CN116098065B - 一种尖顶夭命藓的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尖顶夭命藓的组织培养方法，包括尖顶夭命藓孢子作为外植体进行孢子萌发、配子体诱导与离体保存的步骤，其中：孢子萌发培养基配方为：MS+BA0.1‑1.0mg·L‑1、NAA0.1‑0.5mg·L‑1、蔗糖20‑30g·L‑1、琼脂3‑4g·L‑1，pH5.0‑5.8；配子体诱导和继代增殖培养基配方为：MS+BA0.2‑2.0mg·L‑1、NAA0.1‑1.0mg·L‑1、蔗糖20‑30g·L‑1、琼脂3‑4g·L‑1，pH5.0‑5.8；配子体离体保存培养基配方为：MS+BA0.1‑0.5mg·L‑1、IAA0.01‑0.05mg·L‑1、活性炭0.5‑2.0g·L‑1、蔗糖20‑30g·L‑1、琼脂3‑4g·L‑1，pH5.0‑5.8。
Description
技术领域
本发明涉及植物的组织培养领域，具体涉及一种尖顶夭命藓的组织培养及尖顶夭命藓配子体诱导、离体保存的方法。
背景技术
尖顶夭命藓(Ephemerum apiculatum P.C.Chen)为夭命藓属植物，植物体高2.5-3mm。茎短而细，长约1mm。基叶小，卵状披针形，上部叶狭长披针形，长约2.5mm，宽约0.4mm，先端细长渐尖，中下部全缘，上部有锯齿；中肋长达叶尖；叶上部细胞不规则狭长菱形，先端细胞多具前角疣状突，基部细胞较宽大，长方形。蒴柄极短，仅长0.3mm；蒴柄圆球形，先端具圆形短尖头；蒴帽小，圆锥形；孢子较大，圆球形，外壁具密疣。夭命藓是世界上最矮的苔藓植物，由于个体小，热带雨林中常附生在热带雨林中乔灌木的叶子上，一片小树叶上可以长几十甚至几百株，构成热带雨林奇观——“叶附生”现象。尖顶夭命藓为我国特有种，通常生于潮湿地上，主要分布于广东、江西、江苏、重庆等地。近年来，由于环境污染及湿地生境退缩、破坏等原因，尖顶夭命藓野生资源日益减少。利用组织培养可以快速繁育种苗的特点，开展尖顶夭命藓组织培养研究，对保护和开发利用尖顶夭命藓等我国苔藓植物特有种质资源具有重要的意义。植物组织培养技术最初是从苔藓植物中开始的，但因苔藓植物组织结构和生活习性与其他高等植物差别较大，常规的培养条件对其并不适合，因而如何提供一种针对尖顶夭命藓的组织培养方法是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种尖顶夭命藓的组织培养方法，通过孢子快速诱导配子体和配子体离体保存的组织培养技术，以尖顶夭命藓的孢子作为外植体诱导原丝体，原丝体再诱导培育出配子体，并开展了配子体植株离体保存研究。本发明操作简单，具有孢子萌发率高，配子体诱导快、诱导效果稳定等特点，首次实现了对世界上最矮小的苔藓植物尖顶夭命藓的人工快繁，可以为尖顶夭命藓的可持续开发利用提供技术参考，该技术操作简单，能够达到快速诱导孢子形成配子体和长期离体保存的目的。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，
一种尖顶夭命藓的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一：孢子消毒，选取健康成熟的孢蒴，放入无纺布袋中，用0.2wt％的洗衣粉水浸泡5-12min后取出，刷洗表面，再用水冲洗干净，将上述材料装入灭菌无纺布袋中，用75vt％的酒精浸泡40-80s后取出，再置于0.1wt％HgCl2中浸泡5-15min后取出，用无菌水漂洗5次，将孢蒴取出吸干水分，备用；
优选的，用0.2wt％的洗衣粉水浸泡10min，用脱脂棉轻轻刷洗表面，注意不要弄破孢蒴，再用流水冲洗干净。
优选的，所述消毒过程中优选不停振荡；所述吸干优选为使用无菌滤纸进行操作。
步骤二：获得无菌原丝体，将上述步骤一所得孢蒴接种于初代诱导培养基中，光照培养，直至外植体上的孢子萌发；
优选的，所述接种优选为用镊子轻轻夹破孢子，然后点接于初代诱导培养基中。
优选的，所述光照条件为：温度25-31℃、光照时间10-15h·d-1、光照强度35-45μmol·m-2·s-1。
所述初代诱导培养基配方为：MS+BA 0.1-1.0mg·L-1、NAA 0.1-0.5mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH 5.0-5.8；
优选的，初代诱导培养基配方为MS+BA 0.4-0.8mg·L-1、NAA 0.1-0.3mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH 5.0-5.8。
更优选的，初代诱导培养基配方为MS+BA 0.6mg·L-1、NAA 0.2mg·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂3.5g·L-1，pH 5.8。
步骤三：配子体诱导，将上述步骤二所得无菌原丝体转入配子体诱导培养基中，光照培养，直至形成根茎叶分化的配子体植株；
优选的，光照条件为：温度25-31℃、光照时间10-15h·d-1、光照强度为35-45μmol·m-2·s-1。
所述的原丝体配子体诱导培养基配方为：MS+BA 0.2-2.0mg·L-1、NAA 0.1-1.0mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH 5.0-5.8；
优选的，原丝体配子体诱导培养基配方为MS+BA 0.6-1.2mg·L-1、NAA 0.1-0.3mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8。
更优选的，原丝体配子体诱导培养基配方为MS+BA 1.0mg·L-1、NAA 0.2mg·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂4g·L-1，pH 5.8。
步骤四：配子体离体保存，选取上述步骤三所得生长健壮的配子体，分离成0.5-1.0m3的小块，转入配子体离体保存培养基中进行保存；
优选的，用镊子和剪刀轻轻分离成小块，转入配子体离体保存培养基中。
优选的，培养条件为，温度25-31℃，光照时间9-12h·d-1，光照强度35-45μmol·m-2·s-1。
所述配子体离体保存培养基配方为：MS+BA 0.1-0.5mg·L-1、IAA 0.01-0.05mg·L-1、活性炭0.5-2.0g·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH 5.0-5.8。
优选的，配子体离体保存培养基配方为MS+BA 0.2-0.4mg·L-1、IAA 0.02-0.04mg·L-1、活性炭0.8-1.2g·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8。
更优选的，配子体离体保存培养基配方为MS+BA 0.2mg·L-1、IAA 0.02mg·L-1、活性炭1.0g·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂4g·L-1，pH 5.8。
本发明有益效果如下：
1)现有的苔藓植物孢子外植体消毒完成后通常先制成孢子悬浮液，接种时再用移液枪吸取悬浮液接种至培养基中，步骤繁琐，耗时长，且操作复杂，容易造成孢子的损耗和污染。本发明使用灭菌无纺布袋作为容器，便于消毒程序的开展，消毒完成后不制成孢子悬浮液，而是在接种时用镊子轻轻夹破孢蒴，点接于初代诱导培养基中，孢子萌发时间及萌发率与现有技术无显著差异，但简化了消毒灭菌的步骤，大大提高了实验效率，且污染率大幅降低，仅为5％。使用本发明的外植体处理和消毒方法，污染率低，孢子萌发快，30-50d左右便可观测到培养基上有绿色，培养120d，原丝体颜色鲜绿，生长良好；
2)本发明通过添加适宜配比组合的外源激素BA和NAA，能快速诱导原丝体形成配子体，配子体诱导率高，颜色翠绿，生长健壮；
3)尖顶夭命藓在不适宜的培养基中保存时容易出现发黄变褐，甚至死亡的现象。本发明通过添加适宜配比组合的外源激素BA和IAA，能达到长时间离体保存尖顶夭命藓的目的，配子体生长良好，长时间保存后再次启动生长快，离体保存效果稳定；
4)本发明中，所述初代诱导萌发时间为30-50d，配子体诱导所需时间为20-40d；配子体离体保存时间最长能达200-230d，转入增殖培养基后仍能快速恢复生长，配子体诱导快，效果稳定；
5)本发明具有孢子萌发率高，配子体诱导快、诱导效果稳定等特点，首次实现了对世界上最矮小的苔藓植物尖顶夭命藓的人工快繁。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1孢子诱导得到的原丝体；
图2为本发明实施例1原丝体诱导得到的配子体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)外植体消毒：选取尖顶夭命藓健康成熟的孢蒴，装入无纺布袋中，用0.2％(w/w)的洗衣粉水浸泡10min，脱脂棉轻轻刷洗表面，再用流水冲洗干净；将材料转至超净工作台内，装入灭过菌的无纺布袋中，将装有孢蒴的无纺布袋浸没于75％(v/v)酒精中消毒50s后取出，再置于0.1％(w/w)HgCl2中浸泡6min，期间不停振荡，取出，无菌水漂洗5次；将孢蒴取出用无菌滤纸吸干水分，得到消毒后的尖顶夭命藓孢蒴。接种时用镊子轻轻夹破孢蒴，然后点接于初代诱导培养基中；
2)孢子萌发：光照培养30d，观测到培养基上有绿色，继续培养30d，原丝体团颜色鲜绿，生长良好，60d孢子萌发率80.5％；所用的初代诱导培养基配方为：MS+BA 0.6mg·L-1、NAA 0.2mg·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂3.5g·L-1，pH 5.8。培养条件为：温度为25-31℃，光照时间为10-15h·d-1，光照强度为35-45μmol·m-2·s-1；
3)尖顶夭命藓配子体诱导和继代增殖：将所得无菌原丝体转入配子体诱导和继代增殖培养基中，光照培养20d，便可显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色翠绿，生长良好；继续培养30d，配子体增殖系数为6.0；所述的配子体诱导和继代增殖培养基配方为：MS+BA 1.0mg·L-1、NAA 0.2mg·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂4g·L-1，pH 5.8；该步骤中培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为10-15h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1；
4)得到生长健壮的配子体后，用镊子和剪刀轻轻分离成0.5-1.0m3的小块，转入配子体离体保存培养基中，配子体颜色鲜绿，生长良好，离体保存时间最长能达230d，转入上述增殖培养基后7d可以观测到配子体恢复生长；所述配子体离体保存培养基配方为：MS+BA0.2mg·L-1、IAA 0.02mg·L-1、活性炭1.0g·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂4g·L-1，pH 5.8。该步骤中培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为9-12h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，将步骤3)中配子体诱导和继代增殖培养基配方修改为：MS+BA 10.0mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8；光照培养40d，原丝体团浅黄绿色，大部分原丝体有玻璃化现象，生长不均匀，显微镜观测不到形成根茎叶分化的配子体植株，说明生长激素浓度并不是越高越好，高浓度的生长激素可能抑制了原丝体的生长和发育。
对比例2
与实施例1的不同之处在于，将步骤4)中配子体诱导和继代增殖培养基配方修改为：MS+BA 1.0mg·L-1+IAA 0.1mg·L-1+AgNO30.5 mg/L+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH5.8；光照培养30d，大部分原丝体团变褐并逐步死亡，生长差，说明不适宜的植物生长调节剂组合和浓度会抑制原丝体的生长和发育。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，将步骤3)中配子体诱导和继代增殖培养基配方修改为：MS+BA 2.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8；光照培养30d，显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色浅绿色，有轻微玻璃化；继续培养30d，配子体增殖系数为3.0；配子体诱导时间长于实施例1，且生长状态及增殖系数均差于实施例1，说明生长激素浓度并不是越高越好，需要将其控制在一定的范围内，过高浓度的生长激素可能抑制了配子体的诱导和生长。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，将步骤4)中配子体离体保存培养基配方修改为：MS+BA 0.5mg·L-1+IAA 0.05mg·L-1+活性炭1.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。配子体颜色鲜绿，生长良好，离体保存最长时间为200d，转入增殖培养基后9d可以观测到配子体恢复生长；离体保存时间少于实施例1，转入增殖培养基后整体恢复时间增加，表明激素水平也需要控制在一定的范围内，并不是越高越有利于配子体的离体保存。
实施例4
与实施例1的不同之处在于，将步骤3)中初代诱导培养基配方为：MS+BA 1.0mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂3.5g·L-1，pH 5.8。光照培养30d，观测到培养基上有绿色，继续培养30d，原丝体团颜色鲜绿，生长良好，60d孢子萌发率72.5％；相对于实施例1，孢子萌发率下降，可能是提高了BA、NAA的浓度，促使部分萌发的原丝体向配子体阶段发育，可能影响了孢子的萌发效应；也可能是高浓度的生长激素对孢子的萌发有一定的抑制作用。
实施例5
与实施例1的不同之处在于，将步骤3)中配子体诱导和继代增殖培养基配方修改为：MS+BA 0.8mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8；光照培养20d，显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色鲜绿，生长良好；继续培养30d，配子体增殖系数为4.5；原丝体发育形成配子体时间短于实施例2，配子体生长状态和增殖系数均优于实施例2，表明适宜的激素水平有利于配子体的形成和生长。
实施例6
与实施例2的不同之处在于，将步骤4)中配子体离体保存培养基配方修改为：MS+BA 0.1mg·L-1+IAA 0.01mg·L-1+活性炭1.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。配子体颜色鲜绿，生长良好，离体保存最长时间为180d，转入增殖培养基后15d可以观测到配子体恢复生长；离体保存时间少于实施例2，转入增殖培养基后整体恢复时间增加，表明激素水平较低可能不足以支持配子体的长时间生长，导致离体保存时间减少、恢复时间增加。
实施例7
与实施例2的不同之处在于，将步骤3)中配子体诱导和继代增殖培养基配方修改为：MS+BA 1.2mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8；光照培养22d，显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色鲜绿，生长良好；继续培养30d，配子体增殖系数为5.5；原丝体发育形成配子体时间短于实施例2，配子体生长状态和增殖系数均优于实施例2，表明适宜的激素水平有利于配子体的形成和生长。
实施例8
与实施例4的不同之处在于，将步骤4)中配子体离体保存培养基配方修改为：MS+BA 0.3mg·L-1+IAA 0.03mg·L-1+活性炭1.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。配子体颜色鲜绿，生长良好，离体保存最长时间为208d，转入增殖培养基后7d可以观测到配子体恢复生长；离体保存时间长于实施例4，转入增殖培养基后整体恢复时间减少，表明适宜的激素水平有利于配子体的离体保存。
实施例9
与实施例4的不同之处在于，将步骤3)中配子体诱导和继代增殖培养基配方修改为：MS+BA 0.4mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8；光照培养35d，显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色鲜绿；继续培养30d，配子体增殖系数为4.2，生长良好；配子体诱导时间长于实施例4，增殖系数低于实施例4，说明生长激素浓度降低可能抑制了配子体的诱导和增殖。
对比例3
1)外植体消毒：选取尖顶夭命藓健康成熟的孢蒴，装入无纺布袋中，用0.2％(w/w)的洗衣粉水浸泡10min，脱脂棉轻轻刷洗表面，再用流水冲洗干净；将材料转至超净工作台内，装入灭过菌的无纺布袋中，将装有孢蒴的无纺布袋浸没于75％(v/v)酒精中消毒50s后取出，再置于0.1％(w/w)HgCl2中浸泡4min，期间不停振荡，取出，无菌水漂洗5次；将孢蒴取出用无菌滤纸吸干水分，得到消毒后的尖顶夭命藓孢蒴。接种时用镊子轻轻夹破孢蒴，然后点接于初代诱导培养基中。
2)孢子萌发：光照培养10d，观察到部分处理染菌，随着培养时间的增加，后期染菌现象时有发生，平均污染率为40％；培养30天，观测到培养基上有绿色，继续培养30d，原丝体团颜色鲜绿，生长良好，60d孢子萌发率75.2％；所用的初代诱导培养基配方为：MS+BA0.5mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂3.5g·L-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为10-15h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。相比于实施例1，污染率有所提高，可能是灭菌时间减少所致；孢子萌发率也有所下降，可能是BA浓度下降，导致对孢子萌发的促进作用降低所致。
3)尖顶夭命藓配子体诱导和继代增殖：将所得无菌原丝体转入配子体诱导和继代增殖培养基中，光照培养28d，在显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色翠绿，生长良好；继续培养30d，配子体增殖系数为3.8；所述的配子体诱导和继代增殖培养基配方为：MS+BA 0.2mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。该步骤中培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为10-15h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。相比于实施例1，原丝体发育成配子体的时间增加，配子体增殖系数降低，可能是BA和NAA浓度下降，对原丝体发育和配子体生长的促进作用降低所致。
4)得到生长健壮的配子体后，用镊子和剪刀轻轻分离成0.5-1.0m3的小块，转入配子体离体保存培养基中，配子体颜色鲜绿，生长良好，离体保存时间最长能达200d，转入上述增殖培养基后12d可以观测到配子体恢复生长；所述配子体离体保存培养基配方为：MS+BA 0.2mg·L-1+IAA 0.01mg·L-1+活性炭0.5g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。该步骤中培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为9-12h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。与实施例1相比，离体保存时间减少，恢复生长时间增加，可能是激素浓度的配比或/和活性炭浓度发生变化所致。
实施例10
外植体消毒：选取尖顶夭命藓健康成熟的孢蒴，装入无纺布袋中，用0.2％(w/w)的洗衣粉水浸泡10min，脱脂棉轻轻刷洗表面，再用流水冲洗干净；将材料转至超净工作台内，装入灭过菌的无纺布袋中，将装有孢蒴的无纺布袋浸没于75％(v/v)酒精中消毒50s后取出，再置于0.1％(w/w)HgCl2中浸泡10min，期间不停振荡，取出，无菌水漂洗5次；将孢蒴取出用无菌滤纸吸干水分，得到消毒后的尖顶夭命藓孢蒴。接种时用镊子轻轻夹破孢蒴，然后点接于初代诱导培养基中。
2)孢子萌发：培养46天，观测到培养基上有绿色，继续培养30d，原丝体团颜色鲜绿，生长良好，孢子萌发率45.2％；所用的初代诱导培养基配方为：MS+BA 0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂3.5g·L-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为10-15h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。相比于实施例1，孢子萌发时间增加而萌发率显著降低，可能是灭菌时间太长，抑制了孢子的生长发育。
3)尖顶夭命藓配子体诱导和继代增殖：将所得无菌原丝体转入配子体诱导和继代增殖培养基中，光照培养26d，在显微镜观测到形成根茎叶分化的配子体植株，配子体颜色翠绿，生长良好；继续培养30d，配子体增殖系数为4.8；所述的配子体诱导和继代增殖培养基配方为：MS+BA 1.5mg·L-1+NAA 0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。该步骤中培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为10-15h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。相比于实施例1，原丝体发育成配子体的时间增加，配子体增殖系数降低，可能是BA和NAA浓度升高，抑制了原丝体的发育和配子体的生长，表明激素浓度并不是越高越好。
4)得到生长健壮的配子体后，用镊子和剪刀轻轻分离成0.5-1.0m3的小块，转入配子体离体保存培养基中，配子体颜色黄绿色，生长一般，离体保存时间最长能达190d，转入上述增殖培养基后15d可以观测到配子体恢复生长；所述配子体离体保存培养基配方为：MS+BA 0.4mg·L-1+IAA 0.01mg·L-1+活性炭1.0g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂4g·L-1，pH 5.8。该步骤中培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为9-12h·d-1，光照强度为40±5μmol·m-2·s-1。与实施例1相比，配子体生长状态有所下降，离体保存时间减少，恢复生长时间增加，可能是激素浓度的配比发生变化所致。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：孢子消毒，选取健康成熟的孢蒴，放入无纺布袋中，用0.2wt％的洗衣粉水浸泡5-12min后取出，刷洗表面，再用水冲洗干净后，放入无菌环境中，用75％v/v的酒精浸泡40-80s后取出，再置于0.1wt％HgCl2中浸泡5-15min后取出，用无菌水漂洗5次，将孢蒴取出吸干水分，备用；
步骤二：获得无菌原丝体，将上述步骤一所得孢蒴接种于初代诱导培养基中，光照培养，光照条件为：温度25-31℃、光照时间10-15h·d-1、光照强度35-45μmol·m-2·s-1，直至外植体上的孢子萌发，得无菌原丝体；
所述初代诱导培养基配方为：MS+BA0.1-1.0mg·L-1、NAA0.1-0.5mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8；
步骤三：配子体诱导，将上述步骤二所得无菌原丝体转入配子体诱导和继代增殖培养基中，光照培养，光照条件为：温度25-31℃、光照时间10-15h·d-1、光照强度为35-45μmol·m-2·s-1，直至形成根茎叶分化的配子体植株；
所述的配子体诱导和继代增殖培养基配方为：MS+BA0.2-2.0mg·L-1、NAA0.1-1.0mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8；
步骤四：配子体离体保存，选取上述步骤三所得生长健壮的配子体，分离成小块，转入配子体离体保存培养基中进行保存，保存条件为，温度25-31℃，光照时间9-12h·d-1，光照强度35-45μmol·m-2·s-1；
所述配子体离体保存培养基配方为：MS+BA0.1-0.5mg·L-1、IAA0.01-0.05mg·L-1、活性炭0.5-2.0g·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8。
2.根据权利要求1所述的一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，步骤二中所述初代诱导培养基配方为：MS+BA0.4-0.8mg·L-1、NAA0.1-0.3mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8。
3.根据权利要求1所述的一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，步骤二中所述初代诱导培养基配方为：MS+BA0.6mg·L-1、NAA0.2mg·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂3.5g·L-1，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，步骤三中所述配子体诱导培养基配方为：MS+BA0.6-1.2mg·L-1、NAA0.1-0.3mg·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8。
5.根据权利要求1所述的一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，步骤三中所述配子体诱导培养基配方为：MS+BA1.0mg·L-1、NAA0.2mg·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂4g·L-1，pH5.8。
6.根据权利要求1所述的一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，步骤四中所述配子体离体保存培养基配方为，MS+BA0.2-0.4mg·L-1、IAA0.02-0.04mg·L-1、活性炭0.8-1.2g·L-1、蔗糖20-30g·L-1、琼脂3-4g·L-1，pH5.0-5.8。
7.根据权利要求1所述的一种尖顶夭命藓的组织培养方法，其特征在于，步骤四中所述配子体离体保存培养基配方为，MS+BA0.2mg·L-1、IAA0.02mg·L-1、活性炭1.0g·L-1、蔗糖30g·L-1、琼脂4g·L-1，pH5.8。
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| CN103651140A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-26 | 上海师范大学 | 一种离体快繁短月藓配子体的方法及其培养基 |
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