CN111448989B

CN111448989B - 一种光亮瘤蕨的离体快繁方法

Info

Publication number: CN111448989B
Application number: CN202010423073.7A
Authority: CN
Inventors: 唐健民; 冼康华; 韦霄; 熊忠臣; 邹蓉; 史燕财; 柴胜丰; 蒋运生
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2020-05-19
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2040-05-19
Also published as: CN111448989A

Abstract

本发明涉及一种光亮瘤蕨的离体快繁方法，属于植物的组织培养技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：1)将消毒后的光亮瘤蕨孢子接种于初代诱导培养基中进行初代培养，得到原叶体；2)将原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行继代培养，得到孢子体；3)将孢子体转入生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。本发明方法简单易操作，可实现光亮瘤蕨种苗大批量生产。

Description

一种光亮瘤蕨的离体快繁方法

技术领域

本发明涉及植物的组织培养技术领域，具体涉及一种光亮瘤蕨的离体快繁方法，即促进光亮瘤蕨孢子体诱导和光亮瘤蕨的组织培养方法。

背景技术

光亮瘤蕨(Phymatosorus cuspidatus(D.Don)Pic.Serm)为水龙骨科(Polypodiaceae)瘤蕨属石上附生植物，植株高约40～100厘米。根状茎横走，粗约2厘米，灰绿色，疏被鳞片；鳞片卵圆形，盾状着生，褐色，边缘不整齐。叶远生；叶柄长约30～50厘米，禾秆色，粗壮，无毛；叶片一回羽状，长约30～50厘米，宽约20～25厘米；羽片约8～15对，长约15～20厘米，宽约2～3.5厘米，顶端渐尖，基部具柄(柄长达1厘米)，边缘全缘。侧脉不明显，小脉网状。叶近革质，两面光滑无毛。孢子囊群在羽片中脉两侧各1行，位于中脉与边缘之间；孢子表面具很小的颗粒状纹饰。在我国主要分布于云南、广西、西藏、四川、贵州、广东、海南等地，常见于海拔230～1600米林缘石灰岩石壁上(中国植物志)。光亮瘤蕨是一种传统的中药材，根状茎可入药，具有活血止痛、接骨消肿等功效。近年来，由于生境的破坏，野生资源日益减少，解决其繁殖问题显得极为迫切。目前，对光亮瘤蕨的组培研究已有少量报道，但操作较为复杂，且培养周期长、孢子体诱导率低，成效甚微。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光亮瘤蕨的离体快繁方法。本发明所述方法操作简单，能够在短时间内得到大量孢子体幼苗，孢子萌发率高，诱导出孢子体的效果好，批量生产光亮瘤蕨种苗，能够为后期光亮瘤蕨集约化种植打基础。

本发明提供了一种光亮瘤蕨的离体快繁方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的光亮瘤蕨孢子接种于初代诱导培养基中进行初代培养，得到原叶体；所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA0.2～0.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.5mg·L^-1、活性炭1.0～2.0g·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8；

2)将步骤1)得到的原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行继代培养，得到孢子体；所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA 0.2～1.0mg·L^-1、IBA 0.02～0.1mg·L^-1、ZnSO₄ 0.2～1.0mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8；

3)将步骤2)得到的孢子体转入生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.1～1.0mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。

优选的是，步骤1)所述消毒的方法包括以下步骤：

将长有成熟孢子囊的光亮瘤蕨羽片在质量百分含量为0.2％的洗衣粉水中浸泡5～12min，刷洗并用流水冲洗羽片表面，用体积百分含量为75％酒精表面消毒30～60s，0.1％HgCl₂消毒3～10min，无菌水漂洗、吸干，将孢子囊剥离于羽片，得到消毒后的光亮瘤蕨孢子。

优选的是，所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA0.2～0.4mg·L^-1、IAA 0.1～0.2mg·L^-1、活性炭1.0～2.0g·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH5.0～5.8。

优选的是，所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA0.2mg·L^-1、IAA0.2 mg·L^-1、活性炭1.0g·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.0～5.8。

优选的是，所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA0.4～0.6mg·L^-1、IBA 0.04～0.06mg·L^-1、ZnSO₄ 0.4～0.6mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。

优选的是，所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA0.4mg·L^-1、IBA0.04 mg·L^-1、ZnSO₄ 0.5 mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。

优选的是，所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.1～0.2mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。

优选的是，所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.1mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。

优选的是，所述初代培养、继代培养和生根培养的光照条件均为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

优选的是，所述初代培养的时间为30～40d，所述继代培养的孢子体诱导时间为60～90d，所述孢子体继代增殖时间为30～60d，所述生根培养的时间为10～20d。

本发明提供了一种光亮瘤蕨的离体快繁方法。本发明利用光亮瘤蕨的孢子作为外植体，采用本发明初代诱导培养基和孢子体诱导与继代增殖培养基对其进行孢子体诱导及继代增殖培养，利用生根培养基诱导孢子体生根，能够在短时间内得到大量孢子体幼苗，为光亮瘤蕨规模化种植奠定基础。试验结果表明，本发明培养得到的生根苗每株长根5～8条，根长2～3cm，生根率98％。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的孢子萌发形成的原叶体图片。

具体实施方式

本发明将消毒后的光亮瘤蕨孢子接种于初代诱导培养基中进行初代培养，得到原叶体；所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA0.2～0.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.5mg·L^-1、活性炭1.0～2.0g·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。在本发明中，所述消毒的方法优选包括以下步骤：将长有成熟孢子囊的光亮瘤蕨羽片在质量百分含量为0.2％的洗衣粉水中浸泡5～12min，更优选为10min，刷洗并用流水冲洗羽片表面，用体积百分含量为75％酒精表面消毒30～60s，质量百分浓度为0.1％HgCl₂消毒3～10min，无菌水漂洗、吸干，将孢子囊剥离于羽片，得到消毒后的光亮瘤蕨孢子。在本发明中，所述刷洗优选为用软毛笔或脱脂棉轻轻刷洗表面，注意不要刮掉孢子囊。在本发明中，所述消毒过程优选不停振荡。在本发明中，所述无菌水漂洗的次数优选为5次。在本发明中，所述吸干优选为使用无菌滤纸进行操作。在本发明中，所述接种优选为用镊子轻轻夹取孢子囊，将孢子囊剥离于羽片，然后接于初代诱导培养基中。本发明所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，优选还包括NAA 0.2～0.4mg·L^-1、IAA 0.1～0.2mg·L^-1、活性炭1.0～2.0g·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8；更优选还包括NAA 0.2mg·L^-1、IAA0.2mg·L^-1、活性炭1.0g·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.0～5.8。在本发明中，所述初代培养的光照条件优选为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。现有的光亮瘤蕨外植体消毒技术为剪取其带有成熟孢子的孢子叶，风干后取其成熟孢子进行预处理除去杂质作为外植体，用滤纸包好再运用常规消毒技术进行消毒灭菌，步骤繁琐，耗时长，且操作复杂，容易造成孢子的损耗；本发明剪取其带有成熟孢子的孢子叶后直接使用常规消毒技术进行消毒灭菌，再用镊子轻轻夹取灭完菌的孢子囊，接种于初代诱导培养基中，孢子萌发时间及萌发率与现有技术无显著差异，但简化了消毒灭菌的步骤，大大提高了实验效率。在本发明中，所述初代培养的时间优选为30～40d。光照培养相对暗培养孢子最早萌发时间无明显差异，但利于萌发的原叶体生长，30d观察结果显示，生长情况明显优于暗培养。

得到原叶体后，本发明将原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行继代培养，得到孢子体；所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA 0.2～1.0mg·L^-1、IBA 0.02～0.1mg·L^-1、ZnSO₄ 0.2～1.0mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。在本发明中，所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，优选还包括6-BA0.4～0.6mg·L^-1、IBA 0.04～0.06mg·L^-1、ZnSO₄ 0.4～0.6mg·L^-、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8；更优选还包括6-BA 0.4 mg·L^-1、IBA 0.04mg·L^-1、ZnSO₄ 0.5 mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。在本发明中，所述继代培养的光照条件优选为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。本发明在孢子体诱导与继代增殖阶段，添加适量浓度的ZnSO₄，锌对繁殖器官的形成起重要作用，可以在60～90d左右诱导得到孢子体，比现有技术缩短了6～7个月的时间。

得到孢子体后，本发明将孢子体转入生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.1～1.0mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。在本发明中，所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，优选还包括NAA 0.1～0.2mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8；更优选还包括NAA0.1 mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。在本发明中，所述生根培养的光照条件优选为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。由于光亮瘤蕨难以诱导孢子体，目前尚未有光亮瘤蕨有效的生根培养基配方，使用本发明的生根培养基及培养条件，在培养15d左右便可得到适宜移栽的生根苗，提高了移栽的成活率。

在本发明中，所述初代培养的时间为30～40d，所述继代培养的孢子体诱导时间为60～90d，所述孢子体继代增殖时间为30～60d，所述生根培养的时间为10～20d。初代培养时间与现有技术无明显差异，但简化了消毒灭菌操作，更利于光亮瘤蕨组培研究的开展；本发明在孢子体诱导与继代增殖阶段，添加适量浓度的ZnSO₄，锌对繁殖器官的形成起重要作用，可以在60～90d左右诱导得到孢子体，比现有技术缩短了6～7个月的时间；由于光亮瘤蕨难以诱导孢子体，目前尚未有光亮瘤蕨有效的生根培养基配方，使用本发明的生根培养基及培养条件，在培养15d左右便可得到适宜移栽的生根苗，提高了移栽的成活率。

本发明判定得到光亮瘤蕨无性系生根苗的基准与现有技术中其他植物进行生根培养时得到的生根苗的要求相同。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种光亮瘤蕨的离体快繁方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1)剪取长有成熟孢子囊的羽片，用0.2％的洗衣粉水浸泡约10min，用软毛笔或脱脂棉轻轻刷洗表面(注意不要刮掉孢子囊)，再用流水冲洗干净；将材料转至超净工作台内，用75％酒精表面消毒30～60s，0.1％HgCl₂消毒5min，不停振荡，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干水分；接种时用镊子轻轻夹取孢子囊，将孢子囊剥离于羽片，然后接于初代诱导培养基中。

2)光照培养30天，孢子萌发形成原叶体(如图1所示)，原叶体绿色、心形，成团，生长良好，萌发率73.58％；所用的初代诱导培养基配方为：1/2MS+NAA 0.2mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+活性炭1.0g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行培养，光照培养60天，诱导得到孢子体，将孢子体转接到原孢子体诱导与继代增殖培养基继续培养，30d增殖系数4.5，所得孢子体颜色鲜绿，生长健壮；所用孢子体诱导与继代增殖培养基配方为：MS+6-BA0.4mg·L^-1+IBA 0.04mg·L^-1+ZnSO₄ 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。该步骤中的培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

4)选取2cm以上的孢子体，分株转入生根培养基中，每个培养瓶中转入10～12株，光照培养14天，得到光亮瘤蕨生根苗，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率98％；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.1mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。步骤中的培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1。

5)将所得生根苗按常规方法进行炼苗，即可得到光亮瘤蕨优良无性系种苗。

本发明中外植体孢子无需经过风干等预处理，经过消毒灭菌后直接从羽片上刮取，接入初代诱导培养基中，光照培养30天，孢子萌发形成原叶体(如图1所示)，原叶体绿色、心形，成团，生长良好，萌发率73.58％；将所得原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行培养，光照培养60天，诱导得到孢子体，将孢子体转接到原孢子体诱导与继代增殖培养基继续培养，30d增殖系数4.5，所得孢子体颜色鲜绿，生长健壮；选取2cm以上的孢子体，分株转入生根培养基中，每个培养瓶中转入10～12株，光照培养14天，得到光亮瘤蕨生根苗，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率98％。本方案技术操作简单易行，孢子萌发率高，诱导出孢子体的效果最好，能够在短时间内得到大量孢子体幼苗，为批量生产光亮瘤蕨种苗提供了组培技术支持。

实施例2

重复实施例1，不同的是：

将步骤3)中孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA 0.4mg·L^-1+IBA0.02 mg·L^-1+ZnSO₄0.2 mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间为90d，孢子体继代增殖所得丛生苗较为粗壮、叶片鲜绿舒展，增殖系数4.2。

将步骤4)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 0.2 mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；丛生苗根系细长，生根率95％。

结果表明，相对于实施例1，本实施例孢子体诱导时间增加，继代增殖系数下降；根系细长，生根率降低。可能是ZnSO₄浓度降低，导致孢子体诱导时间增长，不是最优方案。

实施例3

重复实施例1，不同的是：

将步骤3)中孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IBA0.02mg·L^-1+ZnSO₄ 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间约为75d，孢子体继代增殖所得丛生苗较为细长、叶片鲜绿，部分有玻璃化，增殖系数3.1。

将步骤4)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA0.3 mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1；丛生苗根系相对较短，根毛少，生根率93％。

结果表明，相对于实施例1，本实施例孢子体诱导时间增加，继代增殖系数下降，部分有玻璃化现象；根系细长，生根率降低。BA浓度可能过高，增加了玻璃化发生的概率，不是最优方案。

实施例4

重复实施例2，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA0.6mg·L^-1+IBA0.06mg·L^-1+ZnSO₄ 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间约为66d，所得丛生苗较为健壮、叶片鲜绿，增殖系数4.0。不是最优方案。

实施例5

重复实施例2，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA0.6mg·L^-1+IBA0.02mg·L^-1+ZnSO₄ 0.8mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间约为80d，部分所得丛生苗生长差，增殖系数4.2。不是最优方案。

实施例6

重复实施例2，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA0.6mg·L^-1+IBA0.1mg·L^-1+ZnSO₄ 0.6mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间约为70d，所得丛生苗叶片淡绿色、茎秆纤细，增殖系数3.6。不是最优方案。

实施例7

重复实施例3，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA0.8mg·L^-1+IBA0.02mg·L^-1+ZnSO₄ 0.6mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间约为70d，所得丛生苗长势弱、植株矮小，增殖系数2.4。非最优方案。

实施例8

重复实施例3，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为MS+6-BA0.8mg·L^-1+IBA0.06mg·L^-1+ZnSO₄ 0.6mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH5.8；孢子体诱导时间约为72d，所得丛生苗叶片淡绿色、茎秆纤细，增殖系数2.7。

实施例9

重复实施例3，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA0.8mg·L^-1+IBA0.08mg·L^-1+ZnSO₄ 1.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；孢子体诱导时间约为75d，相当部分丛生苗生长差，变褐死亡，茎秆纤细，增殖系数3.3。高浓度的ZnSO₄可能不利于丛生苗的生长，导致褐化死亡，不是最优方案。

对比例1

重复实施例1，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA0.1mg·L^-1+IBA0.01mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；几乎无孢子体形成，原叶体鲜绿，增殖系数2.2。不添加ZnSO₄不利于孢子体的形成，6-BA浓度低，增殖系数小。

将步骤4)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1；丛生苗生长慢，所生根系细长，生根率75％。不添加NAA，根系细长，生根率一般。

对比例2

重复实施例1，不同的是：

将步骤3)中的孢子体诱导与继代增殖培养基配方修改为：MS+6-BA2.0mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1+ZnSO₄ 2.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；原叶体玻璃化，有大量愈伤生成，部分死亡，无孢子体形成。6-BA浓度可能过高，导致玻璃化发生率增高；高浓度的ZnSO₄可能不利于组培苗生长，造成死亡。

将步骤4)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 2.0mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1；丛生苗生长差，生根率71％。说明生根时NAA浓度不是越高越好。

实施例10

1)剪取长有成熟孢子囊的羽片，用0.2％的洗衣粉水浸泡约10min，用软毛笔或脱脂棉轻轻刷洗表面(注意不要刮掉孢子囊)，再用流水冲洗干净；将材料转至超净工作台内，用75％酒精表面消毒30～60s，0.1％HgCl₂消毒3min，不停振荡，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干水分；接种时用镊子轻轻夹取孢子囊，将孢子囊剥离于羽片，然后接于初代诱导培养基中。

2)光照培养7天，观察到大部分处理染菌，污染率80％；培养30天，剩余的孢子萌发形成原叶体，原叶体绿色、心形，成团，生长良好，萌发率50％；所用的初代诱导培养基配方为：1/2MS+NAA 0.5mg·L^-1+IAA 0.5mg·L^-1+活性炭1.0g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行培养，光照培养65天，诱导得到孢子体，将孢子体转接到原孢子体诱导与继代增殖培养基继续培养，30d增殖系数3.8，所得孢子体颜色鲜绿，生长健壮；所用孢子体诱导与继代增殖培养基配方为：MS+6-BA0.6mg·L^-1+IBA 0.08mg·L^-1+ZnSO₄ 0.4mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。该步骤中的培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

4)选取2cm以上的孢子体，分株转入生根培养基中，每个培养瓶中转入10-12株，光照培养10天，得到光亮瘤蕨生根苗，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率80％；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.8mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。步骤中的培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1。

5)将所得生根苗按常规方法进行炼苗，即可得到光亮瘤蕨优良无性系种苗。该实施例表明，0.1％HgCl₂处理外植体3min，消毒灭菌不彻底，容易染菌；所使用的孢子体诱导培养基可以诱导出孢子体，但可能由于各激素配比不是最佳方案，增殖系数一般；所使用生根培养基生根率也一般，综上所述，本方案不是最优方案。

实施例11

1)剪取长有成熟孢子囊的羽片，用0.2％的洗衣粉水浸泡约10min，用软毛笔或脱脂棉轻轻刷洗表面(注意不要刮掉孢子囊)，再用流水冲洗干净；将材料转至超净工作台内，用75％酒精表面消毒30～60s，0.1％HgCl₂消毒10min，不停振荡，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干水分；接种时用镊子轻轻夹取孢子囊，将孢子囊剥离于羽片，然后接于初代诱导培养基中。

2)光照培养50天，孢子萌发形成原叶体，原叶体绿色、心形，成团，生长良好，萌发率25％；所用的初代诱导培养基配方为：1/2MS+NAA 0.4mg·L^-1+IAA 0.4mg·L^-1+活性炭1.0g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH5.8。培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行培养，光照培养75天，诱导得到孢子体，将孢子体转接到原孢子体诱导与继代增殖培养基继续培养，30d增殖系数4.1，所得孢子体颜色鲜绿，生长健壮，基部有愈伤形成；所用孢子体诱导与继代增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IBA 0.08 mg·L^-1+ZnSO₄ 0.4mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH5.8。该步骤中的培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

4)选取2cm以上的孢子体，分株转入生根培养基中，每个培养瓶中转入10-12株，光照培养20天，得到光亮瘤蕨生根苗，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率90％；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.6mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。步骤中的培养条件为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1。

5)将所得生根苗按常规方法进行炼苗，即可得到光亮瘤蕨优良无性系种苗。该实施例表明，0.1％HgCl₂处理外植体10min，消毒灭菌时间可能过长，抑制了孢子的萌发，导致萌发时间延长，萌发率下降；所使用的孢子体诱导培养基可以诱导出孢子体，但可能6-BA浓度过高，基部有愈伤形成；所使用生根培养基生根时间较长，但根系粗壮。综上所述，本方案不是最优方案。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种光亮瘤蕨的离体快繁方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的光亮瘤蕨孢子接种于初代诱导培养基中进行初代培养，得到原叶体；所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.2～0.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.5mg·L^-1、活性炭1.0～2.0g·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8；

2)将步骤1)得到的原叶体转入孢子体诱导与继代增殖培养基中进行继代培养，得到孢子体；所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA 0.2～1.0mg·L^-1、IBA 0.02～0.1mg·L^-1、ZnSO₄ 0.2～1.0mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH5.0～5.8；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述消毒的方法包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.2～0.4mg·L^-1、IAA 0.1～0.2mg·L^-1、活性炭1.0～2.0g·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述初代诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.2mg·L^-1、IAA 0.2mg·L^-1、活性炭1.0g·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.0～5.8。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA 0.4～0.6mg·L^-1、IBA 0.04～0.06mg·L^-1、ZnSO₄ 0.4～0.6mg·L^-1、蔗糖20～30g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述孢子体诱导与继代增殖培养基以MS为基础培养基，还包括6-BA 0.4mg·L^-1、IBA 0.04mg·L^-1、ZnSO₄ 0.5 mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.1～0.2mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1和琼脂3～4g·L^-1，pH 5.0～5.8。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括NAA 0.1mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初代培养、继代培养和生根培养的光照条件均为：温度为25～31℃，光照时间为10～15h·d^-1，光照强度为35～45μmol·m^-2·s^-1。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初代培养的时间为30～40d，所述继代培养的孢子体诱导时间为60～90d，所述孢子体继代增殖时间为30～60d，所述生根培养的时间为10～20d。