CN111366731A - 一种检测蛋白质和rna相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法，包括如下步骤：(1)提供亲和素标记的RNA，进行生物素标记；(2)取步骤(1)所得RNA，加入结构缓冲液，使得RNA形成二级结构，然后加热、冰浴、室温静置；(3)提供纯化的蛋白；(4)将步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白混合，利用BLI生物干涉膜方法，对步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白进行动力学检测，即得。本发明首次利用BLI生物干涉膜技术检测蛋白质与lncRNA相互作用，与现有方法比较，本发明可同时检测3个以上蛋白与lncRNAs相互作用，可在30分钟内完成检测，具有检测快速，可精确定量相互作用力的强弱，能实现高通量检测等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物大分子技术领域，尤其是一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法。
背景技术
RNA Pull-down是现在检测RNA与蛋白质相互作用最常用的方法之一；RNA Pull-down是定性的检测，无法定量检测RNA与蛋白质结合强弱。BLI生物膜干涉技术常用与检测蛋白与蛋白的相互作用，蛋白与小分子的相互作用。现有技术中并没有能准确检测蛋白质和RNA相互作用力强弱的方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能准确检测蛋白质和RNA相互作用力的强弱的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法，包括如下步骤：(1)提供亲和素标记的RNA，进行生物素标记；(2)取步骤(1)所得RNA，加入结构缓冲液，使得RNA形成二级结构，然后加热、冰浴、室温静置；(3)提供纯化的蛋白；(4)将步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白混合，利用BLI生物干涉膜方法，对步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白进行动力学检测，即得。
优选地，所述RNA为lncRNA(长链非编码RNA)。
优选地，所述步骤(2)中结构缓冲液中含有：10mM Tris，0.1M KCl和10mM MgCl2；且结构缓冲液的pH值为7.0。
优选地，所述步骤(4)中BLI生物干涉膜方法包括以下5个步骤：
(4.1)基线均一化(Baseline)，时间为1min；
(4.2)固化，通过SR固化传感器捕捉生物素标记的lncRNA,lncRNA的浓度范围为100-200nM，固化时间为5-10min；
(4.3)基线均一化(Baseline)，时间为3min；
(4.4)结合(Association)，在样品板检测孔加入不同浓度梯度纯化蛋白，使之与固化的lncRNAs相互结合，结合(Association)时间为5-10min；
(4.5)解离(Dissociation)，时间为5-10min。
优选地，所述步骤(3)中蛋白纯化的步骤包括：
(3.1)将重组蛋白表达菌株按1:100比例稀释后，转接至1L的LB培养瓶中，37℃，220rpm培养2.5-3h，加入诱导剂诱导；
(3.2)将步骤(3.1)所得菌株转移至25-28℃摇床，160rpm，培养12-16h；收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，加入50mM Tris-HCl，于超声破碎仪上超声破碎，破碎完后离心，之后分离上清液；
(3.3)步骤(3.2)所得上清液加入1-2mL经水洗过的镍亲和树脂，于4℃缓慢摇动1h，过柱；所得全部上清液添加镍树脂混合液过柱2次，后用20倍柱床体积超声破碎缓冲液平衡柱床，再用20mM咪唑溶液洗涤20倍的柱床体积，以除去杂蛋白；之后依次用50mM、100mM、200mM、500mM咪唑溶液洗涤10倍的柱床体积，各梯度洗脱液分别回收；
(3.4)分别取10ul步骤(3.3)所得各梯度洗脱液，然后各加入10ul SDS上样缓冲液，煮沸10min后，进行SDS-PAGE电泳检测，根据电泳结果，选择相对较纯的梯度洗脱液，分装冻存即得。其中，步骤(3.2)中Tris-HCl的pH值优选为7.4。
优选地，所述步骤(3.1)中，诱导剂为IPTG，IPTG的加入量为：每300ml培养液加入50ul 0.5M的IPTG。
优选地，所述步骤(3.2)中，超声破碎的时间为50min，超声破碎仪的参数设置为：功率设置为30％；每超声4s，停3s。
优选地，所述步骤(3.2)中，超声破碎后离心条件为：14000rpm，离心35min；或9000rpm，离心90min。
优选地，所述步骤(3.3)中，咪唑溶液的pH值为7.4-8.0，其中还含有50mM Tris-HCl。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明首次利用BLI生物干涉膜技术检测蛋白质与lncRNA相互作用，与现有方法比较，本发明可同时检测3个以上蛋白与lncRNA相互作用，可在30分钟内完成检测，具有检测快速，可精确定量相互作用力的强弱，能实现高通量检测等优点。
附图说明
图1为本发明中蛋白质与RNA相互作用的动力学检测结果图。
具体实施方式
本发明首次利用BLI生物干涉膜技术检测蛋白与lncRNA的相互作用。整个检测过程仅需30min左右，且检测灵敏度高，可进行批量检测，可实现高通量样品快速检测。
本发明通过生物素固化的传感器捕获被链霉亲和素标记的体外转录的lncRNA，通过与蛋白结合并计算其结合及解离常数，以此实现实时动态的比较蛋白质与lncRNA相互作用能力。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。
实施例1
本发明的检测蛋白质和RNA相互作用的方法的一种实施例，包括如下步骤：
第一步：体外转录lncRNA：
①体外转录并通过链霉亲和素标记lncRNA；
1、质粒转化、涂板、摇菌；
2、质粒中提；
3、质粒线性化；
4、琼脂糖凝胶电泳；
5、胶回收；
6、转录以及生物素标记；
②取无RNA酶管，按下表1操作：
表1反应体系
37℃孵育2h。
③取出孵育好的EP管，加入2μl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去体系中的DNA。
④取出上述操作的EP管，加入2μl 0.2M EDTA(pH＝8.0)终止反应。
取1μg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer(结构缓冲液，10mM TrispH＝7.0，0.1M KCl，10mM MgCl2)，使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。
第二步：纯化蛋白：
①小量诱导已表达的重组蛋白表达菌株，1:100转接至1L的LB培养瓶中(最多只能装300ml培养基)，37℃，220rpm培养2.5-3h，加入0.5M的IPTG诱导剂(每300ml加入50ulIPTG)。
②转移至25-28℃摇床，160rpm，培养12-16h。收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，加入50mM Tris-HCl(PH7.4)。于超声破碎仪上超声破碎50min，功率设置为:30％，超声4s，停3s。破碎完后于14000rpm，离心35min；或者9000rpm，离心90min，离心后分离上清液。
③上清液加入1-2mL经水洗过的镍亲和树脂。于4℃缓慢摇动1h，即可过柱。全部上清液+镍树脂混合液过柱2次，后用20倍柱床体积超声破碎Buffer平衡柱床(20-30ml)，再用20mM咪唑(pH:7.4-8.0，含50mMTris-HCl)洗涤20倍的柱床体积，以除杂蛋白，洗脱液要回收；后依次用50mM、100mM、200mM、500mM咪唑(pH:7.4-8.0，含50mMTris-HCl)洗涤10倍的柱床体积，各梯度洗脱液分别回收。短期使用可分装冻存-20℃，长期建议分装冻存-80℃。
④取10ul洗脱液+10ul SDS loading buffer混合均匀，煮沸10min后，进行SDS-PAGE电泳检测。根据电泳结果，选择较纯的梯度洗脱液，分装冻存。
第三步：利用BLI生物干涉膜技术，对样品进行动力学检测：
1实验准备：样品板，分别加入缓冲液，固化样品，结合样品，再生缓冲液等；预湿板，分别加入固化缓冲液。按照顺序放入传感器盘和样品板，关好仪器门；
2在ForteBio Octet分子互作仪上设置程序，通过BLI生物干涉膜技术进行动力学检测；
整个过程分为5步：(1)Baseline，1min；(2)固化，通过SR固化传感器捕捉生物素化标记lncRNAs(表示多个lncRNA),lncRNAs的浓度范围为100-200nM；固化时间5-10min；(3)Baseline，3min；(4)Association，在样品板检测孔加入不同浓度梯度纯化蛋白，使之与固化的lncRNAs发生相互结合；Association时间为5-10min；(5)Dissociation，5-10min；
整个过程仅需30min左右，且检测灵敏度高，可进行批量检测，可实现高通量样品快速检测。
实施例2
采用实施例1的检测蛋白质和RNA相互作用的方法检测protein Y(UniProtKB-P46937)与lncRNA G(NCBI Reference Sequence:NR_002578.3)的相互作用强弱：
首先，通过SR固化传感器捕捉生物素化标记lncRNA G，lncRNA的浓度为200nM；
其次，通过纯化protein Y，将不同浓度的protein Y加入检测孔，蛋白浓度设置为1um，500nm，200nm，100nm，10nm。
最后，根据实验步骤预设程序，进行动力学检测。
结果如图1所示，最终检测得出蛋白Y与lncRNA G的结合常数Kd值为9.6±0.3nM。由此可知，采用实施例1的检测方法，实现了定量检测protein Y与lncRNA G结合强弱，并检测得出其结合常数Kd值为9.6±0.3nM。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供亲和素标记的RNA，进行生物素标记；
(2)取步骤(1)所得RNA，加入结构缓冲液，使得RNA形成二级结构，然后加热、冰浴、室温静置；
(3)提供纯化的蛋白；
(4)将步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白混合，利用BLI生物干涉膜方法，对步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白进行动力学检测，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA为lncRNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中结构缓冲液中含有：10mMTris，0.1M KCl和10mM MgCl2；且结构缓冲液的pH值为7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中BLI生物干涉膜方法包括以下5个步骤：
(4.1)基线均一化，时间为1min；
(4.2)固化，通过SR固化传感器捕捉生物素标记的lncRNA,lncRNA的浓度范围为100-200nM，固化时间为5-10min；
(4.3)基线均一化，时间为3min；
(4.4)结合，在样品板检测孔加入不同浓度梯度纯化蛋白，使之与固化的lncRNAs相互结合，结合时间为5-10min；
(4.5)解离，时间为5-10min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛋白纯化的步骤包括：
(3.1)将重组蛋白表达菌株按1:100比例稀释后，转接至1L的LB培养瓶中，37℃，220rpm培养2.5-3h，加入诱导剂诱导；
(3.2)将步骤(3.1)所得菌株转移至25-28℃摇床，160rpm，培养12-16h；收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，加入50mM Tris-HCl，于超声破碎仪上超声破碎，破碎完后离心，之后分离上清液；
(3.3)步骤(3.2)所得上清液加入1-2mL经水洗过的镍亲和树脂，于4℃缓慢摇动1h，过柱；所得全部上清液添加镍树脂混合液过柱2次，后用20倍柱床体积超声破碎缓冲液平衡柱床，再用20mM咪唑溶液洗涤20倍的柱床体积，以除去杂蛋白；之后依次用50mM、100mM、200mM、500mM咪唑溶液洗涤10倍的柱床体积，各梯度洗脱液分别回收；
(3.4)分别取10ul步骤(3.3)所得各梯度洗脱液，然后各加入10ul SDS上样缓冲液，煮沸10min后，进行SDS-PAGE电泳检测，根据电泳结果，选择相对较纯的梯度洗脱液，分装冻存即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.1)中，诱导剂为IPTG，IPTG的加入量为：每300ml培养液加入50ul 0.5M的IPTG。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.2)中，超声破碎的时间为50min，超声破碎仪的参数设置为：功率设置为30％；每超声4s，停3s。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.2)中，超声破碎后离心条件为：14000rpm，离心35min；或9000rpm，离心90min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.3)中，咪唑溶液的pH值为7.4-8.0，其中还含有50mM Tris-HCl。
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| CN201811596143.8A Pending CN111366731A (zh) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | 一种检测蛋白质和rna相互作用的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111366731A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113686818A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-23 | 南开大学 | 一种利用生物膜层干涉技术测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚合物亲和力的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101768219A (zh) * | 2008-12-30 | 2010-07-07 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种重组融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN104086652A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-10-08 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 抗o型口蹄疫病毒特异性单域抗体及其重组表达载体 |
| CN106093436A (zh) * | 2016-07-25 | 2016-11-09 | 高飞 | 一种简便检测rna与蛋白互作的试剂盒及其使用方法 |
| CN106168625A (zh) * | 2016-08-03 | 2016-11-30 | 广州伯信生物科技有限公司 | 一种RNA pulldown 方法及试剂盒 |
-
2018
- 2018-12-25 CN CN201811596143.8A patent/CN111366731A/zh active Pending
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