望的着色效果(例如足以使头发染色或临时文身皮肤)。效果可以是客观的(即，通过一些测试或标志物可测量的)或主观的(即，受试者可以看到差异)。

为了避免疑问，术语“卤素”、“芳基”、“烷基”、“环烷基”和“杂芳基”采取上文所述的含义。

在本文可以提及的式II的实施方式中：

(a)R¹³表示H或C_6-10烷基，其中后一基团是未取代的或被选自未取代的C_1-3烷基的一个或多个取代基取代；

(b)R¹⁴表示H、C_1-6烷基、OC_1-6烷基或C(O)OC_1-6烷基，其中后三个基团是未取代的或被选自C_1-3烷基的一个或多个取代基取代；

(c)其中R^15a至R^15c、R^16a至R^16h、R^17a至R^17h、R^18a至R^18h、R^19a至R^19c、R^20a至R^20h、R^21a至R^21h、R^22a至R^22h当存在时在每次出现时独立地表示H或C_1-6烷基。

可以提及的其他式II的化合物包括下文所述实例的化合物。因此，本身可以提及的本发明的实施方式包括其中式II的化合物是选自以下列表的化合物的那些：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；

(ii)己基-2,5-二氨基苯甲酸酯；以及

(iii)(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯。

本身本文可以提及的式II的具体化合物包括：

其中，式II的化合物选自以下列表：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；以及

(iii)己基-2,5-二氨基苯甲酸酯。

类似地，可以在上文所述的方法中使用的式II的化合物可以包括其中式II的化合物是选自以下列表的化合物的那些：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；

(ii)2-己氧基-1,4-二氨基苯；

(iii)己基-2,5-二氨基苯甲酸酯；以及

(iv)(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯。

与上述方法相关联的本文可以提及的式II的具体化合物包括：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；以及

(ii)(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯。

本身且关于方法本文可以提及的式II的化合物是己基-2,5-二氨基苯甲酸酯。

应当理解，式I和式II的化合物可以可用于使头发染色或(临时)文身皮肤的组合物中。因此，在本发明的第五方面，公开了用于使头发染色或文身皮肤的组合物，该组合物包含：

如以上定义的式I的化合物或如以上定义的式II的化合物；以及水。

在本发明的文身的上下文中，术语“临时”应理解为意指皮肤的临时着色，其可以通过洗涤(例如用肥皂洗涤文身)或通过在一段时间内表皮的自然脱落而完全或几乎完全除去。

在当前要求保护的发明的上下文中，“使头发染色”指的是施加含有式I或II的化合物的配制品以实现如此染色的头发的永久或半永久变色。尽管在本文所述一些实施方式中可以存在氧化材料，但是在不存在氧化材料以使头发金色/漂白和/或氧化式I和II的化合物的情况下也可以实现此效果。

应当理解，本文提及的化合物和组合物可以用于使头发永久染色。在这种情况下，效果基本上是永久的，直到头发长出来或被染成另一种颜色。

组合物可包含0.0001至20wt％的式I的化合物或式II的化合物，其中余量为水。应当理解，如下讨论的，其他组分可以形成组合物的一部分，因为典型地以相对于组合物的总重量范围为按重量计从约15％至约99％的量提供这种水。组合物的pH范围可以为约1.0至14.0，尽管更典型地，组合物的pH范围将为约3.0至约11.0。应当理解，本文特别地预期式I的化合物的组合、式II的化合物的组合以及式I和II的化合物的组合。为了避免疑问，对“式I的化合物”和“式II的化合物”的提及还涉及其生理学上可接受的盐或溶剂化物或氧化衍生物。

应当理解，本文讨论的组合物可以包含额外的组分，该额外的组分可以包括但不限于偶联剂、表面活性剂、额外的稀释剂/溶剂、增稠剂和碱化剂。

可在本文中使用可与PPD一起使用的任何合适的偶联剂，其中偶联剂占整个组合物的0.0001至20wt％。合适的偶联剂可以选自包括但不限于以下的组：苯酚、儿茶酚、间-氨基苯酚、间苯二胺等，其可以是未取代的，或在氨基基团或苯环上被烷基、羟基烷基、烷基氨基基团等取代的。合适的成色剂(coupler)包括3,4-亚甲基二氧基苯酚、3,4-亚甲基二氧基-1-[(β-羟基乙基)氨基]苯、1-甲氧基-2-氨基-4-[(β-羟基乙基)氨基]-苯、1-羟基-3-(二甲基氨基)苯、6-甲基-1-羟基-3[(β-羟基乙基)-氨基]苯、2,4-二氯-1-羟基-3-氨基苯、1-羟基-3-(二乙基氨基)-苯、1-羟基-2-甲基-3-氨基苯、2-氯-6-甲基-1-羟基-3-氨基-苯、1,3-二氨基苯、6-甲氧基-1,3-二氨基苯、6-羟基乙氧基-1,3-二氨基苯、6-甲氧基-5-乙基-1,3-二氨基苯、6-乙氧基-1,3-二氨基苯、1-双(β-羟基乙基)氨基-3-氨基苯、2-甲基-1,3-二氨基苯、6-甲氧基-1-氨基-3-[(β-羟基乙基)氨基]-苯、6-(β-氨基乙氧基)-1,3-二氨基苯、6-(β-羟基乙氧基)-1-氨基-3-(甲基氨基)苯、6-羧基甲氧基-1,3-二氨基-苯、6-乙氧基-1-双(β-羟基乙基)氨基-3-氨基苯、6-羟基乙基-1,3-二氨基苯、1-羟基-2-异丙基-5-甲基苯、1,3-二羟基苯、2-氯-1,3-二羟基苯、2-甲基-1,3-二羟基苯、4-氯-1,3-二羟基苯、5,6-二氯-2-甲基-1,3-二羟基苯、1-羟基-3-氨基-苯、1-羟基-3-(氨基甲酰基甲基氨基)苯、6-羟基苯并吗啉、4-甲基-2,6-二羟基吡啶、2,6-二羟基吡啶、2,6-二氨基吡啶、6-氨基苯并吗啉、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、1-羟基萘、1,7-二羟基萘、1,5-二羟基萘、5-氨基-2-甲基苯酚、4-羟基吲哚、4-羟基吲哚啉、6-羟基吲哚、6-羟基吲哚啉以及其混合物。本文可以提及的具体偶联剂包括间苯二酚、1-萘酚、5-氨基-邻甲酚、2-甲基间苯二酚、间氨基苯酚、间苯二胺、1-苯基-3-甲基-吡唑-5-酮，其盐或混合物

如果组合物包含表面活性剂，则该表面活性剂可以是阴离子的、阳离子的、非离子的、两性离子的或两性的。应当理解，一种或多种表面活性剂可以形成组合物的一部分。当存在时，一种或多种表面活性剂可以占组合物的0.01至20wt％。

本文可以提及的合适的非离子表面活性剂包括但不限于烷基多糖苷、聚西托醇1000、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、椰油酰胺DEA、椰油酰胺MEA、癸基葡糖苷、癸基聚葡萄糖、乙氧基化物、单硬脂酸甘油酯、IGEPAL CA-630、异鲸蜡醇聚醚-20、月桂基葡糖苷、麦芽糖苷、甘油一月桂酸酯、抗霉枯草菌素、诺乃清洁剂(nonidet)P-40、壬苯醇醚、八乙二醇单十二烷基醚、N-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、辛基葡糖苷、油醇、PEG-10向日葵甘油酯、五乙二醇单十二烷基醚、聚多卡醇、泊洛沙姆、聚乙氧基化牛脂胺、聚蓖麻酸聚甘油酯、聚山梨酸酯、脱水山梨糖醇、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、硬脂醇、表面活性素(surfactin)、Triton X-100和吐温80。

本文可以提及的合适的阳离子表面活性剂包括但不限于山嵛基三甲基氯化铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯度溴铵、bronidox、carbethopendecinium bromide、西他氯铵、西曲溴铵、西曲氯铵、西吡氯铵、二癸基二甲基氯化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、二甲基双十八烷基氯化铵、溴化度米芬(domiphen bromide)、月桂基甲基gluceth-10羟基丙基二甲基氯化铵、奥替尼啶双盐酸盐、奥拉氟(olaflur)、N-油烯基-1,3-丙二胺、箱鲀毒素(pahutoxin)、司拉氯铵、氢氧化四甲基铵和通佐溴胺。

本文可以提及的合适的两性离子表面活性剂包括但不限于甜菜碱、N-烷基-N,N-二甲基甘氨酸铵、N-酰基氨基丙基-N,N-二甲基-甘氨酸铵和2-烷基-3-羧基甲基-3-羟基乙基咪唑啉。

本文可以提及的合适的两性离子表面活性剂包括但不限于N-烷基甘氨酸、N-烷基丙酸、N-烷基氨基丁酸、N-烷基亚氨基二丙酸、N-羟基乙基-N-烷基酰胺基丙基甘氨酸、N-烷基牛磺酸、N-烷基肌氨酸、2-烷基氨基丙酸和烷基氨基乙酸。特别优选的两性表面活性剂是N-椰油烷基氨基丙酸酯、椰油酰基氨基乙基氨基丙酸酯和C₁₂-C₁₈酰基肌氨酸。

根据本发明的组合物除水之外还可包括一种或多种溶剂作为额外的稀释材料。通常，选择适合用于本发明的着色组合物的溶剂，以使其与水混溶并且对皮肤无害。适合用作本文额外的稀释剂的溶剂包括C₁-C₂₀一元醇或多元醇及其醚、甘油，其中一元醇和二元醇及其醚是优选的。在这些化合物中，优选含有2至10个碳原子的醇残余物。因此，优选的组包括乙醇、异丙醇、正丙醇、丁醇、丙二醇、乙二醇单乙醚及其混合物。这些额外的稀释剂/溶剂的存在量可以为总组合物的按重量计约0.5％至约20％。

取决于所选的应用，可能需要调节组合物的粘度。例如，这可能是为了满足消费者的期望或出于功能原因(例如，使组合物更易于处理用于具体应用)。这通常是通过使用一种或多种增稠剂而发生。可以使用任何合适的增稠剂，如有机和无机增稠剂。

合适的增稠剂包括阴离子的合成聚合物；阳离子的合成聚合物；天然存在的增稠剂，如非离子瓜尔胶、硬葡聚糖胶或黄原胶、阿拉伯胶、茄替胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、角叉菜胶、琼脂、槐豆粉、果胶、藻酸盐、淀粉级分以及衍生物(诸如直链淀粉、支链淀粉和糊精)，以及纤维素衍生物(其不同于本发明的纤维素)，例如像甲基纤维素、羧基烷基纤维素和羟基烷基纤维素；非离子的全合成聚合物，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮；以及无机增稠剂，特别是层状硅酸盐，例如像膨润土，特别是蒙脱石，如蒙脱土或锂蒙脱石。应当理解，一种或多种以上增稠剂可以用于本文所述组合物中。

在本文所述组合物中，基于组合物的总重量，增稠剂可以按重量计0.1至4.5％，如按重量计0.15至3.5％，如按重量计0.2至2.0％的总量使用。

组合物可具有的pH范围为7.0-10.0(例如9.5至10.0)。如果组合物不具有在所讨论的应用的期望pH范围内的pH，则可以通过添加一种或多种碱化剂来调节pH。可以用于调节期望pH值的合适的碱化剂可以选自由以下形成的组：氨、烷醇胺、碱性氨基酸，以及无机碱化剂，诸如碱(碱土)金属氢氧化物、碱(碱土)金属硅酸盐、碱(碱土)金属磷酸盐和碱(碱土)金属磷酸氢盐。例如，碱化剂可以是Na₂CO₃。

如果pH碱性过高，应当理解，组合物可进一步包含一种或多种酸以调节pH值。合适的酸是例如有机酸，诸如α-羟基羧酸，或无机酸。

进一步地，上述组合物还可包括其他活性物质、辅助物质和添加剂，例如像直链阳离子聚合物，诸如季铵化纤维素醚、具有季铵基团的聚硅氧烷、二甲基二烯丙基氯化铵聚合物、丙烯酰胺-二甲基二烯丙基氯化铵共聚物、用硫酸二乙酯季铵化的甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物、乙烯基吡咯烷酮-咪唑啉鎓-甲基氯化物共聚物以及季铵化聚乙烯醇；两性离子和两性聚合物；阴离子聚合物，例如像聚丙烯酸或交联的聚丙烯酸；结构剂，诸如葡萄糖、马来酸和乳酸，头发调理化合物，诸如磷脂，例如卵磷脂和脑磷脂；香料油(perfume oil)、二甲基异山梨醇和环糊精；改善纤维结构的活性物质，特别是单糖、二糖和寡糖，例如像葡萄糖、半乳糖、果糖、水果糖和乳糖；用于使试剂着色的染料；去头屑剂，诸如吡罗克酮乙醇胺、奥麦丁锌和氯咪巴唑；氨基酸和寡肽；蛋白质与动物和/或植物碱的水解产物，并且呈其脂肪酸缩合产物或任选地经阴离子或阳离子改性的衍生物的形式；光稳定剂和UV阻断剂；活性物质，诸如泛醇、泛酸、泛内酯、尿囊素、吡咯烷酮羧酸及其盐以及没药醇；多酚，特别是羟基肉桂酸、6,7-二羟基香豆素、羟基苯甲酸、儿茶素、丹宁酸、白花色素、花青素、黄烷酮、黄酮和黄酮醇；神经酰胺或假神经酰胺；维生素、维生素原和维生素前体；植物提取物；脂肪和蜡，诸如脂肪醇、蜂蜡、褐煤蜡和石蜡；溶胀剂和穿透剂，诸如甘油、丙二醇单乙醚、碳酸盐、碳酸氢盐、胍、脲，以及伯磷酸盐、仲磷酸盐和叔磷酸盐；遮光剂，诸如胶乳、苯乙烯/PVP和苯乙烯/丙烯酰胺共聚物以及PEG-3二硬脂酸酯；推进剂，诸如丙烷-丁烷混合物、N₂O、二甲醚、CO₂和空气。

这些额外的物质的选择是由熟练技术人员根据所讨论的组合物的期望特性来进行的。关于其他兼性组分和所述组分的使用量，明确参考熟练技术人员已知的相关手册。基于所讨论的组合物的总重量，额外的活性和辅助物质在本发明的试剂中优选地在每种情况下以按重量计0.0001至25％、特别地按重量计0.0005至15％的量使用。

本文公开的组合物可以例如以洗剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或泵泡沫的形式产生。因此，取决于施加形式，优选将它们填充到管、容器、瓶、箱、加压容器中，或填充到具有泵喷雾施加器的容器中。

在某些实施方式中，以上公开的组合物可含有式I或II的化合物的氧化衍生物。在这种情况下，可能无需提供单独的氧化剂。然而可以原样使用其中式I或II的化合物呈未氧化形式的组合物，并且提供至少临时头发染色效果。还考虑到氧化剂也可以被包含在组合物中(或分开施加)，以使头发为金色并提供更一致的着色，其可以是永久的。因此，在本发明的第六方面，提供了部件试剂盒，该试剂盒包含：

(i)如上所述的组合物；以及

(ii)包含氧化剂的显影组合物。

应当理解，上述组合物优选含有未氧化形式的式I和II的化合物，尽管也可以使用氧化形式的式I和II的化合物。

通常，包含上述式I或II的化合物的组合物可用于这些部件试剂盒中。同样地，这里参考了这些组合物的以上描述。

将显影组合物添加到包含式I或II的化合物的组合物中，以对头发提供金色/漂白作用，并可能地引起式I或II的化合物(如果呈非氧化形式)的氧化。显影组合物可以使用在皮肤和头发上使用安全的任何合适的氧化剂。本文可以提及的合适的氧化剂是过氧化氢。可以落入规则性指南内的合适量提供氧化剂。同样地，根据欧盟化妆品指令(CouncilDirective of 27 July 1976 r.Annex III p.12)，即用型染发剂的最大允许浓度是12％(40体积)并且在皮肤护理制剂中为4wt％。应当理解，此处提及的部件试剂盒旨在用于染发剂组合物中，同样地，氧化剂可以是以0.5至45wt％的量存在于显影剂组合物中，其中余量为水。

在本发明的另外实施方式中，显影剂组合物可进一步包含表面活性剂、增稠剂和酸化剂。

当存在于显影剂组合物中时，一种或多种表面活性剂可以选自上文提及的那些。一种或多种表面活性剂可以是以显影剂组合物的0.01至20wt％的量存在。

当存在于显影剂组合物中时，一种或多种增稠剂可以选自上文提及的那些。一种或多种增稠剂可以是以显影剂组合物的0.01至20wt％的量存在。

显影剂组合物可以具有2.5-6.9的pH范围。如果显影剂组合物不具有在所讨论的应用的期望pH范围内的pH，则可以通过添加一种或多种酸化剂来调节pH。合适的酸化剂包括例如有机酸，诸如α-羟基羧酸，或无机酸。

进一步地，显影剂组合物还可包括如上文描述的其他活性物质、辅助物质和添加剂。

当用于使头发染色中时，头发染色方法可具有三个步骤：

·第一步骤要求使受试者的头发与“组合物”(在任选的与显影剂(例如，包含氧化剂的组合物)混合后)接触；

·使混合物在头发中保持约30秒至约60分钟的时间段；以及

·然后用水和含表面活性剂的洗发剂全面洗涤头发，使头发保持持久的变色。

可以将使用本文所述的组合物的临时文身以与指甲花文身(henna tattoo)类似的方式施加到受试者的皮肤上。

将结合以下实施例进一步描述本发明，这些实施例仅出于说明的目的列出。

实验

通用

所有常用试剂均从商业供应商获得并且无需进一步纯化而使用。使用BrukerAvance 500(AV500)、Bruker Avance 300(AV300)和Bruker Avance 400(DRX400)NMR光谱仪记录NMR光谱。

材料和方法：

试剂、标准品和其他化学品

对苯二胺(99％)和2-氨基-5-硝基-吡啶(ANP)购自Sigma-Aldrich。甲酸(98％)购自Fluka Chemie(GmbH)。乙腈(99.9％)和氢氧化铵(30％)、亚甲基氯和甲醇(99.9％)购自Merck。

具有提及的纯度和CAS编号的测试化学品购自Sigma Aldrich化学公司(新加坡)：1,4-苯二胺，100％[106-50-3]；对苯醌，98％[106-51-4]；甲磺酸去铁胺和DL-二硫苏糖醇。购买半胱氨酸肽(Ac-RFAACAA-COOH)100％[106-50-3]；和赖氨酸肽(Ac-RFAAKAA-COOH)100％[106-50-3]并通过Peptide 2.0Inc(Chantilly,VA)进行纯化。亮氨酸脑啡肽内标物购自Sigma Aldrich化学公司(新加坡)。测试化学品对苯二胺(99％)购自Sigma Aldrich化学公司(新加坡)。乙腈(99.9％)和甲醇(99.9％)购自Merck。

仪器装置

Agilent 1290Infinity超高压液相色谱(UHPLC)二元泵、自动进样器、真空除气机和柱温箱(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA,USA)和ACQUITY UPLC BEH C18,1.7μM,2.1×100mm柱(Waters,Mildord,MA,USA)用于色谱分离。质谱分析是通过使用配备有AB Sciex Turbo Ion Spray接口的以三重四极杆阳性模式(ESI+)操作的AB SCIEXQTRAP 5500串联质谱(MS/MS)体系(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)进行的。数据的获取和分析是使用Analyst软件版本1.6.2(Applied Biosystems)进行的。

高效液相色谱法

分析柱维持在40℃下。使用以0.4mL/min泵送的流动相梯度从柱上洗脱分析物。流动相A由乙腈中的0.1％甲酸组成。流动相B由Milli-Q水中的0.1％甲酸组成。将90％B的初始梯度维持2min，在1min内减少至70％B，维持4.0min并且在0.5min内增加至90％B。使柱平衡1min，使得总运行时间为5min。注射体积是5.0μL。

串联质谱法

分析物和IS在具有多重反应监测(MRM)的以阳性模式(ESI+)操作的三重四极杆质谱仪上检测。通过在输注分析期间以20μL/min的恒定流速对内标物(IS)进行增强子离子(EPI)扫描，选择每种分析物的丰富片段。对于每种化合物，监测两个质量片段，其中一个片段用于定量并且另一个片段用于额外确认同一性。

通用程序1

以下程序用于合成本文提及的某些硝基化合物。

在惰性气氛下，将三乙胺(1.5当量)添加到1-氟-4-硝基苯和C-取代的PPD衍生物的等摩尔的混合物的DMSO(7mL)溶液中。在90℃下搅拌24小时后，将反应混合物冷却并倒入水中以引起沉淀。用乙酸乙酯萃取粘性沉淀物，并用水和盐水溶液彻底洗涤有机层。蒸发溶剂得到呈红色液体的粗产物，将其通过硅胶柱色谱法纯化。

通用程序2

以下程序用于还原本文提及的某些硝基化合物以提供期望的最终产物。

在惰性气氛下，将过量的氯化锡(II)添加到硝基衍生物的乙醇溶液中。添加浓HCl(2.5mL)并且将混合物回流24小时。将所得混合物倒入冰水混合物中，并用20％NaOH水溶液将混合物的pH设定为12。用乙酸乙酯萃取混合物，并用水以及最终用盐水溶液快速洗涤有机层。在溶剂蒸发后，将残余物在真空下干燥以得到标题化合物。

通用程序3

此程序涉及由4,4’-二氨基二苯胺形成二亚胺。

将醛(1.1mmol)添加到4,4’-二氨基二苯胺(1mmol)的乙醇悬浮液中。将所得混合物在室温下搅拌持续对于相应醛所提及的时间。将所得结晶沉淀物过滤并用乙醇和二乙醚的1:1混合物洗涤，并且然后最后用二乙醚洗涤。在抽吸下干燥得到呈结晶固体的期望产物。通过从二氯甲烷和己烷的混合物中重结晶获得纯亚胺。

通用程序4

此程序涉及由二亚胺形成二胺

将亚胺(1mmol)溶解于在氮气气氛下的两颈圆底烧瓶中的12mL干燥的THF中。向溶液中添加过量的硼氢化钠(4mmol)，并将混合物在室温下搅拌24小时。添加过量的水以淬灭反应以及淬灭任何未反应的硼氢化钠。在真空下除去THF，并且将残余物用二氯甲烷萃取。将DCM萃取物用水并然后用盐水溶液洗涤三次。在经无水Na₂SO₄干燥并且在真空中除去溶剂后，提供呈结晶固体的期望胺。

实施例1

合成PPD衍生物1：4,4′-二氨基二苯胺(2)

4,4′-二硝基二苯胺(1)

将固体氢氧化钠(1.65g，41mmol)添加到对硝基苯胺(1.4g，10mmol)的DMSO溶液中。向绿棕色混合物中滴加硝基苯(3.8mL，37mmol)并且将混合物在80℃温度下搅拌12小时，其中缓慢鼓泡空气流通过。如从TLC分析明显的是，在硝基苯完全消耗后，将反应混合物冷却至室温并在剧烈搅拌下滴加到水中，这产生黄色沉淀物。将沉淀物通过过滤收集，用水彻底洗涤以除去痕量的NaOH，并然后用己烷洗涤以除去过量的硝基苯。将沉淀物溶解于最小量的DCM/丙酮混合物中，并在剧烈搅拌下滴加到己烷中。将黄色沉淀物过滤，用己烷洗涤并在抽吸下干燥以提供2g纯产物。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.98(1H,s,胺),8.21(4H,d,J＝9Hz),7.36(4H,d,J＝9Hz)。¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ147.6,140.5,125.8,117.1。

4,4′-二氨基二苯胺(2)

在氮气气氛下，将4,4′-二硝基二苯胺(1g，3.86mmol)悬浮于20mL浓盐酸中。将细锡粉(2.46g，20.72mmol)分批添加到反应混合物中。在完全添加锡后，将反应混合物回流18小时。然后将反应混合物冷却至室温，并用50mL水稀释，并通过滴加20％NaOH水溶液将混合物的pH调节至12。形成灰白色沉淀物，将其过滤并用水洗涤以除去痕量的NaOH。在真空下延长的干燥后，收集呈灰白色粉末的产物(0.6g)。可替代地，可以用乙酸乙酯、有机溶剂从碱性混合物中萃取产物，将它们干燥(MgSO₄)并在真空下除去，以得到产物。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ6.76(1H,s,仲胺),6.64(4H,d,J＝8Hz),6.45(4H,d,J＝8Hz),4.48(4H,s,伯胺)。¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ141.4,135.6,118.4,115.0。

在4,4′-二氨基二苯胺(2)的1H NMR光谱中观察到δ9.98ppm处的1个共振的仲胺质子，仲胺质子的显著的高磁场位移(Δδ3.22ppm)。通过氘交换实验明确分配了胺信号。

实施例2：

合成PPD衍生物2：N¹,N⁴-双(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺(4)

N¹,N⁴-双(4-硝基苯基)-1,4-苯二胺(3)

在惰性气氛下，将1-氟-4-硝基苯(2.2mL，20.7mmol)和三乙胺(3mL，21.5mmol)依次添加到对苯二胺(1.08g，10mmol)的20ml DMSO溶液中。将深红色溶液在90℃下搅拌三天，然后将混合物冷却至室温，并在剧烈搅拌下滴加到200ml冷却水中。将深棕色沉淀物通过过滤收集并且用蒸馏水彻底洗涤。在抽吸下干燥得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法使用20％丙酮/DCM混合物作为洗脱液进行纯化。可替代地，可以通过用70％DCM/己烷混合物洗涤粗混合物来分离标题化合物。产率：1.12g(40％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.31(s,2H,仲胺),8.10(d,J＝9.3,4H),7.28(s,4H),7.04(d,J＝9.3,4H)。¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ148.1,141.0,126.4,117.6。

N¹,N⁴-双(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺(4)

通过遵循对于合成4,4′-二氨基二苯胺所描述的方法通过用锡粉(2g，16mmol)还原相应的二硝基化合物3(0.6g，1.71mmol)来合成这种化合物。产率：0.3g(61％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ7.01(s,2H),6.72(d,J＝4.6,8H),6.48(d,J＝8.3,4H),4.58(s,2H)。¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ142.1,138.0,134.3,119.6,117.0,114.9。

实施例3

合成PPD衍生物3：2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺(5)

合成2-(2-乙基己氧基)-4-硝基苯胺

将2-氨基-5-硝基苯酚(1.54g，10mmol)溶解于在惰性气氛下保持的20mL的DMF中，并且将1.39g(10mmol)的K₂CO₃添加到搅拌溶液中。在室温下搅拌五分钟后，添加1-溴-2-乙基己烷(2.3ml，12.93mmol)。将所得红色混合物回流18小时。在剧烈搅拌下将深棕色混合物滴加到饱和NaHCO₃溶液中。在30分钟后，将混合物用DCM萃取，并且将有机层用NaHCO₃溶液洗涤3次，用饱和LiCl溶液并且最后用盐水溶液洗涤3次。在经无水Na₂SO₄干燥后，将溶剂在减压下除去并且在真空中干燥。分离呈黄绿色粘性液体的标题化合物。产率：0.8g(52％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.72(dd,J＝8.8Hz,2.2Hz,1H),7.57(d,J＝2.3Hz,1H),6.67(d,J＝8.8Hz,1H),6.30(s,2H),3.94(d,J＝5.3Hz,2H),1.74(dt,J＝12.0Hz,5.9Hz,1H),1.53–1.38(m,4H),1.33–1.26(m,4H),0.92–0.85(m,6H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ146.3,144.3,136.1,119.8,111.2,106.5,70.9,30.1,28.8,23.6,22.8,14.3,11.2。

PPD衍生物3：2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺(5)

在惰性气氛下，将过量的氯化锡(II)(7.14g，37mmol)添加到1.31g(5.5mmol)的2-(2-乙基己氧基)-4-硝基苯胺的乙醇溶液中。添加浓HCl(2.5mL)并且将混合物回流24小时。将所得白色浑浊混合物倒入冰水混合物中，并通过添加20％NaOH水溶液将混合物的pH调节至12。用乙酸乙酯萃取混合物，并用水并且最终用盐水溶液快速洗涤有机层。在溶剂蒸发后，将残余物在真空下干燥以提供标题化合物。

产率：0.6g(82％)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.72(dd,J＝8.8Hz,2.2Hz,1H),7.57(d,J＝2.3Hz,1H),6.67(d,J＝8.8Hz,1H),6.30(s,4H),3.94(d,J＝5.3Hz,2H),1.74(dt,J＝12.0Hz,5.9Hz,1H),1.53–1.38(m,4H),1.33–1.26(m,4H),0.92–0.85(m,6H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ146.3,144.3,136.1,119.8,111.2,106.5,70.9,30.1,28.8,23.6,22.8,14.3,11.2。

实施例4

合成PPD衍生物4：2-己氧基-1,4-二氨基苯(6)

合成2-己氧基-4-硝基苯胺

将2-氨基-5-硝基苯酚(3.083g，20.4mmol)溶解于在惰性气氛下保持的10mL的DMF中。将1-溴己烷(2.8ml，20mmol)和K₂CO₃(2.83g 20.5mmol)添加到溶液中。将所得红色混合物回流18小时，之后，在剧烈搅拌下将所得深棕色混合物滴加到饱和NaHCO₃溶液中。在30分钟后，将混合物用DCM萃取，并且将有机层用NaHCO₃溶液洗涤3次，用饱和LiCl溶液并且最后用盐水溶液洗涤3次。在经无水Na₂SO₄干燥后，将溶剂在减压下除去并且将所得混合物油在真空中干燥。然后将油性混合物通过梯度柱色谱法用乙酸乙酯和己烷混合物作为洗脱液进行纯化。用50％乙酸乙酯和己烷混合物洗脱标题化合物，并且溶剂蒸发得到呈嫩黄色固体的产物。

产率：3.2g(96.2％)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.72(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),7.55(d,J＝2.4Hz,1H),6.66(d,J＝8.8Hz,1H),6.34(s,2H),4.04(t,J＝6.4Hz,2H),1.75(五重峰,J＝7Hz,2H),1.52–1.39(m,2H),1.31(m,4H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ146.4,144.2,136.0,119.9,111.2,106.7,68.6,31.4,28.8,25.4,22.4,14.2

PPD衍生物4：2-己氧基-1,4-二氨基苯(6)

使用与制造(5)的合成方案类似的合成方案来合成标题化合物，除了在惰性气氛下将过量的氯化锡(II)(7.14g，37mmol)添加到1.31g(5.5mmol)的2-己氧基-4-硝基苯胺的乙醇溶液中。

产率：0.6g(84％)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.20(d,J＝2.1Hz,1H),6.00(dd,J＝8.1Hz,2.1Hz,1H),4.04(s,4H),3.84(t,J＝6.4Hz,2H),1.77–1.65(m,2H),1.50–1.38(m,2H),1.32(m,4H),0.90(t,J＝6.7Hz,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ147.1,140.3,128.0,115.7,106.9,100.8,67.8,31.4,29.3,25.7,22.5,14.2。

实施例5

合成PPD衍生物5：4-氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺(14)

4-氨基-(3-己氧基)-4′-硝基二苯胺(11)

使用通用程序1使用1-氟-4-硝基苯和2-己氧基-1,4-二氨基苯(6)获得的。

产率：0.89g(89％)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ8.94(s,1H),8.00(d,J＝9.2,2H),6.81(d,J＝9.3,2H),6.71–6.64(m,2H),6.59(dd,J＝8.3,1.9,1H),4.66(s,2H),3.92(t,J＝6.4,2H),1.77–1.67(m,2H),1.42(dd,J＝13.2,6.0,2H),1.34–1.26(m,4H),0.87(t,J＝6.8,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ153.3,146.3,136.8,135.9,128.8,126.6,116.4,114.3,112.3,108.3,68.2,31.4,29.1,25.6,22.4,14.2。

PPD衍生物5：4-氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺(14)

使用通用程序2通过还原4-氨基-(3-己氧基)-4′-硝基二苯胺(11)来合成标题化合物。

产率：0.85g(85％)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ6.82(s,1H),6.69(d,J＝8.3,2H),6.47(dd,J＝18.3,9.9,4H),6.28(d,J＝7.2,1H),4.51(s,2H),4.09(s,2H),3.84(t,J＝6.3,2H),1.75–1.66(m,2H),1.46–1.38(m,2H),1.32(dd,J＝9.6,5.9,4H),0.89(t,J＝6.6,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ146.8,142.1,137.1,135.4,130.4,119.4,115.3,115.2,109.4,103.0,67.0,31.4,29.2,25.6,22.4,21.1,14.5。

实施例6

合成PPD衍生物6：[2-氨基-5-(4-硝基苯基氨基)]苯甲酸己酯(15)

[2-氨基-5-(4-硝基苯基氨基)]苯甲酸己酯(12)

使用通用程序1使用1-氟-4-硝基苯(0.12mL；1.13mmol)和2,5-二氨基苯甲酸己酯(0.22g，0.93mmol)获得的。通过使用dcm/己烷混合物的梯度柱色谱法来纯化粗产物，并用30％dcm/己烷洗脱标题化合物。

产率：0.2g(60％)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.97(s,1H),8.02(d,J＝9.2,2H),7.55(d,J＝2.3,1H),7.20(dd,J＝8.7,2.4,1H),6.85(d,J＝8.8,1H),6.78(d,J＝9.2,2H),6.66(s,2H),4.20(t,J＝6.5,2H),1.71–1.62(m,2H),1.36(mm 2H),1.31–1.24(m,4H),0.84(t,J＝6.7,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ167.3,153.1,149.3,137.2,131.0,127.3,126.6,125.3,118.1,112.3,109.4,64.4,31.2,28.5,25.6,22.3,14.1。

PPD衍生物6：2-氨基-5-((4-氨基苯基)氨基)苯甲酸己酯(15)

使用通用程序2通过还原[2-氨基-5-(4-硝基苯基氨基)]苯甲酸己酯(12)来合成标题化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.32(d,J＝2.7,1H),7.00–6.91(m,2H),6.72–6.62(m,3H),6.52–6.43(m,2H),6.13(s,2H),4.57(s,2H),4.18(t,J＝6.5,2H),1.69–1.60(m,2H),1.40–1.34(m,2H),1.32–1.27(m,4H),0.87(t,J＝6.9,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ167.8,145.2,142.2,135.1,125.9,119.4,118.0,117.1,115.4,109.7,64.0,31.2,28.5,25.5,22.3,14.2。

实施例7

合成PPD衍生物7：4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺(16)

4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-硝基二苯胺(13)

使用通用程序1使用1-氟-4-硝基苯和2-己氧基-1,4-二氨基苯(6)获得的。

¹H NMR(300MHz,DMSO)δ8.97(s,1H),8.00(d,J＝9.2,2H),6.81(d,J＝9.3,2H),6.68(d,J＝6.6,2H),6.53(d,J＝8.9,1H),4.55(t,J＝5.9,1H),3.94(t,J＝6.4,2H),3.07(dd,J＝13.1,6.6,2H),1.78–1.67(m,2H),1.55(dd,J＝13.9,7.0,2H),1.48–1.38(m,2H),1.36–1.25(m,10H),0.87(t,J＝6.9,6H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ153.3,146.3,136.9,136.4,128.2,126.6,116.4,112.3,109.6,107.7,68.3,43.3,31.5,31.4,29.1,29.0,26.6,25.6,22.5,22.4,14.21,14.20。

PPD衍生物7：4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺(16)由4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-硝基二苯胺(13)的还原来合成

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ6.85(s,1H),6.70(d,J＝7.6,2H),6.51–6.43(m,3H),6.43–6.32(m,2H),4.54(s,2H),3.86(t,J＝6.0,2H),2.98(br,2H),1.75–1.66(m,2H),1.52(dd,J＝13.6,6.8,2H),1.48–1.38(m,2H),1.32(d,J＝16.0,10H),0.88(d,J＝3.7,6H)。

实施例8

合成PPD衍生物8：4,4′-双[(4-氨基苯基)氨基]二苯胺(17)

4,4′-双[(4-硝基苯基)氨基]二苯胺

在惰性气氛下，将1-氟-4-硝基苯(0.8mL，7.5mmol)和三乙胺(1mL，7.2mmol)添加到4,4′-二氨基二苯胺(0.497g，2.5mmol)的7ml DMSO溶液中。将深红色溶液在90℃下搅拌三天，然后将混合物冷却至室温，并在剧烈搅拌下滴加到200ml冷却水中。将深棕色粘性沉淀物用甲醇萃取并且将上清液用DCM萃取。将合并的萃取物蒸发至干，并将黑色粘性残余物溶解于DMF中，并用Et₂O和己烷的1:1混合物磨碎，以除去过量的1-氟-4-硝基苯。从DCM和己烷中进一步重复磨碎得到呈深棕色结晶固体的标题化合物。

产率：0.96g(87％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.13(s,2H),8.23(s,1H),8.06(d,J＝9.3,4H),7.14(q,J＝8.9,8H),6.92(d,J＝9.3,4H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ152.0,140.3,137.0,131.7,126.2,123.6,117.6,112.3。

PPD衍生物8：4,4′-双[(4-氨基苯基)氨基]二苯胺(17)

通过遵循通用程序2中所描述的方法通过用锡粉(0.667g，5.7mmol)还原相应的二硝基化合物(0.5g，1.14mmol)来合成这种化合物。产率：0.22g(50％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.20(s,1H),7.06(s,2H),6.81–6.74(m,12H),6.50(d,J＝8Hz,4H)4.59(s,4H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ142.1,138.0,134.3,119.6,117.0,114.9。

实施例9

合成PPD衍生物9：4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺(24)

4-氨基-4′-硝基二苯基胺(18)

将过量的碳酸钾(2.8g，20mmol)添加到保持在惰性气氛下的对苯二胺(1.087g，10mmol)和1-氟-4-硝基苯(1.1mL，10.4mmol)的DMSO(10mL)溶液中。将深红色溶液在90℃下搅拌24小时，然后将混合物冷却至室温，并在剧烈搅拌下滴加到200ml冷却水中。通过过滤收集所得红色沉淀物。用水洗涤滤饼并在抽吸下干燥，得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法进行纯化。用5％乙酸乙酯/DCM混合物洗脱标题化合物。

产率：1g(43％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.88(s,1H),8.00(d,J＝9.2,2H),6.92(d,J＝8.5,2H),6.76(d,J＝9.2,2H),6.61(d,J＝8.5,2H),5.08(s,2H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ153.1,146.3,136.4,127.8,126.3,124.7,114.5,111.7。

甲苯亚胺(20)

将对甲苯甲醛(0.36mL，3mmol)和催化量的对甲苯磺酸添加到4-氨基-4′-硝基二苯胺(0.682g，2.97mmol)的乙醇溶液(10mL)中，并且将混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。将所得橙色沉淀物通过过滤进行收集，并且用20mL的20％乙醇/己烷混合物并最后用己烷进行洗涤。经抽吸干燥得到纯结晶固体。

产率：0.97g(98％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ9.37(s,1H),8.62(s,1H),8.10(d,J＝9.0,2H),7.83(d,J＝7.9,2H),7.36–7.26(m,6H),7.07(d,J＝9.1,2H),2.38(s,3H)。¹³CNMR(75MHz,DMSO-d6):δ159.1,150.6,146.6,141.3,138.1,137.9,133.6,129.3,128.5,126.1,122.2,121.5,113.4,21.1。

4-硝基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺(22)

将过量的硼氢化钠(0.25g，6.61mmol)添加到亚胺20(0.45g，1.36mmol)在THF和甲醇的2:1混合物中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用水淬灭。在减压下除去挥发物，并小心添加浓HCl将溶液pH调节至9。将混合物用DCM萃取。将有机层用水并且然后用盐水溶液洗涤，最终经无水Na₂SO₄干燥。浓缩溶液，并且在添加过量己烷的情况下使纯产物沉淀。将沉淀物在真空下干燥，得到棕色粉末。

产率：0.4g(88％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.90(s,1H),7.99(d,J＝9.1,2H),7.26(d,J＝7.8,2H),7.13(d,J＝7.8,2H),6.95(d,J＝8.5,2H),6.76(d,J＝9.1,2H),6.61(d,J＝8.5,2H),6.24(t,J＝5.9,1H),4.22(d,J＝5.9,2H),2.27(s,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ152.9,146.3,137.0,136.4,135.6,128.8,127.8,127.1,126.2,124.4,112.8,111.7,46.4,20.6。

PPD衍生物9：4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺(24)

将锡粉(0.612g，5mmol)添加到4-硝基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺22(0.334g，1mmol)的15mL浓HCl悬浮液中，并且将混合物回流过夜。在反应完成后，将无色溶液用50mL水稀释并置于冰浴中，并将混合物的pH调节至12。将出现的白色沉淀物过滤，用水快速洗涤并在真空中干燥。

产率：0.268g(88％)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.24(d,J＝7.9,2H),7.12(d,J＝7.8,2H),6.78(s,1H),6.66(dd,J＝12.3,5.3,5H),6.49–6.44(m,5H),5.58(s,1H),4.47(s,2H),4.14(d,J＝4.4,2H),2.27(s,3H)。

实施例10

合成PPD衍生物10：N¹-[4-(4-甲苯基氨基甲基)苯基]-N⁴-(4-氨基苯基)-1,4-苯二 胺(25)

N¹-(4-氨基苯基)-N⁴-(4-硝基苯基)-1,4-苯二胺(19)

在惰性气氛下，将1-氟-4-硝基苯(0.31mL，2.9mmol)和三乙胺(0.8mL，5.74mmol)依次添加到4,4′-二氨基二苯胺(0.5948g，2.98mmol)的7ml DMSO溶液中。在90℃下搅拌24小时后，将反应混合物冷却并倒入水中以引起沉淀。将深色沉淀物通过过滤收集，用水洗涤并在抽吸下干燥。通过梯度柱色谱法纯化粗产物，同时将期望产物用2％DCM/乙酸乙酯混合物洗脱。

产率：0.28g。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.98(s,1H),8.01(d,J＝9.1,2H),7.53(s,1H),7.01(d,J＝8.6,2H),6.83(dd,J＝11.7,4.9,6H),6.55(d,J＝8.5,2H),4.76(s,2H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ152.7,144.0,143.8,136.6,131.7,129.1,124.3,122.3,114.7,114.4,111.9。

N¹-[(4-亚氨基-对甲苯基)苯基]-N⁴-(4-硝基苯基)-1,4-苯二胺(21)

将对甲苯甲醛(0.11mL，0.93mmol)和催化量的对甲苯磺酸添加到N¹-(4-氨基苯基)-N⁴-(4-硝基苯基)-1,4-苯二胺(0.278g，0.86mmol)的乙醇溶液(10mL)中，并且将混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。将所得橙色沉淀物通过过滤进行收集，并且用20mL的20％乙醇/己烷混合物并最后用己烷进行洗涤。经抽吸干燥得到纯结晶固体。产率：0.31g(86％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ9.13(s,1H),8.61(s,1H),8.31(s,1H),8.06(d,J＝9.2,2H),7.80(d,J＝8.0,2H),7.29(dd,J＝13.4,8.4,4H),7.17–7.08(m,6H),6.93(d,J＝9.2,2H),2.37(s,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ156.6,151.9,143.0,142.2,140.7,139.8,137.0,133.9,131.9,129.3,128.2,126.2,123.5,122.3,118.0,116.7,112.4,21.05。

N¹-[4-(4-甲苯基氨基甲基)苯基]-N⁴-(4-硝基苯基)-1,4-苯二胺(23)

在惰性气氛下，将1-氟-4-硝基苯(0.12mL，1.1mmol)和三乙胺(0.23mL，1.2mmol)依次添加到4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺24(0.303g，1mmol)的7ml DMSO溶液中。将深红色溶液在90℃下搅拌两天，然后将混合物冷却至室温，并在剧烈搅拌下滴加到200ml冷却水中，这得到了胶体悬浮液。添加盐水溶液产生深棕色沉淀物，将该沉淀物通过过滤收集，用水洗涤并在抽吸下干燥。将粗产物通过硅胶柱色谱法通过用纯DCM洗脱来进行纯化。产率：0.1g(26％)。

可替代地，这种化合物还通过在甲醇/THF的1:2混合物中用硼氢化钠(0.1g，2.64mmol)来还原(E)-N¹-(4-甲基苯亚甲基)-N⁴-(4-((4-硝基苯基)氨基)苯基)苯-1,4-二胺(21)(0.2g，0.47mmol)的亚胺基团来合成。遵循对于合成4-氨基-4′-[(4-甲苯基氨基甲基)苯基]二苯胺使用的方法进行后处理。分离呈红色固体的产物。

产率：0.95g(95％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.98(s,1H),8.01(d,J＝9.1,2H),7.55(s,1H),7.26(d,J＝7.8,2H),7.12(d,J＝7.8,2H),7.00(d,J＝8.6,2H),6.90–6.80(m,6H),6.56(d,J＝8.6,2H),5.90(t,J＝5.9,1H),4.19(d,J＝5.8,2H),2.27(s,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ152.6,144.2,143.8,137.3,136.6,135.4,131.8,129.2,128.7,127.1,126.2,124.2,122.1,114.5,113.1,111.9,46.8,20.6。

PPD衍生物10：N¹-[4-(4-甲苯基氨基甲基)苯基]-N⁴-(4-氨基苯基)-1,4-苯二胺 (25)

将硝基化合物23(0.505g，1.2mmol)溶解于20mL乙醇中。向暗红色溶液中添加1.5g(7.91mmol)氯化亚锡，然后添加5mL浓HCl。将所得溶液回流，直到所有硝基化合物被消耗，如从TLC明显的。冷却后，将反应混合物用水稀释，并通过添加20％NaOH水溶液将溶液的pH调节至10。将浑浊混合物用乙酸乙酯萃取，并将有机层用水、盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到呈米白色粉末的标题化合物。产率：0.34g(72％)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.25(d,J＝7.6,2H),7.12(d,J＝7.6,2H),6.99(d,J＝8.1,2H),6.78–6.67(m,8H),6.49(d,J＝7.0,4H),5.66(s,1H),4.56(s,2H),4.15(d,J＝5.4,2H),2.27(s,3H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ143.1,142.5,137.9,135.8,134.9,134.7,129.1,127.6,120.0,119.8,117.5,117.3,115.3,113.7,104.9,47.5,21.0。

实施例11

合成对称封端的NHR/NHR封端的二聚体(26-29)

表1.

N⁴-[(4-硝基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-硝基苯基)甲基氨基]苯基]苯-1,4-二胺(26)

4-[(E)-(4-硝基苯基)亚甲基氨基]-N-[4-[(E)-(4-硝基苯基)亚甲基氨基]苯基]苯胺

使用以上试剂和通用程序3，其中将反应混合物在室温下搅拌14小时，得到标题化合物，分离呈绿色粉末的标题化合物。

产率：0.4g(95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.87(2H,s,C–H亚胺),8.71(1H,s,N–H胺),8.36(4H,d,J＝8Hz,C–HAr),8.16(4H,d,J＝8Hz,C–HAr),7.42(4H,d,J＝8Hz,C–HAr),7.20(4H,d,J＝8Hz,C–HAr)。¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ155.08(C亚胺),148.85,143.14,142.78,142.70,129.59,124.52,123.64,117.75。

FT-IR(波数，cm^-1)：νN-H(st)3416,νN-H(b)1598,νC＝C(st)1512,νC＝N(st)1621,νN-O(st)1512,1332。ESI MS:m/z 465.2。

PPD衍生物11：N⁴-[(4-硝基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-硝基苯基)甲基氨基]苯基]- 苯-1,4-二胺(26)

使用通用程序4由相应亚胺合成标题化合物。

产率：0.3g(82％)。¹H NMR(400MHz,DMSO):δ8.18(d,J＝8.7,4H),7.61(d,J＝8.7,4H),6.87(s,1H),6.66(d,J＝8.7,4H),6.43(d,J＝8.8,4H),5.91(t,J＝6.2,2H),4.34(d,J＝6.1,4H)。¹³C NMR(100MHz,DMSO):δ150.1,148.8,142.0,136.2,128.6,123.9,118.9,113.9,47.2。

N⁴-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-乙氧基苯基)甲基氨基]苯基]苯-1,4-二胺 (27)

4-[(E)-(4-甲氧基苯基)亚甲基氨基]-N-[4-[(E)-(4-甲氧基苯基)亚甲基-氨基]苯基]苯胺

使用以上试剂和通用程序3，其中将反应混合物在室温下搅拌14小时，得到标题化合物，分离呈金黄色结晶粉末的标题化合物。

产率：0.45g(84％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.57(2H,s,C–H亚胺),8.34(1H,s,N–H胺),7.86(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.24(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.12(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.06(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),3.83(6H,s,OCH3)。¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ161.44(C亚胺),156.37,143.49,141.64,129.94,129.39,122.17,117.19,114.19,55.33(OCH3)。FT-IR(波数，cm^-1)：νN-H(st)3421,νC-H(st)2959–2839,νN-H(b)1604,νC＝N(st)1621,νC＝C(st)1512,νC-O(st)1250,1028,νC＝C(b)844。ESI MS:436.6(M+H)⁺。

PPD衍生物12：N⁴-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N¹-[4-[(4-乙氧基苯基)甲基氨基]-苯 基]苯-1,4-二胺(27)

使用通用程序4由相应亚胺合成标题化合物。

产率：0.37g(88％)。¹H NMR(400MHz,DMSO):δ7.27(d,J＝8.6,4H),6.87(d,J＝8.6,4H),6.81(s,1H),6.67(d,J＝8.7,4H),6.47(d,J＝8.7,4H),5.54(t,J＝6.0,2H),4.11(d,J＝6.0,4H),3.73(s,6H)。¹³C NMR(100MHz,DMSO):δ150.5,142.7,135.9,132.9,128.9,118.8,114.1,113.9。

N⁴-(对甲苯基甲基)-N¹-[4-(对甲苯基甲基氨基)苯基]苯-1,4-二胺(28)

4-[(E)-对甲苯基亚甲基氨基]-N-[4-[(E)-对甲苯基亚甲基氨基]苯基]苯胺

使用以上试剂和通用程序3，其中将反应混合物在室温下搅拌14小时，得到标题化合物，分离呈金黄色结晶粉末的标题化合物。

产率：0.36g(80％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.62(2H,s,C–H亚胺),8.40(1H,s,N–H胺),7.81(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.32(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.28(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.13(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),2.38(6H,s,CH3)。¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ157.32(C亚胺),143.78,142.34,142.25,134.46,129.84,128.76,122.83,117.50,21.61(CH3)。FT-IR(波数，cm^-1)：νN-H(st)3421,νC-H(st)2959–2839,νN-H(b)1604,νC＝N(st)1621,νC＝C(st)1512,νC-O(st)1250,1028,νC＝C(b)844。ESI MS:404.6(M+H)⁺。

PPD衍生物13：N⁴-(对甲苯基甲基)-N¹-[4-(对甲苯基甲基氨基)苯基]苯-1,4-二胺 (28)

使用通用程序4由相应亚胺合成标题化合物。

产率：0.45g(90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO):δ7.23(d,J＝7.9,4H),7.10(d,J＝7.9,4H),6.79(s,1H),6.66(d,J＝8.7,4H),6.45(d,J＝8.7,4H),5.58(t,J＝6.1,2H),4.13(d,J＝5.9,4H),2.34(s,6H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO):δ142.7,138.1,135.9,135.8,129.2,127.7,118.8,113.8,47.6,21.1。

4-[[4-[4-[(4-羟基苯基)甲基氨基]苯胺基]苯胺基]甲基]苯酚(29)

4-[(E)-[4-[4-[(E)-(4-羟基苯基)亚甲基氨基]苯胺基]苯基]亚氨基甲基]苯酚

使用以上试剂和通用程序3，其中将反应混合物在室温下搅拌14小时，得到标题化合物，分离呈黄橙色结晶粉末的标题化合物。

产率：0.56g(75％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.03(2H,s,O–H),8.51(2H,s,C–H亚胺),8.31(1H,s,N–H胺),7.75(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar),7.25(4H,d,J＝6.5Hz,C–H Ar),7.11(4H,d,J＝7Hz,C–H Ar),6.88(4H,d,J＝8Hz,C–H Ar)。¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ160.61(C亚胺),157.16,144.19,142.00,130.67,128.42,122.57,117.69,116.07)。ESIMS:408.5(M+H)⁺。

PPD衍生物14：4-[[4-[4-[(4-羟基苯基)甲基氨基]苯胺基]苯胺基]甲基]苯酚 (29)

使用通用程序4由相应亚胺合成标题化合物。

产率：0.58g(67％)。¹H NMR(300MHz,DMSO):δ9.22(s,2H),7.14(d,J＝8Hz,2H),6.81–6.66(m,9H),6.47(d,J＝8Hz,4H),5.45(t,J＝5.4Hz,2H),4.05(d,J＝5.1Hz,4H)。¹³CNMR(100MHz,DMSO):δ156.4,142.7,135.8,131.0,128.8,122.4,118.7,115.3,113.7,104.9,47.4。

实施例12

合成PPD衍生物15：己基-2,5-二氨基苯甲酸酯(30)

己基-2-氨基-5-硝基苯甲酸酯

将5-硝基邻氨基苯甲酸(1.05g，5.7mmol)溶解于保存在惰性气氛下的DCM和THF的1:1混合物中，并且将EDC(2.2g，11.5mmol)、DMAP(0.35g，2.9mmol)和正己醇(0.7mL，5.6mmol)依次添加到黄色溶液中。将混合物在室温下剧烈搅拌3小时。在反应过程期间，形成许多黄色沉淀物，其缓慢溶解。在减压下除去挥发物，并将残余物溶解于DCM中，并将溶液用饱和NaHCO₃溶液洗涤三次、用水并且最终用盐水溶液洗涤三次。蒸发溶剂得到呈红色油的粗产物。在通过使用60％dcm/己烷混合物的柱色谱法纯化后，分离呈嫩黄色固体的纯化合物。

产率：1.4g(90％)。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.59(d,J＝2.7,1H),8.09(dd,J＝9.3,2.8,1H),7.85(s,2H),6.90(d,J＝9.4,1H),4.27(t,J＝6.6,2H),1.73(t,J＝7Hz,2H),1.44–1.36(m,2H),1.35–1.29(m,4H),0.88(t,J＝6.9,3H)。¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ165.9,155.8,135.1,128.8,128.1,116.7,107.6,64.7,30.8,28.0,25.1,21.9,13.8。

PPD衍生物15：己基-2,5-二氨基苯甲酸酯(30)

将过量的氯化锡(II)(2.3g，12mmol)添加到0.8g(3mmol)的2-氨基-5-硝基苯甲酸己酯的乙醇溶液中。将所得混合物回流24小时。在冷却后，蒸发溶剂，并将残余物带入水中，并在添加K₂CO₃水溶液的情况下将混合物的pH调节为8。用乙酸乙酯萃取混合物，并且用水并最终用盐水溶液快速洗涤有机层。在溶剂蒸发后，将残余物在真空下干燥以得到标题化合物。产率：0.6g(84％)。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.00(d,J＝3Hz,1H),6.69(dd,J＝8.7Hz,2.7Hz,1H),6.57(d,J＝8.6Hz,1H),5.87(s,2H),4.43(s,2H),4.17(t,J＝6.6Hz,2H),1.67(五重峰,J＝7Hz,2H),1.43–1.35(m,2H),1.35–1.28(m,5H),0.88(t,J＝7Hz,3H)。¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ168.1,143.7,138.3,123.7,118.1,114.3,110.1,64.0,31.4,28.8,25.7,22.5,14.4。

实施例13

合成PPD衍生物16：(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯(31)

(N¹-己基)(2-己氧基)-4-硝基苯胺

通过类似于制造以上2-己氧基-4-硝基苯胺的方法(实施例4)获得标题化合物，除了使用41mmol的1-溴己烷和K₂CO₃。

通过用20％乙酸乙酯和己烷混合物洗脱，从反应混合物中分离出化合物。蒸发流出物后获得嫩黄色粘性液体。

产率：3.2g(76％)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.81(dd,J＝9.0,2.4,1H),7.53(d,J＝2.5,1H),6.61(d,J＝9.0,1H),6.35(t,J＝5.4Hz,1H),4.07(t,J＝6.4,2H),3.23(dd,J＝13.6,6.6,2H),1.82–1.70(m,2H),1.54(m,2H),1.44(m,2H),1.38–1.23(m,10H),0.87(q,J＝6.8,6H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ145.3,144.4,135.4,120.2,106.8,105.6,68.8,42.43,31.3,28.7,28.6,26.4,25.5,22.4,14.2

PPD衍生物16：(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯(31)

遵循对于合成2-己氧基-1,4-二氨基苯6的方法，在2mL浓HCl存在下使用3g(15.8mmol)氯化锡(II)进行(N¹-己基)(2-己氧基)-4-硝基苯胺(1g，3.1mmol)的还原。

产率：0.89g(99％)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ6.31(d,J＝8.2,1H),6.21(d,J＝2.1,1H),6.06(dd,J＝8.1,1.6,1H),4.27(s,2H),3.84(t,J＝6.3,2H),2.93(t,J＝6.7,2H),1.77–1.64(m,2H),1.57–1.46(m,2H),1.47–1.37(m,3H),1.30(m,10H),0.87(q,J＝6.8,6H)。¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ147.2,139.8,129.9,111.9,106.7,100.6,67.9,44.6,31.5,31.4,29.4,29.1,26.7,25.7,22.5,22.4,14.2

实施例14

通过氧化PPD和PPD衍生物2-5(分别为化合物4-6和14)形成的产物

氧化使用3％H₂O₂在含氨介质中进行并且通过多重反应监测质谱法(MRM)监测。

样品制备程序

向2mL Eppendorf管中添加0.2mL的DPBS缓冲液、2μL的100μM ANP(IS)、40μL的浓氢氧化铵(30％)和1.0mL的亚甲基氯。然后将管涡旋混合3min，并除去上清液。再次用1mL的亚甲基氯重复萃取。在样品制备过程期间，将样品保持在干冰中，以避免PPD氧化为代谢物班德罗斯基碱。然后将有机层转移到2mL Eppendorf管中，并在35℃下使用TurboVap体系在3-5psi的压力下在氮气流下蒸发至干。将经干燥的萃取物于200μL的乙腈中的0.1％甲酸中重构，并将5μL注射到LC-MS/MS体系中。

多重反应监测质谱法条件

在多重反应监测质谱法(MRM)下，对于PPD和被测试的化合物所保持恒定的化合物独立参数如下：气帘气(CUR)：15psi；离子源气体1(GS1，屏蔽气体)45psi；离子源气体2(GS2，干燥气体)45psi；离子喷射电压(ISV)：5000V；碰撞气体(CAD，氮气)：介质；开启的接口加热器(Ihe)；四极杆1和四极杆3被维持在单位分辨率下。所有化合物设定的停留时间为100ms。

校准曲线制备

通过将1.8mg PPD游离碱溶解于1665μL Milli-Q水中，制备浓度为10mM的PPD储备溶液。通过将2mg每种分析物溶解于2mL甲醇中，分别制备MAPPD、BB、DAPPD的储备溶液(1mg/mL)。通过将每种分析物的储备溶液稀释至最终浓度来制备工作溶液。使用不同的储备标准品以相同的浓度制备品质控制(QC)样品。在杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中制造用于PPD、MAPPD、BB和DAPPD的工作校准物(10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.005μM、0.0001μM、0.00001μM、0.000005μM)。对于所有分析物还制备了在DPBS中浓度为7.5、0.05和0.00005μM的低、中等和高的品质控制(LQC、MQC和HQC)。通过用甲醇稀释乙酰苯胺的储备溶液(1.0mg/mL)来制备含有1μM的ANP的工作内标物。对于二聚体、三聚体和其代谢物的储备溶液和工作溶液以与PPD溶液相同的方式制备。将标准溶液储存在-20℃下直至使用。

方法验证

方法根据USFDA指南进行了验证。评定验证参数，诸如特异性、灵敏度、线性、批间和批间分析精度、精确度、回收率、稳定性，以评估方法完整性。然后将此方法用于下面的皮肤渗透实验中。

PPD氧化

在含氨介质中，用3％H₂O₂进行PPD的氧化。使用多重反应监测质谱法监测反应。表2中反映了PPD和代谢物的MRM转换。调节了化合物依赖性参数，诸如碰撞能量(CE)和去簇电位(DP)，以提供最高的灵敏度。

表2.

*V：伏特，CE：碰撞能量，DP：去簇电位，EP：入口电位，CXP：碰撞出口电位。

图2示出了从PPD氧化中分离出的主要产物是PPD的三聚体形式，通常称为班德罗斯基碱(BB,32)。其被分离为深棕色黑色固体，在水中具有有限的溶解度。除了BB之外，还分离了少量的对硝基苯胺(33)和4,4’-二氨基偶氮苯(34)。

氧化PPD衍生物1-5(分别为化合物2、4-6和14)

在含氨介质中，用3％H₂O₂进行PPD衍生物1-5(分别为化合物2、4-6和14)的氧化。再次，使用多重反应监测质谱法监测每种反应。

表3中列出了PPD衍生物1(化合物2)和代谢物的MRM转换以及化合物依赖性参数-如图3提供了化合物2的氧化的代表性MRM。表4-7中列出了对于PPD衍生物1-5及其氧化产物的各种的MRM转换和化合物依赖性参数。对于每种材料，调节了化合物依赖性参数，诸如碰撞能量(CE)和去簇电位(DP)以提供最高的灵敏度。

表3

表4

表5

表6

表7

氧化二聚体(4,4’-二氨基联苯基(2))产生多种产物。在3％H₂O₂存在下在甲醇中搅拌过夜，产生紫粉色混合物。反应混合物的UV-vis研究示出在672nm处出现明显的带，指示吲达胺染料35的形成。在类似条件下氧化三聚体(4)得到深蓝色有色溶液，这归因于单醌二胺物质的形成，经常被称为翠绿亚胺碱(36)。

实施例15

头发染色

头发漂白过程

Schwarzkopf BlondMe Premium Lift 9+漂白粉和Schwarzkopf BlondMe 12％/40vol显影剂溶液购自亚马逊并且无需进一步纯化而使用。简言之，将两种制剂就重量:体积而言以1:2的比率彻底混合。然后将漂白溶液施加到未染色的黑色头发上(包裹在铝箔中以增强漂白过程)，并且保持45min。之后，在每个漂白过程之间用去离子水冲洗头发，总共4个漂白步骤。然后将漂白的头发风干过夜。

染料制剂

对于每种PPD衍生物，制造了PPD衍生物和间苯二酚的等摩尔混合物。使用去离子水中的20％Na₂CO₃将染料的pH调节至pH 9.5-10，然后添加H₂O₂。表8中提供了染料溶液的组成的细节。然后使最终的染料制剂保持20min，以便显影颜色。

配制品的内容物	染料组成
		PPD/PPD衍生物(200mM)	2.25mL(最终浓度：90mM)
间苯二酚(250mM)	1mL(最终浓度：90mM)
		去离子水	1.50mL
H2O2	0.15mL(3％)
		用20％Na2CO3溶液调节的pH	pH 9.5-10
总体积	5mL

表8

染色过程

对于每种染料样品，使用大约12cm长的漂白的头发(如上制备的)。将漂白的头发样品浸入染色溶液20min。然后将每个头发样品从它们已所经受的染料制剂中移出并风干30min。然后将其用去离子水洗涤以除去任何过量的染发剂。然后将头发样品用SilkproVitAir系列Daily Balance洗发剂洗涤两次，并用Silkpro VitAir系列Daily TreatmentMasque(护发素)进一步处理5min。然后将染色的头发样品风干过夜。避免吹干，吹干不会就着色而言提供任何差异，而是因为吹干会影响头发的外观，使头发卷曲且较不光滑。

大规模染色

根据表9，选择被发现已使头发样品着色的PPD衍生物，并且制备额外的头发样品(％75灰色头发)和染料。

表9

使用长为大约35cm并且重量为1g的头发样品，并且使用以上陈述的类似的头发染色过程进行染色。

从头发样品中萃取PPD和衍生物

在与第1天(即染色当天)、第2天和第7天相应的时间点，根据2b.1.4中的程序从染色的头发样品上剪下大约100mg染色的头发。然后将头发样品溶解于2mL的20％乙醇中的1.5M KOH中。也将100mg的空白头发样品(未漂白的未染色的头发以及漂白的未染色的头发)剪下并溶解以用作对照。为了从头发样品中完全萃取染发剂，将100mg的头发溶解过夜。然后将样品通过液氮冷冻并冷冻干燥过夜。然后将冻干的样品用5mL甲醇重构，以6000rpm离心10min，并萃取出上清液用于进一步分析。

用于定量PPD和PPD衍生物的LCMS方法开发

为了对萃取的样品进行定性和定量分析，采用LCMS检测萃取的头发样品中PPD衍生物/PPD衍生物-间苯二酚配合物的存在。LCMS/MS样品分析使用与AB SCIEX QTRAP 5500串联质谱(MS/MS)体系(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)连接的Agilent 1290Infinity超高压液相色谱(UHPLC)(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA,USA)进行。样品注射体积是5μL，并且在维持于45℃下的ACQUITY UPLC BEH C18,1.7μM,2.1×100mm柱(Waters,Mildord,MA,USA)以及4℃下的样品上进行分离。溶剂A由Milli-Q水中的0.1％[v/v]甲酸组成，而溶剂B由乙腈中的0.1％[v/v]甲酸组成。将溶剂以0.4mL/min的流速泵送到柱中。PPD的梯度程序如下：将95％B的初始梯度维持0.5min，在0.5min内减少至50％B，维持1min，并且在0.5min内增加至95％B。使柱平衡1min，使得总运行时间为3min。注射体积是5.0μL。为防止化合物积聚在针上，将50％的ACN中的甲醇用作针洗涤，每个样品持续30s。

PPD和衍生物的质谱法参数报告于表2-7中。

制备用于UV和LC-MS的PPD和所选PPD衍生物的校准曲线

PPD的标准浓度为0.0001-1000μM，使用10mM的储备溶液制备了所选PPD衍生物。将2μL的每种上述浓度转移到2mL Eppendorf管中，并且使用甲醇中的0.1％甲酸使体积达到200μL，以制造100x稀释的浓度。2μL的内标物，添加浓度100μM的ANP使得ANP的最终浓度是1μM。然后将100μL的每种标准溶液浓度转移到96孔板中，并在4℃下储存直至LCMS分析。使用相同浓度绘制UV光谱学校准曲线。测量对比PPD和PPD衍生物的浓度的吸光度。使用校准曲线，从萃取的头发样品中获得PPD和PPD衍生物的浓度，并绘制图表以观察7天内染发剂浓度的任何变化。

通过UV光谱学定量萃取的头发样品中的PPD和PPD衍生物

然后使用Shimadzu UV-1800 UV-VIS分光光度计测量每种化合物的UV吸光度波长。然后将大约2mL的萃取的样品用移液管移到石英比色杯中，并使用获得的波长测量浓度的吸光度。表10列出了在不同配制品类型中获得的PPD和PPD衍生物的波长。

表10：在不同配制品类型中的PPD和PPD衍生物的波长。

染色实验结果

头发染色实验示出了由PPD衍生物1-5产生的染料能够赋予颜色。然而，对于所有PPD衍生物，主要问题是在水中的溶解度受到限制，并且要求有机溶剂来溶解它们。仅衍生物1示出了在水中在10％甲醇的混合物中的溶解度，而其他衍生物要求完全有机溶剂。因此，PPD衍生物1-5作为HCl盐形式合成以增加其水溶解度，并也被选择以进行大规模染色以调查多次洗涤后的染料持久性。

在用以上化合物进行大规模染色时，发现与漂白的头发色调形成对照，衍生物1和2产生鲜艳的颜色(参见表11)。这开创了将衍生物1和2掺入染发剂制剂中以提供持久的明亮颜色的可能性。

注意，表11中报告的颜色是特别针对漂白的头发的。在用75％灰色头发的实验中，染料必须经受用3％H₂O₂的氧化以提供与表11第二列中所报告的颜色相同的颜色。换句话说，假如染料配制品包含H₂O₂(根据表9中列出的类型II染料组合物)，则PPD衍生物也使灰色头发着色。这是因为使灰色头发染色更困难，并且需要使用过氧化物来使染色发生。

表11

通过LCMS的定量的结果

使用校准曲线，确定了PPD/PPD衍生物的量，并将其报告在表12中。结果示出，尽管许多次洗涤头发样品，但由于所有三种化合物的浓度保持相当恒定，因此PPD以及衍生物1和2仍然能够保留在头发样品中。

表12：使用LCMS来自萃取的头发样品的化合物的定量。

通过UV光谱学的定量的结果

如表13中示出的，使用间苯二酚和PPD或其衍生物的混合物染色的染色的头发样品各自示出具有波长变化的不同的颜色。这可能是由于在间苯二酚与PPD及每种其衍生物之间形成的配合物不同。然后测量萃取的头发样品中形成的配合物的UV吸光度。对于所有三种化合物，UV吸光度保持相当恒定，支持以上在表10中获得的数据，并因此进一步支持所有三种化合物/配合物都能够保留在头发样品中的事实。

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表13

从头发染色实验中，PPD衍生物1-5可以被视为用于头发染色的PPD的潜在的替代化学品。与漂白的头发形成对照，衍生物产生鲜艳的颜色，并且来自UV光谱学和LCMS的结果已经证明，即使重复洗涤，它们仍能够保留在头发中。事实上，即使不存在间苯二酚和过氧化氢，PPD衍生物化合物本身也能在漂白的头发上单独产生强烈的颜色。从长远来看，这可能是有益的，因为已知过氧化氢会损害头发，并且间苯二酚也是潜在的致敏剂。

颜色强度测量

表14呈现了，与PPD(表中化合物1)和使用单独衍生物(类型A)、具有氧化剂过氧化氢的衍生物(类型B)以及具有成色剂间苯二酚的衍生物(类型C)的各种PPD类似物的头发染色性能相比，本发明的组合物中的PPD、PPD衍生物1-5的头发染色性能的结果。对于这些评估，使用等摩尔量的主要染料中间体(0.09M)和偶联剂(0.09M)(例如，参见表9)。将主要中间体和偶联剂与3％vol的过氧化氢混合并老化45min以使反应发生。随后将混合物在室温下以30-45min的处理时间段施加到漂白的头发样本的共混物上。其后，将染色的头发用水和洗发剂冲洗并干燥。

使用Delfin-Skin Color Catch-Colour强度色度计测量头发的颜色。使用此仪器测量以下参数。

L*------指示头发颜色的亮度，范围为从黑色至白色(0-100)

a*------是绿色至红色调的轴(-128至+127)

b*------是蓝色至黄色调的轴(-128至+127)

L₀、a₀、b₀-----从天然头发测量的值

在表14A中，L*、a*和b*表示标准Hunter三刺激值，其测量颜色的深度和色调。在hunter方法中，参数a*和b*可以为正或负，并限定头发的色品条件。类似地，正的b值指示黄色度，而负的b值指示蓝色度。L*参数是颜色强度的量度，并且具有0(纯黑色)至100(纯白色)的值。

颜色色调的差是通过ΔH，测量的，以及总色差，如通过ΔE，/>测量的。

结果

表14A：PPD相对于本发明的PPD取代的衍生物(PPD类似物)在没有任何氧化剂(A)、具有氧化剂H₂O₂(B)、具有偶联剂间苯二酚(C)的情况下的头发染色性能

根据红色-绿色-蓝色(RGB)索引，将值如下在表14B中进行转换。

表14B：RGB索引。类型：A：仅衍生物，B：具有H₂O₂的衍生物，C；具有间苯二酚的衍生物。

如从表14A和14B中可以看出，单独的PPD的值接近于漂白的头发，意指它不能独立地给头发着色。相反地，当与其他试剂组合使用时，它提供强烈的颜色(类似于天然黑色头发)。即使没有由过氧化氢提供的额外的氧化，本文使用的测试PPD衍生物也示出了与天然黑色头发可比较的RGB索引值。这表明了在单个瓶中具有一种产物的可行性-不需要过氧化物或偶联化合物，诸如间苯二酚。

实施例16

评定皮肤穿透以及PPD类似物与蛋白质和酶的相互作用

方法

皮肤渗透/穿透

NUS Department of Surgery慷慨地提供了猪耳朵。将耳朵在-80℃下冷冻直至使用(最长达3个月)，并在实验前一天在室温下解冻。在实验前，使用Acculan^TM 3Ti皮刀(Aesculap,Inc.,B.Braun,USA)将皮肤与软骨分离，并切成～1.0mm的厚度。

将PPD和衍生物以1％w/v溶解于去离子水中。用氩气吹扫PPD和PPD衍生物1-5溶液，以使供体溶液的氧化最小化。

使用浸入于37℃水浴中的竖直Franz扩散池(PermeGear,USA)进行皮肤穿透研究。供体和受体的体积分别为900L和5mL；穿透的平均表面积为0.64cm²。将皮肤片插入Franz池后，在受体隔室中用PBS平衡皮肤45min。平衡后，使用Aquaflux AF300(Biox,UK)测量皮肤的经表皮水分损失(TEWL)，以评定皮肤角质层屏障的完整性。然后将由PPD或衍生物1-5(每个n＝3Franz池)组成的供体溶液添加到供体隔室中，并进行穿透实验8h。用磁力搅拌器连续搅拌受体溶液。在固定的时间点，从每个池的受体溶液中取出200μL等分试样，并用200μL新鲜PBS将受体溶液装满。在实验结束时，去除供体和受体溶液并拆除池。为了PPD、PPD衍生物1-5的质量平衡的目的，收集了其外表面的皮肤片和拭子，并将其存储在乙腈中，用于PPD或衍生物1-5萃取。还收集了供体溶液以及用于彻底洗涤Franz池的各部分的PBS。

通过LCMS测量所有渗透和质量平衡样品中的PPD、PPD衍生物1-5和代谢物的浓度。PPD稳态通量和渗透系数是通过将稳态下Fick第二扩散定律的解拟合到每个实验累积量曲线的线性部分来计算的。

LCMS

经验证的方法LCMS应用于定量来自皮肤渗透研究样品中的PPD、PPD衍生物1-5和代谢物。图3和图4示出了用于从皮肤渗透研究实验鉴定PPD和PPD衍生物1和2和代谢物的LCMS谱。

拉曼光谱学

将PPD和衍生物在去离子水中的溶液(1％w/v)施加于PB组(IMB,A*STAR)中开发的器官型(OTC)皮肤样品中。在室温下30min暴露后，使用PBS将溶液从OTC片上轻轻洗掉。将OTC片置于共焦拉曼光谱仪(gen2-SCA，RiverD，荷兰)的窗口上，以在指纹(400-1800cm^-1)范围中进行光谱学。获得溶液的参考光谱，并将其并入分析软件(SkinTools 2.0，RiverD，荷兰)中，以对皮肤OTC拉曼光谱进行回归拟合。

结果与讨论

皮肤渗透

表15中报告了猪耳朵皮肤片的厚度和TEWL值。两个参数值在整个皮肤片中是一致的。TEWL值比在已发表的体外实验中使用的13gm^-2h^-1的截止值稍高一些。我们期望更精确的皮肤处理和更长的平衡时间(1小时)以进一步降低TEWL值。

表15：在渗透实验之前测量厚度和TEWL值。皮肤片#1-3用于PPD渗透，皮肤片#4-6用于PPD衍生物1。

在皮肤渗透后检测到PPD及其代谢物，然而相对于时间，其中存在不同的量的趋势。PPD及其代谢物在皮肤暴露于PPD的首次30min内已经存在，并且这可能归因于PPD通过皮肤的快速渗透。

图7示出了在8h渗透实验后获得的PPD和相关代谢物的累积量分布图。Franz池中PPD的质量平衡(>99％)指示，每个Franz池中都回收了大部分PPD和班德罗斯基碱。-由图7中的数据计算的PPD运输参数总结于表16.1中。通过皮肤到受体中的BB、DAPPD和MAPPD渗透显著小于PPD渗透。

表16.1：PPD稳态运输参数平均值和标准偏差(括号)。K_s/d：皮肤-供体分配系数，D_s：皮肤中的扩散系数，t_滞后：滞后时间，J_ss：稳态通量，k_p：稳态渗透系数。

图8并置了PPD衍生物及其代谢物(单乙酰基和二乙酰基)渗透(a.衍生物1、b.衍生物2、c，衍生物3、d.衍生物4)

图9示出了PPD对比PPD衍生物的累积量对比分布图。如图9中示出的，在整个实验过程中，PPD显示了比MEPPD更高程度的渗透。事实上，在任何时间点，没有衍生物以比PPD更高的水平渗透。重要地，在8h实验结束时，PPD具有在被测试的化合物之中最高的皮肤渗透程度，为ME-PPD(其示出第二高的皮肤渗透程度)的约7.5倍大。考虑到LogP和分子量(其是被报告为与皮肤渗透程度呈负相关的因素，例如，参见Magnusson,B.M.,et al.,Journalof Investigative Dermatology,2004.122(4):p.993-999)的增加，MEPPD示出了比PPD减少8倍的渗透。相对于其他化合物，MEPPD具有第二高的皮肤渗透(参见表16.3)，并且这是由于其熔点(88-90℃)的显著降低。已知的是，在熔点与皮肤渗透性之间存在反比关系，因为具有较低熔点的化合物在皮肤脂质中倾向于具有较高的溶解度，从而导致增加的经皮吸收(例如，参见Yuan,X.and A.C.Capomacchia,Journal of Pharmaceutical Sciences,2013.102(6):p.1957-1969；以及Golla,S.,et al.,Chemical Biology and Drug Design,2012.79(4):p.478-487)。

关于我们的化合物系列，PPD在邻位(化合物3-6和15)的链长增加和对称胺封端的PPD衍生物1和2的取代可能导致渗透的若干倍数的降低。在我们的PPD系列中，增加的logP(>1.5，除了PPD 1)、分子量(>200，除了PPD 1)和熔点(≥150℃，对于所有我们的化合物)(表16.3)的效果，与在整个实验的8h持续时间遍及皮肤膜的渗透的降低相关。如表16.2中示出的，PPD 1渗透比PPD小51倍，PPD 2渗透比PPD小93倍。PPD衍生物3、4渗透比PPD小360-503倍。PPD 5不可渗透通过猪皮肤，而PPD 6和15渗透比PPD小约2个数量级。

表16.2.PPD和PPD衍生物的质量平衡分布。

化合物	logP o/w	Mol Wt	熔点(℃)a	HBA	HBD	PSA
							PPD	-0.61	108.14	145.3-147.3(±0.26-0.11)	2	4	52.04
PPD 1	0.93	199.25	158.7-160.2(±0.78-0.15)	3	5	64.07
							PPD 2	1.86	290.36	>300	4	6	76.1
PPD 3	2.56	236.35	225-226(±0.3-0.4)	3	4	61.27
							PPD 4	2.14	208.3	204.2-205.2(±0.36-0.2)	3	4	61.27
PPD 5	2.21	299.41	182.5-183.5(±0.2-0.3)	4	4	78.34
							PPD 6	3.18	327.41	180.0-181.0(±0.1-0.2)	3	3	47.28
PPD 15	2.94	236.31	176-177.0(±0.2-0.3)	3	3	36.09
							MEPPD	-0.90	152.19	88.3-90.3(±0.25-0.35)	3	4	61.27

表16.3.PPD衍生物的理化特性。logPo/w：化合物在辛醇/水中的分配系数。HBA：氢键受体；HBD:氢键供体；PSA:极性表面积。^a一式三份进行实验。

比较了PPD和PPD衍生物实验结束时猪皮肤的视觉方面。虽然暴露于PPD的皮肤由于形成了班德罗斯基碱而已经变成棕色或黑色颜色，但是暴露于衍生物1-4的皮肤仍未染色，其中没有形成Bandrowki碱。

拉曼光谱学

图10示出了PPD和-PPD 1的参考拉曼光谱。然而，PPD光谱在不同的波数处示出峰，与文献数据一致，二聚体光谱是宽的，没有任何不同最大值。二聚体光谱是聚合化合物中典型的，其中多个3D分子构型会引起各种振动和模糊的拉曼光谱。

在皮肤OTC中，二聚体产生与溶液定性地相似的光谱，从而遮蔽每个皮肤深度处与皮肤相关的任何拉曼峰(图11)。需要进一步的工作来确定是否可以对二聚体和固有皮肤光谱进行去卷积，以及三聚体是否给出相似的分布图。

实施例17

HaCaT细胞上的体外细胞细胞毒性测定

材料

HaCaT(人类，成年，低钙，高温，人类成年皮肤角质形成细胞)细胞是从IMB(医学生物研究院)皮肤细胞库获得的。胎牛血清(FBS)、杜尔贝科氏的极限必需培养基(DMEM)和胰蛋白酶EDTA溶液购自GE healthcare life sciences,Utah。青霉素/链霉素、二甲亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)来自Fisher Scientific(新加坡)。对苯二胺(PPD)购自Sigma Aldrich(新加坡)。PPD类似物，诸如二聚体、三聚体、乙基己基对苯二胺(EHPPD)、己基对苯二胺(HPPD)、班德罗斯基碱(BB)是内部合成的。

细胞培养和温育

如在文献中描述的，基本上使用MTT测定确定细胞活力。HaCaT细胞在具有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中生长。将T-75cm²培养瓶中的细胞用5％CO₂在37℃下在湿润培养箱中温育。使HaCaT细胞生长至预期的汇合，并然后通过用0.25％胰蛋白酶/EDTA胰酶消化细胞来收获它们，并在37℃下温育5min以获得完全的细胞脱离。在温育后，将细胞团块再悬浮，并用1x PBS洗涤两次。对1x PBS中的细胞悬浮液进行计数并调节至1x10⁵/mL。将HaCaT角质形成细胞悬浮液(100μL，在1x PBS中，细胞浓度为1x 10⁵细胞/mL)和测试溶液(100μL，在milli-Q中)合并在两个96孔板的每个孔中。通过用1x PBS连续稀释储备溶液来制备具有期望浓度的测试溶液。

对于细胞毒性实验，将细胞以200ul培养基中5x 10³的密度接种到96孔板的每个孔中。对于每种浓度，将细胞接种为三组，每组四个重复。在温育24h后，将细胞用PBS洗涤，并用200ul的含10％FBS的DMEM培养基，与对于PPD和类似物1-5以及标准物范围是从500μM至1.9μM的连续稀释的不同浓度的测试化合物一起进行培养72h。然后除去培养基，并添加PBS中的100μl的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物](1mg/ml)(Alfa Aesar，新加坡)。在4h温育结束时，将板从培养箱中移出，并将板摇动5min。使用Bio-Tek酶标仪确定570nm处的吸光度。由吸光度读数计算细胞活力率，并将其表示为对照值(未经处理的细胞)的百分比。

对于这些研究，建立通用的阳性对照具有挑战性，因为对于大多数测试的化合物而言，阳性对照对HaCaT细胞的效力较弱。如表17中示出的，总共测试了5种阳性对照化合物的细胞毒性特性。在测试的化合物之中，辛伐他汀(11)被选作这项研究的阳性对照，其IC₅₀值为9.15μM，其他化合物由于溶解度问题和较弱的抑制效力而被忽略。HaCaT细胞中PPD染料化合物的浓度-响应曲线的实例如图6中示出的。

/>

表17(*9.15μM的IC₅₀是基于旧批次的辛伐他汀，这似乎示出稳定性问题。

当用新批次的辛伐他汀代替时，始终获得28.6μM的IC₅₀值。)

结果与讨论

图6示出了暴露于PBS中几种浓度的PPD及其类似物连同没有测试化合物的对照的人皮肤HaCaT角质形成细胞的活力。基于在图6中示出的即时细胞活力数据以及表17中列出的细胞活力百分比，PPD 1示出了49.3μM的IC50值。与显示23.5μM的IC50值的PPD相比，这个IC50值几乎增加为2倍，表明从单体(PPD)到二聚体(PPD 1)的增加具有较小的细胞毒性。通过其他单体化合物PPD 3和PPD 4进一步证实了这一点，其中IC50为31.0和34.8μM：它们的分布介于PPD与二聚体PPD 1之间，表明邻位处的取代基对细胞有益，尤其是当使用长链时，尽管不如二聚体结构有利。进一步添加芳香族基团(从二聚体到三聚体)被证明对细胞有害：确实，三聚体PPD 2展示了高细胞毒性，其中最低IC50值为4.14μM，与PPD 1相比，导致了细胞毒性分布的6倍增加。毫不奇怪，对于性质上也是三聚体的BB(IC50值为6.09μM)观察到了可比较的结果。另一方面，与PPD 4不同的在NH2基团之一处被烷基链额外取代的PPD 16具有139.5μM的高IC50值，指示氨基基团应被取代以降低细胞毒性。有趣地，与PPD 4相比，用酯邻位取代(PPD 15，IC50＝160.5uM)进一步改善了细胞活力约5倍。衍生物11-14示出了较低的IC50值，类似于衍生物9和10，指示了另外胺与二聚体PPD 1的氨基的共轭将对细胞产生有害作用。MEPPD显示了453.5μM的最高IC50值，其与PPD相比增加至19倍，最有可能是由于供电子基团比邻位的3和4更强。

实施例18

直接肽反应性测定用于确定皮肤致敏潜能

诱导过敏症涉及化学品或半抗原最初暴露于皮肤，并然后在称为半抗原化的过程中使化学品与蛋白质载体结合。主要地，化学过敏原具有亲电部分或可以酶促地转化为亲电体(反应性代谢物)。直接肽反应性测定(DPRA)由Frank Gerberick及同事于2004¹年首次发明，并于2007年得到进一步发展(Gerberick et al.,2007)。DPRA被设计通过定量化学品对含有半胱氨酸和赖氨酸的模型合成肽的反应性，来模拟皮肤蛋白质中的亲电化学品与亲核中心的共价结合。

在已发表的研究中使用DPRA的结果表明，当与局部淋巴结测定(LLNA)相比时，DPRA区分非致敏剂与致敏剂的精确度为80％，灵敏度为80％并且特异性为77％。

基于由表18提供的以下预测模型评定每种衍生物的反应性类型。

表18基于DPRA数据(半胱氨酸1:10/赖氨酸1:50模型)推荐的反应性等级和致敏潜能的分级。DPRA肽的消耗可用于将化学品分类为四种不同的反应性类别，允许区分非致敏和致敏化学品。

在直接肽反应性测定中，通常在分别共温育20min和24h后，用半胱氨酸肽与不同的测试化学品进行肽消耗。已提出与赖氨酸肽的反应性作为在过敏性接触性皮炎(ACD)中产生经修饰的蛋白质靶标的重要机制(参见Alvarez-Sanchez,R.,et.al.,Chem.Res.Toxicol.16,627–637；Eilstein,G,A.et.al,Bioorg.Med.Chem.16,5482–548；Gerberick,F.et.al.The report and recommendations of ECVAM Workshop 64.ATLA)。尽管许多化学致敏剂对含硫醇的分子具有反应性，但是由于赖氨酸反应性而形成的抗原结构可能对经修饰的蛋白质产物的量和多样性产生协同作用。据证明，共价连接至赖氨酸残基的半抗原已被示出在MHC识别和T淋巴细胞的激活上起作用(Weltzien,H.U.,et.al.,Toxicology,107,141–151)。表征化学诱导的赖氨酸化学修饰的潜能可能有助于开发用于风险评定的综合测试策略。

直接赖氨酸-和半胱氨酸-肽温育条件。

通过HPLC/MS/MS进行样品加工和分析

在含有100mM乙酸铵缓冲液(pH 10.2)的反应中，确定了测试化学品对基于赖氨酸的合成肽的直接反应性。在0.3ml的最终反应体积中，赖氨酸肽的最终浓度为20μM。在100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，确定了测试化学品对基于半胱氨酸的合成肽的直接反应性。类似于赖氨酸DPRA，在0.3ml的最终反应体积中，半胱氨酸肽的最终浓度为20μM。表19提供了反应设置的更多细节。

表19.DPRA反应设置。

对于DPRA，根据表19，使用对于半胱氨酸肽1:10的每种肽与测试化合物的比率以及对于赖氨酸肽1:50的每种肽与测试化合物的比率制备温育混合物。在实验开始之前新鲜地制备甲磺酸去铁胺和肽溶液。通过添加对于半胱氨酸3μl测试化学储备溶液和对于赖氨酸肽15μl储备溶液启动样品反应。然后将这些混合物置于25℃的温度控制的振荡培养箱中。

在每个时间点(20min/24小时)，将温育混合物用75μL的95％ACN/H₂O淬灭，并且温和地涡旋(600rpm,3秒)。对于赖氨酸DPRA实验，将10μl等分试样用2％ACN/H₂O稀释，涡旋并储存在-80℃下，直到通过LC-MS/MS分析为止。对于半胱氨酸DPRA，进行了额外的步骤。在时间点20min和24h，将10μl的半胱氨酸反应混合物在180μl的2％ACN/H₂O中稀释。然后向其中添加10μl的16mM二硫苏糖醇溶液(在水中制备)的等分试样，并将样品在45℃烘箱中加热30min，然后允许冷却至室温，然后进行分析。使用这个方程式获得肽消耗(PD)百分比。

分析被设计以选择性地监测两种分析物：半胱氨酸肽(单体)和亮氨酸脑啡肽内标物(IS)，并且在单独的方法中，赖氨酸肽和IS。LC-MS/MS方法采用Agilent 1290Infinity超高压液相色谱法(UHPLC)二元泵、自动进样器、真空除气机和柱温箱(AgilentTechnologies Inc.,Santa Clara,CA,USA)，并且ACQUITY UPLC BEH C18,1.7μM,2.1×100mm柱(Waters,Mildord,MA,USA)用于色谱分离。质谱分析是通过使用配备有AB SciexTurbo Ion Spray接口的以三重四极杆阳性模式(ESI+)操作的AB SCIEX QTRAP 5500串联质谱(MS/MS)体系(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)进行的。数据的获取和分析是使用Analyst软件版本1.6.2(Applied Biosystems)进行的。

结果

在这项研究中，直接肽反应性测定(DPRA)用于根据文献中报告的反应性等级和致敏潜能评估PPD衍生物。已经选择了含有亲核氨基酸的两种模型七肽，诸如含有半胱氨酸(Ac-RFAACAA-COOH，96.05％)和赖氨酸(Ac-RFAAKAA-COOH，95.5％)的七肽作为替代蛋白，并且这些肽的用途也已经被验证。由OECD推荐半胱氨酸(1:10)和赖氨酸(1:50)的平均百分比消耗值作为用于预测半抗原或前半抗原的皮肤致敏潜能的适当模型。对于过敏原诱导阳性皮肤反应，它必须首先穿透皮肤的角质层，并且然后与皮肤蛋白质反应形成免疫原性的半抗原。在这里，我们研究了PPD(一种已建立的皮肤致敏剂)及其新颖衍生物，它们被仔细地设计，具有较高的分子量(因此，分子更大)、高的logP、增加的氢键合能力、通过邻位供电子取代基增加的电子密度以及减少的氧化易感性以降低皮肤致敏潜能。

在24h进行的DPRA允许根据物质的皮肤致敏潜能对物质进行分类和比较。然而，我们在20min进行了DPRA，以模拟沙龙中的头发染色时间。我们假设，我们的PPD衍生物将具有与PPD相比更低的致敏潜能，由于它们的具有不同电子特性的合适取代基的分子结构。PPD经受自氧化，形成对亲核氨基酸有反应性的亲电子亚胺中间体。类似地，为了使我们的PPD衍生物与亲核氨基酸具有反应性，预期会形成这种亚胺中间体。然而，通过修饰和取代邻位处的PPD(PPD 3、4)，并阻止与胺官能度的一端处的取代的苄基基团(PPD 9-14)和长链脂肪族基团(PPD 16)的共轭延伸，我们旨在降低PPD的氧化趋势，从而不形成或形成更少的反应性亚胺，并因此比PPD的反应性更低。

表20-23中示出了使用半胱氨酸和赖氨酸肽对5种PPD衍生物(PPD衍生物1-5)的肽消耗结果。对于半胱氨酸，肽与使用的化学品的比率为1:10，并且对于赖氨酸，肽与使用的化学品的比率为1:50。结果指示了在致过敏效力与未反应的肽的消耗之间的相关性。如表20中看到的，PPD对半胱氨酸示出低的反应性持续20min；然而，PPD对半胱氨酸的反应性随着时间的推移而显著增加(表21)。这些数据与文献数据相关。在新合成的PPD类似物之中，衍生物3和4在20min时对半胱氨酸示出中等反应性。有趣地，这些衍生物的反应性在温育24小时后并未增加(表21)。对于衍生物5观察到类似的趋势。

表20：在用半胱氨酸肽温育20min后与PPD衍生物的直接肽反应性

表21：在用半胱氨酸肽温育24h后与PPD衍生物的直接肽反应性

表22：在用测试化学品温育20min后，所有重复的赖氨酸肽消耗值。

表23：在用测试化学品温育24h后，所有重复的赖氨酸肽消耗值。

赖氨酸DPRA的结果示于表22和23中。在20min温育时，几乎所有衍生物对赖氨酸的反应性均较低。有趣地，在20min时，衍生物3至5对赖氨酸没有示出活性或示出最小的活性。连续温育24h导致PPD和PPD衍生物1的反应性增加。然而，对于其他衍生物2至5，我们观察到对赖氨酸的低反应性。总体而言，在PPD衍生物1-5之中，类似物3和4代表对半胱氨酸肽具有中等反应性的最佳候选物，并且类似物2-5作为对于赖氨酸肽具有低反应性的最佳分子出现。结果表示了在具有大链的PPD和PPD二聚体结构的邻位处具有取代基以使对肽的反应性和皮肤致敏潜能最小化的重要性。

进一步分析

使用半胱氨酸和赖氨酸肽对PPD衍生物的进一步肽消耗结果在图12中示出，并在下面进行讨论。从如以上提及的程序和表19中的反应设置获得结果。

根据DPRA结果(图12)，PPD再次被证明是一种强致敏剂。此分类与现有文献一致，并因此，PPD在此DPRA中用作我们测试化合物的相对标准物。

在合成的衍生物之中，PPD 9、10分别示出了17.9％和23.0％的最低平均肽消耗，被证明是整个PPD衍生物系列中的弱致敏剂。在两种衍生物(PPD9和10)中，胺官能度的一端已被苄基取代基封端，这导致胺无法氧化形成亚胺共轭物中间体，并且这可能有助于与肽的结合减少。我们注意到，在PPD 9和10之后，PPD 3、4和16在DPRA测定中的表现似乎较好，在24.1％至25.5％的范围内，并且示出比PPD结合少2倍，并且作为中等致敏剂出现。两种衍生物在PPD的邻位处均具有强的供电子取代基，这可能致使苯环电子富集，并使其不易用于亲核蛋白质相互作用。对比PPD 4，对于PPD16所观察的平均消耗值较低，因为它具有额外的N-己基取代基，这使化合物更具亲脂性，减少了与亲水性肽的结合并进一步阻断了胺官能度，从而避免了氧化为亚胺。注意的是，PPD 3、4和16的中等致敏潜能是由临界平均肽消耗(在范围24.1％至25.5％之内)预测的，相当接近弱致敏剂(平均肽消耗≤22.62％)。有趣地，尽管有中等的吸电子基团，但原酸酯取代的衍生物PPD 6、15却示出22-24％的较低肽消耗，这表明存在中等的吸电子基团不会影响苯的亲电特性。

至于具有高平均肽消耗值的其他衍生物(PPD 1、2、8)，表现出高致敏剂的特性，这可能是由于它们是较大的分子，对模型七肽具有更多反应性位点。有趣地，PPD 1的二聚体形式显示出比三聚体PPD 2和四聚体PPD 8更低的结合潜能，这可能是PPD 1的logP值(logP为0.93)与PPD 2和8的logP值(1.86和3.02)相比较小的结果。此观察结果提醒我们要注意，在尝试使用增加分子大小(和分子量)作为降低PPD衍生物的皮肤渗透程度的策略与无意引入额外的反应性位点以形成亚胺和随后与肽的加合物之间的平衡。如所预期的，PPD的另一种三聚体形式(班德罗斯基碱)示出与PPD 2类似的平均肽消耗(38.9％)，并且与PPD相比被认为是中等致敏剂。

关于另一系列的PPD衍生物，即对称烷基封端的低聚苯胺PPD 11-14，它们以边界线中弱致敏剂出现。由于所有这4种衍生物在PPD的二聚体形式的末端胺上都示出从4-OH苄基取代基(PPD 11)到4-CH3苄基取代基(PPD 14)的logP趋势增加，因此不足为奇的是平均肽消耗随着从PPD 11-14的logP增加而减少。这是由于胺不能用于氧化和logP显著增加的结果，这使得它们较少可用于与蛋白质的亲核结合。另一类可商购的PPD衍生物ME-PPD(最近在染发剂产品中作为PPD的更安全替代品推出)示出53.2％的更高的平均肽消耗，其仅略低于PPD。这表明在PPD的邻位处添加较弱的供电子基团(CH2OCH3)不会改善logP，并且苯环的电子密度不会改变与模型肽的结合效率，因此在我们的实验中作为强致敏剂(类似于PPD)产生。

尽管如此，所有被测试的新颖PPD衍生物(PPD 3、4、6和15、9和10、11-14)均示出与PPD(55.5％)相比，平均肽消耗百分比范围为17.9％-33.4％，从而证实了以下假设：它们具有增强的logP和分子量的结构多样性，以及苄基取代基对末端胺的保护，可能确实是造成它们在化妆品产品中致敏潜能减少的原因。结果还表示了在具有大链的PPD和PPD二聚体结构的邻位处具有强的供电子取代基以使对肽的反应性和皮肤致敏潜能最小化的重要性。如开发人员和其他研究人员注意到的，该分类系统是一种初步筛选工具，以基于肽消耗19来估计测试化合物的致敏潜能并且还根据测试化合物的皮肤穿透来估计皮肤致敏。因此，我们已经进行了皮肤渗透研究，以阐明PPD衍生物1-6和15以及ME-PPD在施加到皮肤时的行为如何。

实施例19：初步酶联免疫吸附测定(ELISA)研究

方法：

细胞因子和表面标志物测定

对于THP-1中的细胞因子谱分析，将上清液从孔中收集并然后通过趋化因子免疫吸附测定Bio-legend ELISA Max试剂盒用于细胞因子分析。使用该试剂盒估计了来自THP-1细胞上清液的可获得的IL-8蛋白质的水平，在THP-1模型激活时调节该水平。使用标准BDFACS分析仪与来自Biolegend and e Bioscience的PE和FITC荧光标记抗体通过流式细胞术分析人类CD-86、CD-54、MHC-I和IL-T3的表面受体表达。

结果与讨论：

为了理解经修饰的PPD染发剂对THP-1免疫致敏的影响，在用标准PPD和经修饰的染发剂化合物处理后，在评估THP-1模型中的上清液用于表达细胞因子IL-8和受体表达CD86、CD54、MHC-I以及IL-T3表面受体之前，要求在25％细胞死亡的情况下CV75％能生存下的一定程度的细胞毒性。大多数过敏原示出了CD86和/或CD54表达或细胞因子谱的分泌的特定的剂量依赖性改变。但是，取决于化学品，改变模式可能不同。

如图13-15中示出的，观察到用标准染发剂PPD、PTD、ME-PPD、DNCB对照、BBB和新染发剂化合物PPD-1、8的IL-8表达增加，而其他经修饰的染发剂PPD 6、15不刺激IL-8表达，暗示缺乏致敏。此外，CD86(共刺激激活标志物)和CD54(细胞间粘附分子)的表达增加，暗示THP-1免疫细胞成熟和警报响应。PPD-15和PPD-6不会刺激CD86和CD54的表达，表明这些染发剂化合物缺乏致敏。与DCNB相比，PPD2、6，PPD15和ME-PPD增加了ILT3(抑制性受体)表达，这表明这些化合物刺激了与免疫炎性应答致敏相反的特定信号通路。这些初步分析指示，这些受体的激活和失活或细胞因子的分泌表明染发剂对THP-1模型具有影响。在皮肤中，激活的成熟树突细胞随后将迁移至携带在皮肤中获得的抗原的淋巴组织，并诱导适应性免疫应答，该应答将由于致敏和炎症应答而提供后续保护。

序列表

<110> 新加坡国立大学（National University of Singapore）

新加坡科技研究局（Agency for Science, Technology and Research）

国立大学医院（新加坡）私人有限公司（National University Hospital(Singapore) Pte Ltd）

<120> 可用于使头发和皮肤着色的PPD衍生物（DERIVATIVES OF PPD USEFUL FORCOLORING HAIR AND SKIN）

<130> PPI20011541SG

<150> 10201709422Q

<151> 2017-11-15

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱氨酸肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Arg是乙酰化的.

<400> 1

Arg Phe Ala Ala Cys Ala Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 赖氨酸肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Arg是乙酰化的.

<400> 2

Arg Phe Ala Ala Lys Ala Ala

1 5

Claims (15)

1.一种式I的化合物：

其中：

R¹和R²独立地表示H或C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被苯环取代，所述苯环是未取代的或被选自硝基、C_1-3烷基和OR^5a的一个或多个取代基取代，R^5a表示H或C_1-6烷基，

R³表示O-C_1-6烷基或C(O)OC_1-6烷基，这两个基团是未取代的或被选自C_1-3烷基的一个或多个取代基取代，

n表示0或1，或其生理学上可接受的盐。

2.一种使头发染色或施加临时文身的方法，所述方法包括将包含式I的化合物或其生理学上可接受的盐的组合物施加到受试者的头发或皮肤上，其中所述式I的化合物具有以下结构：

其中：

R¹和R²表示H或C_6-8烷基，其中后一基团是未取代的或被苯环取代，所述苯环是未取代的或被选自硝基、甲基、OH和OCH₃的一个或多个取代基取代，

R³表示O-C_1-6烷基或C(O)OC_1-6烷基，这两个基团是未取代的或被选自C_1-3烷基的一个或多个取代基取代，

n表示0或1，或其生理学上可接受的盐。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述式I的化合物选自以下列表：

(i)4-氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺；

(ii)[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯；以及

(iii)4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中，所述式I的化合物是[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述式I的化合物选自以下列表：

(a)4-氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺；

(b)[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯；

(c)4-己基氨基-(3-己氧基)-4′-氨基二苯胺。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述式I的化合物是[2-氨基-5-(4-氨基苯基氨基)]苯甲酸己酯。

7.一种式II的化合物：

其中，所述式II的化合物选自以下列表：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；

(ii)己基-2,5-二氨基苯甲酸酯；以及

(iii)(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯。

8.一种使头发染色或施加临时文身的方法，所述方法包括将包含式II的化合物或其生理学上可接受的盐的组合物施加到受试者的头发或皮肤上，其中所述式II的化合物具有以下结构：

其中：

R¹³表示H或C_6-10烷基，其中后一基团是未取代的或被选自未取代的C_1-3烷基的一个或多个取代基取代，

R¹⁴表示OC_1-6烷基或C(O)OC_1-6烷基，这两个基团是未取代的或被选自C_1-3烷基的一个或多个取代基取代。

9.根据权利要求7所述的化合物，

其中，所述式II的化合物选自以下列表：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；以及

(ii)己基-2,5-二氨基苯甲酸酯。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述式II的化合物选自以下列表：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；

(ii)2-己氧基-1,4-二氨基苯；

(iii)己基-2,5-二氨基苯甲酸酯；以及

(iv)(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述式II的化合物选自以下列表：

(i)4-2-((2-乙基己基)氧基)苯-1,4-二胺；以及

(ii)(N¹-己基)(2-己氧基)-1,4-二氨基苯。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述式II的化合物是己基-2,5-二氨基苯甲酸酯。

13.一种用于使头发染色或文身皮肤的组合物，所述组合物包含：

如权利要求1、3至4中任一项所限定的式I的化合物或如权利要求7和9中任一项所限定的式II的化合物；以及

水。

14.根据权利要求13所述的组合物，所述组合物进一步包含：偶联剂。

15.一种部件试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)根据权利要求13所述的组合物；以及

(ii)包含氧化剂的显影组合物。