CN111518708A - 一种不易开伞的黄色金针菇菌种农金49及其分子标记鉴定方法 - Google Patents

一种不易开伞的黄色金针菇菌种农金49及其分子标记鉴定方法 Download PDF

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CN111518708A CN202010540275.XA CN202010540275A CN111518708A CN 111518708 A CN111518708 A CN 111518708A CN 202010540275 A CN202010540275 A CN 202010540275A CN 111518708 A CN111518708 A CN 111518708A
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江玉姬
邓优锦
谢宝贵
吴小平
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Abstract

本发明提供了一种不易开伞的黄色金针菇菌种‘农金49’及其分子标记鉴定方法，属于金针菇技术领域。本发明以白色金针菇‘农金7号’和黄色金针菇‘G‑20’为亲本进行杂交选育出稳定性好，菌盖浅黄色、不易开伞，单根子实体间不易粘连，菌柄长、整齐度好，产量高，具有很好地开发应用前景的黄色金针菇‘农金49’菌株。该菌株已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20191019。同时提供了该菌株专一性强、操作简便的分子标记鉴定方法。

Description

一种不易开伞的黄色金针菇菌种农金49及其分子标记鉴定 方法
技术领域
本发明属于金针菇技术领域，具体涉及一种不易开伞的黄色金针菇菌种‘农金49’及其分子标记鉴定方法。
背景技术
金针菇（Flammulina filiformis）以其营养丰富、味美适口而为人们所熟悉，是我国实现工厂化栽培最早的食用菌，经过几十年的努力，其生产工艺实现了从玻璃瓶栽到聚丙烯袋栽，以及塑料瓶栽的发展。目前金针菇工厂化栽培以白色品种为主，近年来随着白色金针菇市场的饱和，竞争异常激烈，其价格一直处于较低迷状态，金针菇企业面临着巨大的压力。然而此时的黄色金针菇由于栽培量少，相对白色金针菇，则是一种珍贵的品种，黄色金针菇的价格至少比白色金针菇高出一倍，黄色品种显示出较大的商业价值。人们对金针菇商品性状的要求之一是子实体的菌盖要较小，但黄色金针菇的生长发育一般较白色金针菇快，其菌盖较易开伞从而影响其商品性状，因此选育一个不易开伞的黄色金针菇品种则可以弥补这一缺陷。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供了一种不易开伞的黄色金针菇菌种‘农金49’及其分子标记鉴定方法。
本发明提供的黄色金针菇‘农金49’菌株，其分类命名为：金针菇（Flammulina filiformis）农金49，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉 武汉大学；保藏编号CCTCC NO：M 20191019。
本发明提供的黄色金针菇（Flammulina filiformis）‘农金49’，简称‘农金49’是以白色金针菇‘农金7号’和黄色金针菇‘G-20’为亲本进行杂交选育而成，其继承了两个亲本的优良性状。‘农金49’菌种稳定性好，浅黄色，商品外观优美，单根子实体间不易粘连，菌柄偏白、中等粗细，柄较长，菌盖浅黄色、不易开伞，产量高，每袋产量在440～490g，具有很好地开发应用前景。
金针菇‘农金49’的母种培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000mL；培养条件为常规的金针菇培养，无特殊要求。
本发明还提供了所述金针菇‘农金49’菌株的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、特异性片段PCR扩增、PCR产物的电泳检测与DNA测序。
所述特异性片段PCR扩增是由6对引物分别对‘农金49’的DNA进行PCR扩增，经电泳检测分别得到单一的标记片段，6对引物序列和用这6对引物分别扩增‘农金49’的DNA得到的标记片段大小见表1；
表1 特异标记扩增信息
Figure 464016DEST_PATH_IMAGE001
所述PCR产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有一个片段出现，且片段大小与对应的引物相符（各引物对应的片段大小见表1），是金针菇（Flammulina filiformis）‘农金49’的标记。其中电泳条件为：取PCR产物5～10μL，与1μL上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；所述上样缓冲液：0.1％ 溴酚蓝, 40% 蔗糖。
PCR扩增反应体系：1～1.5 μl 含量80~150 ng的DNA，12.5μl Premix Taq（带染料），1 μl 浓度为10 μmol/L的正向引物, 1 μl 浓度为10 μmol/L的反向引物,9～9.5 μlddH2O，总体积25 μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，57 ℃退火30 sec，72℃延伸X,35个循环;72℃延伸10 min。其中引物F49P1、F49P3、F49P4的72℃延伸时间X为1min 45sec；引物F49P2、F49P5、F49P6的72℃延伸时间X为1 min10 sec。
PCR扩增产物，经DNA 测序，引物F49P1产生一条1336 bp的条带，其DNA序列如SEQID NO.1 所示；引物F49P2产生一条1076 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.2 所示；引物F49P3产生一条1206 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.3所示；引物F49P4产生一条1621bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.4所示；引物F49P5产生一条1036 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.5所示；引物F49P6产生一条951 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.6 所示；6个引物同时检测得到对应大小的DNA标记条带，是金针菇（Flammulina filiformis）‘农金49’菌株的标记。
本发明具有以下优点：
1、金针菇‘农金49’含白色金针菇‘农金7号’和黄色金针菇两个亲本的基因，既具有‘农金7号’产量高的特点，又具有黄色金针菇出菇快、子实体黄色的特点，此外还有两亲本没有特点：菌盖不易开伞。‘农金49’与黄色金针菇‘杂19’（原三明真菌研究所通过杂交选育的黄色金针菇品种）相比最大的优点就是菌盖不易开伞、菌柄长、整齐度好；另外与目前工厂化栽培的白色品种相比，‘农金49’最大的优点菌盖较小，即不易开伞，菌柄长、不粘连；此外，‘农金49’既能采用聚丙烯塑料袋栽的模式，又能适应瓶栽的模式，因此具有很好地开发应用前景。
2、金针菇‘农金49’的DNA鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。
3、专一性强：本发明在对金针菇基因测序、生物信息分析的基础上，设计金针菇‘农金49’的特异识别性的标记片段。
4、金针菇‘农金49’的DNA鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。
附图说明
图1为金针菇‘农金49’子实体形态图。A为金针菇‘农金49’袋栽子实体形态；B为金针菇‘杂19’袋栽子实体形态；C为金针菇‘农金49’瓶栽子实体形态；D为金针菇‘T-011’瓶栽子实体形态。
图2为金针菇‘农金49’特异性识别标记电泳图；其中，1～3泳道的引物为F49P1，标记片段大小为1336 bp；4～6泳道的引物为F49P2，标记片段大小为1076 bp；7～9泳道的引物为F49P3，标记片段大小为1206 bp；10～12泳道的引物为F49P4，标记片段大小为1621bp；13～15泳道的引物为F49P5，标记片段大小为1036 bp；16～18泳道的引物为F49P6，标记片段大小为951 bp，是金针菇‘农金49’的标志；当6对引物都对‘农金49’基因组检测时都产生对应大小的标志片段，则为金针菇‘农金49’，M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1：金针菇‘农金49’的选育
（1）对黄色金针菇‘G-20’进行出菇实验，收集其孢子，并进行孢子萌发实验，获得单孢菌株，并选择生长较快的单孢菌株30个；
（2）用‘农金7号’与黄色金针菇‘G-20’选择的30个单孢菌株进行杂交，配对30个组合，获得25个杂交子；
（3）对获得的25个杂交子进行菌丝稳定性观察，选择菌丝生长速度稳定、且较快的杂交子18个进行出菇实验，观察到杂交编号为‘49’的杂交子菌盖较小、出菇整齐、产量较高；
（4）此后，金针菇杂交子‘49’ 经多次出菇，性状稳定，周期短，抗逆性较好、出菇时整齐度好、柄长、菌盖不易开伞，整体外观好，产量较高，将金针菇杂交子‘49’命名为‘农金49’。
金针菇‘农金49’已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 20191019。 实施例2：金针菇‘农金49’（CCTCC NO：M20191019）的工厂化栽培，包括以下步骤：
（1）金针菇‘农金49’的袋栽
将金针菇‘农金49’、黄色金针菇‘杂19’菌株在PDA培养基上活化2次，转接于金针菇原种常规培养基，23℃恒温培养至长满原种瓶。待原种长好后，即进行袋栽，金针菇袋栽的选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌和出菇管理均按黄年来等主编的中国食用菌-金针菇（黄年来，林志彬，陈国梁，主编．中国食药用菌学．上海：上海科技文献出版社．2010，937～978.）中袋栽的方法。
子实体性状表现，‘农金49’的栽培周期与‘杂19’相当，‘农金49’（图1A）的菌盖不易开伞、菌柄长，而‘杂19’（图1B）菌盖较易开伞、菌柄较短，其它性状无显著差异；在产量上，‘农金49’的单袋产量比‘杂19’高50～90克。
金针菇‘杂19’购买于市场。
（2）金针菇‘农金49’的瓶栽
制作黄色金针菇‘农金49’、白色金针菇‘T-011’的液体菌种，其栽培选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌和出菇管理均按黄年来等主编的中国食用菌-金针菇（黄年来，林志彬，陈国梁，主编．中国食药用菌学．上海：上海科技文献出版社．2010，937～978.）中瓶栽的方法。
子实体性状表现，‘农金49’的栽培周期与‘T-011’相当，‘农金49’（图1C）的菌盖不易开伞、菌柄长，而‘T-011’（图1D）菌盖较大、菌柄较短，其它性状无显著差异。
实施例3：金针菇‘农金49’的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：
（1）菌丝培养和收集
1、将金针菇‘农金49’、‘农金7号’、‘G-20’转接含100ml PDA液体培养基的250 ml广口三角瓶中；
2、放置在25℃摇床上，转速90～130 r/min培养5～8 d；
3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；
4、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。
（2）CTAB法提取基因组DNA
提取金针菇‘农金49’、黄色金针菇等菌株基因组DNA提取的具体操作步骤，按照陶永新等的方法（Tao Y, Xie B, Yang Z, et al. Identification and expression analysisof a new glycoside hydrolase family 55 exo-β-1, 3-glucanase-encoding gene inVolvariella volvacea suggests a role in fruiting body development[J]. Gene,2013, 527(1):154-160.）进行，提取的DNA放-20℃保存备用。
（3）金针菇‘农金49’特异性标记引物设计
将金针菇‘农金49’、‘农金7号’、‘G-20’等菌株的基因组DNA送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组的二代测序，测序数据量为3～4G的clean data，对这些基因组数据进行生物信息分析，寻找杂交子‘农金49’特有的基因，并进行引物设计，引物信息如下：
引物F49P1正向序列为5’- AGAGCTTCTTGCCGGAACAG-3’， F49P1反向序列为5’-GAGCTCACCTCACGGATATG-3’ ，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1336 bp的标记片段；
引物F49P2正向序列为5’- TCCAGTGTCGCGTCTGAATC -3’， F49P2反向序列为5’-TGGGCCAGGCAATCCACATC -3’ ，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1076 bp的标记片段；
引物F49P3正向序列为5’- GTGCCTAGCGGCAACAGAAG -3’， F49P3反向序列为5’-TGTCTCGCCATAATCACCAG -3’ ，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1206 bp的标记片段；
引物F49P4正向序列为5’- GGCCGGCTCAACCTATTTAC -3’， F49P4反向序列为5’-GCCGCCCACATTATGGGTAG -3’ ，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1621 bp的标记片段；
引物F49P5正向序列为5’- CGATTGTGCGCATCTTAACG -3’， F49P5反向序列为5’-GGATTCCGCGCCGATATTCC -3’ ，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1036 bp的标记片段；
引物F49P6正向序列为5’- CCAGGCTGCGCACTTGTATC -3’， F49P6反向序列为5’-AGCGAGACCTTCTGTCATTC -3’ ，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约951 bp的标记片段。
（4）特异性片段PCR扩增
PCR扩增反应体系：1.2 μl 含量100 ng的DNA，12.5μl Premix Taq（带染料），1 μl 浓度为10 μmol/L的正向引物, 1 μl 浓度为10 μmol/L的反向引物，9.3 μl ddH2O；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，57 ℃退火30 sec，72℃延伸X,35个循环;72℃延伸10 min。其中引物F49P1、F49P3、F49P4的72℃延伸时间X为1min 45sec；引物F49P2、F49P5、F49P6的72℃延伸时间X为1 min10 sec。
（5）PCR产物的电泳检测
取PCR产物5 μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0.5 × TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳30—40 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图2所示，引物F49P1、1～3泳道显示的分子量为1336 bp，引物F49P2、4～6泳道显示的分子量为1076 bp，引物F49P3、7～9泳道显示的分子量为1206 bp，引物F49P4、10～12泳道显示的分子量为1621 bp，引物F49P5、13～15泳道显示的分子量为1036 bp，引物F49P6、16～18泳道显示的分子量为951 bp的DNA标记条带，是金针菇‘农金49’的标志；M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
（6）特异性片段序列测序
将引物F49P1～F49P6扩增‘农金49’得到的单一片段连接到pMD 18-T Vector进行克隆，送往杭州有康生物科技有限公司进行测序，分别得到单一片段的DNA序列如下：
使用引物F49P1扩增‘农金49’得到1336 bp标记片段的DNA序列如SEQ ID NO.1 所示；
使用引物F49P2扩增‘农金49’得到1076 bp标记片段的DNA序列如SEQ ID NO.2 所示；
使用引物F49P3扩增‘农金49’得到1206 bp标记片段的DNA序列如SEQ ID NO.3 所示；
使用引物F49P4扩增‘农金49’得到1621 bp标记片段的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；
使用引物F49P5扩增‘农金49’得到1036 bp标记片段的DNA序列如SEQ ID NO.5 所示；
使用引物F49P6扩增‘农金49’得到951 bp标记片段的DNA序列如SEQ ID NO.5 所示。
六、试剂与仪器
CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl， 2.0% CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，pH 8.0;
CTAB 沉淀液：50 mmol/L Tris-HCl，1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA，pH 8.0;
CTAB/NaCl：0.7 mol/L NaCl， 10% CTAB；
氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；
TE缓冲液：10 mmol/L Tris HCl ，1 mmol/L EDTA；
0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3、1 mmol/L EDTA;
Premix Taq (Ex Taq Version 2.0)带染料的和PCR扩增试剂，均购自大连宝生物公司。
主要仪器：
SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司
灭菌锅：上海三申
HYG-A全温摇瓶柜：太仓市实验室
冷冻离心机：Sigma 3K30
PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg
掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机
SDC-6节能型智能恒温槽：宁波新芝生物科技股份有限公司
凝胶成像系统：TANON-2008。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建农林大学
<120> 一种不易开伞的黄色金针菇菌种农金49及其分子标记鉴定方法
<130> 18
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
agagcttctt gccggaacag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
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<400> 3
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<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
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acgttacctt cgatacttcg cttgtatagt catctgaggc gtgaagcctc aacactttca 120
tgcagacttt gcgagactga taaataccga catagatgtc cttcagacgt atcagtctca 180
cgagtatgac catatctaac aatgacatac agaaaatcca cccattgcaa tgactgtcgt 240
attttgtagc tggacattgt gaagcgccat gttactaggt aagccacccg agacgcgact 300
aatagcctgg agagacttga tcgccgcccg ccgggaactg tcctctatct tcggacattg 360
gtcaagtgcc tgtagaagat acatgtcaga accgcgaatc aggaggagag cacataccga 420
ctggagagca tccattacga tctgatgaag accagagttt atcgtcccta ctgtggccca 480
aggtgtagtc tgaggttggg aaatgataga ctcgacattc ctacgtagtt cgctcggtcc 540
ggataaatgg atgtcactcc aggatgtagc aagtggtatc ttatgatgcg cctccgaggg 600
atcgtggttt agactgggat caggggcatg gctcggaata ggtgatgcac atgcctcatc 660
tcccactttc gcgccggggg acgatatagt actaggacgg cggagaaatc ggtcctccca 720
caaagttcca tgcgtttcaa tatcacttcg aaaaggttca ataaagtgcg ctatggagca 780
gaaaggctta caatgagacg ttcttctcaa ctgcattcgt cagccaatcc ctgagggcat 840
gtgcataagc tcaaaatcaa ggaaagggaa agaaagtatg cgtacgggtg cgacttccag 900
ttttcgttaa caactacatc acgaattggc gcgcacgaag gtacaacatt cagcagctcc 960
agtttcgcgt tggatagttc cggagacgga agctcgtcgt tatcattgtc ctgggagtcg 1020
aaatgtacag atgccctttc ctcgacgtca actagggaag tggagatggg aagttgttgg 1080
tacacgggct gagaatcctc tgtttggttt gcgtcatatt ggccactgta atagctttca 1140
tcctctttgt gttcattctg atgagcttcc aacacggtac cgtgagcaga agagtcctta 1200
gctacggact ttgaaccttc cgtaagctca aagtctgggg gtgttatctc cgccactgcg 1260
caacggaatg tgtctttact ctcgccaaca aatgtctcgc tgatggcgtc agccgtcata 1320
tccgtgaggt gagctc 1336
<210> 14
<211> 1076
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.2
<400> 14
tccagtgtcg cgtctgaatc gcccaggcaa gccacgtaga tggaccgatt aggatctata 60
agagcgaccg ttgcagttgt gcctgtgcga gcgcgccgaa cctccacaaa tgaagacccg 120
tcagatgagg aggggtccgt gataatagtt ctgatctcat cgtcggtaag agcggaaagc 180
tggtttgggc cgccaggaaa catcgatatg aggtcgtttt ggattcgctc gtccatggtg 240
accagacact gcgttaagat atcggcaagg gtcaagcttc cacgcaaacc atcaacgtag 300
gatgatatcg catccttgat catgtgaggt agagtcgcga gtacgaagtc caccgcttcg 360
ctaccggcgt gtcctgatgt atgtcaacaa catcaaaata atgcgtgcaa tggacggtac 420
catcaaatat cgcagccacc ttccatgtcc cgtcgggtag ttcccaatct tcgatgaaat 480
accgatcctc gcttgggaga tgggaaggct tgaaactgac ggcatgaacg ccacagttct 540
tttccacaga attgaattgg agaagccggg atttgagatt ttccaaagcg acatagtctg 600
tcaagctagt agctacatct gaattcgtgg tggccatggt ggtatctgag caacattgga 660
acggaacgca tccacgaagt acgtaaactg ttcccacgct catgctgctt ccaaagtttc 720
gagggcgagc acttgtatcc tcattctggg tgcatcggga cccatagtta cctgatatcc 780
agtaagatgg aagaaacatt ttctcctagg ccgttctcga ttcacagtta ttcttcccgg 840
gcccccacct tgggacaatt cgagtcagtc aatctgggga tggctcatgc attgtaggtc 900
ttcgatcgca tgaccttgca gtttgcttgg cacatttcta gtacacaatc atgtgctggg 960
cccgaatgaa ttgagctccc ataagtctgg cgtctactgt ggccaaatta tctcttggtg 1020
agtttcttgt tccactcttg gctgtattat ggggtggatg tggattgcct ggccca 1076
<210> 15
<211> 1206
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.3
<400> 15
gtgcctagcg gcaacagaag acacgacgag atcgagttga taagatagca atcaccgtac 60
gaagcggggc ggactggcgg ctgatggcgg cctcccgcct gcttacacaa tatagaccca 120
cctagacaag gtcacacatg tcttcggcaa catccgtata atagttttct cctccttcaa 180
cattctgtat aataccgtcc cgcctcgttc cgcatgtaac ctctcggcgt tcataatacg 240
aacttttttt cacgtcgttc actggctcgt ggccgtcggc ccaccatggc atatagcaaa 300
actcgatggg attcagcaag tccaaccttc actttgttct tatgtcgcgc cgttactttc 360
cctacgccag accgggaggt ccctctccac gcagagagag acacacttac acaccgccaa 420
ctgttgtgct tccggataat cctcaacgtc agctggaata tttggcaaat gagccttcac 480
ctgccttagt cgcaggatgg gctcgtcagc ttgctgctgc gaacgctcag ggagttatgg 540
tcgagtttga caaggaggca aatgacatgc gtgcttggaa taggtgcgtc aagtctcttt 600
gcacttattg gcatactgag taagatgctt cgtaggccgc actggcagct cagcagcgga 660
gggatgaccc agatgggtgc tggatctatg ttgaacctca caaccaacca acgaccactt 720
tgtatccaca gggccaatcc agtgctcacg gatacggaat gttgcatggc tcttcatcga 780
cgtgtcccca ttcgtgaact cggaggcgcc attcacgatg tttttcggtg cccaacaagc 840
cattctcccc aatactacag tgcgtaccaa cttgttataa cctgcatcta ttctgatcat 900
ttctagtgat catccctctt gtccgccctc gcgtcgttgc ttctactcat caggagattg 960
acgatcatct ccgtatgtat tccatgactt gttaggacca ttgcattgac ctttacaaat 1020
caacagtcag tcaattcgac caggacatgt acgaggaacg ctctagtagg ggttctttct 1080
taccttcgta tctgtatact gacatggttt acagtagagg aagacgaaat gcgtgaatat 1140
cttgaaaggt ccctcaagcc ggtcgccaac ccccgggtca tttgtgctgg tgattatggc 1200
gagaca 1206
<210> 16
<211> 1621
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.4
<400> 16
ggccggctca acctatttac aaccttccac catgacagac gaaagcttgg acgcgtttgt 60
tacatagccg gtttcaacaa aacgatggta tcttcgacaa agaacctata agatttatag 120
tattccccga gaggatcatg gacatggcgc ggtagcgttg cgcgacatac cagtgtgttt 180
ggttttgcca aaataccttt cagcctattg accagctcct taggaaggcc aaacattatt 240
tgcaatccca cgctacgtgg ctatatccgc ccgtacaaat tcccaggtct ttggtttgga 300
tgaatagaaa cgaatcaggg ttcatgggct cgatactctg ccatgatata acggattggt 360
tcaataccgc gaagagcaac ttggccttgg gataggccat tttgttctcc attcatgcat 420
gcatgagcca attagcatcc atatcactat cgtcgcggat tccgggttgc gtcgggcact 480
tgtcctggtg aagcagtcgt gggaatggac ctagacggga ttctcttctt ccttgttctg 540
gcggaaactt gtctacagca aaaggttagc attgcaacca tttcctccag attccatcca 600
actgaaggtt acaacagacc ttgctccgaa actactggac actatactcc gtatattgaa 660
ttatgagtcc atcctggcga cttcgctcgt ttccagagca tggcgcgccg cctccctgcg 720
tcaccttttc gacaatgtta cattccaagt tgaggacgac atggcgcgct ggaacgagat 780
ttcgacgaca atgccccatc ttgtggtcta cgttcgttgg gtcgtgtact ttcccccttt 840
gtcggtgaat gacattggct ttcccgatac cccgatccat acaatgcgcg ctgtccacaa 900
gctttcatag tactgcaccc ccagcattga cctctcccag agaggcggac cagcctatcg 960
gttttgcgct cttttcctgc ggtgacgccg ccggagattc gtcgagccca aggacactcg 1020
atggctgctg agccatttcc cgagcgtgcg gtcactggcg tggacggact attattctct 1080
atctgatgta cccgacaatg actttagcag agcatcaacc acgcagccac gttactcgta 1140
ccgtttagac ctatcttgtc ttgaatccat cgaagcaagt tcggcgcggg atgggtggcc 1200
ggttgacgag attatcattg tatctcctcc acctctccgc aagattgcat tcgacttccc 1260
ggcctcctct gtctccccat gactgttggc aggcgtcaca accacgctga aggaaatagt 1320
tttgtcagga acgggactcg agggtgacgt ccttcctctg atttcagata tagaaactga 1380
aacttgactc ccagccaagc ttattcatcc ctaggcgagg aagatcacgt ttcctcgtct 1440
gcgttctacg aagttcgtgc taggtcgatc tggaatccag ggagatgtgg ataacctggt 1500
tgtattccag tggcttgctt cggatgcgaa gtgtttccct ttggcgcctc agctaaagga 1560
gctgaacttc aggatctatg ccgacttgaa gggtgaagat tctacccata atgtgggcgg 1620
c 1621
<210> 17
<211> 1036
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.5
<400> 17
cgattgtgcg catcttaacg ggttcctagt ggaagcctga ccagccatcc gcaggatggc 60
tgtcacccaa agttcagggc ttgcgccggg agtggggatg tgtcgtatgg gttagatact 120
tgggaatatg tatatagtga ttaaaatgaa gggttcgacg gctcaacatg gccacttcga 180
agcaaggggg acttatacga cgcccagcgg ggcaggggga cgggggcggc aatccattca 240
cacgaaaggc tgggaatgtc atcggaggtc ctatatatgt tgtctaacac gaatacaatg 300
atatgtgtcg atttagaatt ttacgccatg tcctctcgtc gtcgcggtac acgttccggc 360
ctgacgccac ataaagaggg cggacgacac aaagttatcc aacattgcag aagcaaatgg 420
cgggcgtcag acgttgatcc aacaatctaa tagttattcc cgggggtccc gaccgtcctc 480
tctaacgatc cccagtccgg cggagacaag gtgtcggttt ctgggccaaa aaaaggctcg 540
gagctgagtc tatacatcta catggtgctg cggaggagaa aaagagcgtg gaagtcaagg 600
taacaatgta aaactcacat tccgtcggtc gagaacatct gtcactcaat atcgacatcc 660
ggcggaaggt tccggccaat ttccccacta cgccacacta ggtcgaagta gcgcaccaaa 720
ggaatgatac cagcgaacgt caacagtcgc gttagctctc gtagacctat caacgacgta 780
tagcaacgca ccaagaccaa gcacgatcga acgagcactg cgccacacaa cgaccaaggc 840
ctggcggcgt ctatcaaagt ctgtcgtccc ggggattctc caaaggtgag tcaaggagag 900
atatatcgag aggtaacgta gcctgctctc gataaacgat aagcaggcga cggtggtggt 960
ggtggtggaa ggaaaggaat gtatggaaaa agggacagcg acgaagccgg cggcacggaa 1020
tatcggcgcg gaatcc 1036
<210> 18
<211> 951
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.6
<400> 18
ccaggctgcg cacttgtatc tctctcttat aaatctccac agctgtcaga ggaacgtcct 60
acgtcccgga aagtaagtgt gagtgtccat gacactattt tcctttccac ccttaccctt 120
cgttcccaag cgccacaccc gcatagaggt tagtgatgag gaggtatccc acaccgaagc 180
tccccccaga cgaaggggcg aaacaacgga gagagcaaag gtgtgcactt tcacagtcta 240
acaaacatgg tgtctcacat cccacactca gagtgcaaag tctcgcaggc gcagcgtatc 300
accgatggac gaggtgtgtt caatcaaaca ctgtctaacc taaaatttga aaacattcgg 360
ctaggatgct cctgccgaga cagagggtaa acgggaatca atagcaaagg tagcttacta 420
ctgccacgta ccgtttctcc ccccactgac cagttttgaa gcgcaaatcc cgcccctccc 480
gttacactga aaagtctgaa agcagtgacg aggtatacca ccacagtctc ttgcatatct 540
ctccggttac tcatttacag gtttctgagc cccgtggtcg caagagacag aaggttctaa 600
ctcagagagt acgcgagaca tctcccatcg tgaaagtacg cgcccattgt atcttatcat 660
gacgggcagt taatggatat cgcaggttac aaactcgaaa caaggcagca agaatcccac 720
gtcactccag caatccaagg tacgtgtatg tacagtccac tgccacgatg tgaaaacctg 780
gatagactca cactttcccc agcgtgcgat ctccgaggat gcgcatgatc gcaagatccg 840
aaaatcaaga ggggcaacaa aggtgcgctt cccaacaggt atgacaacga tgtcctcgac 900
tgacgttctt aacgacaaag gatgcgagac agaatgacag aaggtctcgc t 951

Claims (3)

1.一种黄色金针菇‘农金49’菌株，其特征在于：所述金针菇‘农金49’菌株，其分类命名为：金针菇（Flammulina filiformis）农金49，已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20191019。
2.一种如权利要求1所述的黄色金针菇‘农金49’菌株的分子标记鉴定方法，其特征在于：包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、特异性片段PCR扩增、PCR产物的电泳检测与DNA测序；
特异性片段PCR扩增引物为F49P1～F49P6，具体核苷酸序列为：
引物F49P1正向序列为5’- AGAGCTTCTTGCCGGAACAG-3’， F49P1反向序列为5’-GAGCTCACCTCACGGATATG-3’；
引物F49P2正向序列为5’- TCCAGTGTCGCGTCTGAATC -3’， F49P2反向序列为5’-TGGGCCAGGCAATCCACATC -3’；
引物F49P3正向序列为5’- GTGCCTAGCGGCAACAGAAG -3’， F49P3反向序列为5’-TGTCTCGCCATAATCACCAG -3’；
引物F49P4正向序列为5’- GGCCGGCTCAACCTATTTAC -3’， F49P4反向序列为5’-GCCGCCCACATTATGGGTAG -3’；
引物F49P5正向序列为5’- CGATTGTGCGCATCTTAACG -3’， F49P5反向序列为5’-GGATTCCGCGCCGATATTCC -3’；
引物F49P6正向序列为5’- CCAGGCTGCGCACTTGTATC -3’， F49P6反向序列为5’-AGCGAGACCTTCTGTCATTC -3’；
引物F49P1产生一条1336 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.1 所示；引物F49P2产生一条1076 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.2 所示；引物F49P3产生一条1206 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.3所示；引物F49P4产生一条1621 bp的条带，其DNA序列如SEQ IDNO.4所示；引物F49P5产生一条1036 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.5所示；引物F49P6产生一条951 bp的条带，其DNA序列如SEQ ID NO.6 所示；6个引物同时检测得到对应大小的DNA标记条带，是金针菇（Flammulina filiformis）‘农金49’菌株的标记。
3.根据权利要求2所述的黄色金针菇（Flammulina filiformis）‘农金49’菌株的分子标记鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系：1～1.5 μl含量80~150 ng的DNA，12.5μl Premix Taq，1 μl 浓度为10 μmol/L的正向引物，1 μl 浓度为10 μmol/L的反向引物，9～9.5 μl ddH2O，总体积25 μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，57 ℃退火30 sec，72 ℃延伸X,35个循环;72 ℃延伸10 min；其中引物F49P1、F49P3、F49P4的72℃延伸时间X为1min 45sec；引物F49P2、F49P5、F49P6的72℃延伸时间X为1 min10 sec。
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WO2012056811A1 (ja) * 2010-10-28 2012-05-03 株式会社雪国まいたけ キノコの菌体選別方法及びキット
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刘新锐 等: "高产金针菇新品种‘农金7号’", 《园艺学报》 *

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