CN111500685B - 一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法。所述的适配体传感器包含两条DNA序列：核酸适配体SA43和分子信标MB。该方法的作用机理在于适配体‑金黄色葡萄球菌结合体的酶切保护作用(图1)：适配体SA43能快速识别并特异性结合金黄色葡萄球菌，从而防止被外切酶酶切。进一步地，适配体可与分子信标MB稳定杂交，打开MB的发卡结构，显著提高荧光信号。相反，当样品不含金黄色葡萄球菌时，SA43易被外切酶切断，导致其无法与MB杂交。此时，MB将呈头尾自杂交结构，实现荧光猝灭。通过荧光强度与菌浓度的线性曲线，即可定量检测金黄色葡萄球菌。该方法具有适配体易合成、免培养、免分离和灵敏度高等优点。

Description

一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌易引起人类化脓感染，是一种主要的食源性革兰氏阳性致病菌，其对生长环境不严格，多数食品基质如水、蛋、乳、鱼、肉等都极易受到金黄色葡萄球菌的污染，进而引起食品中毒。葡萄球菌食源性疾病是最常见的食源性疾病之一，据统计，全球由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食源性疾病中约占25％，严重影响了人类食品安全和经济发展。因此，建立金黄色葡萄球菌的快速分析方法尤为重要。

目前，金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括平板计数法、核酸定量法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。现场快速筛检方法主要以ELISA应用较多，但该方法因基于抗原-抗体的亲和反应，通常涉及到标记、清洗和分离步骤，繁琐的操作步骤不仅限制了方法的灵活应用，而且降低了方法的准确性。此外，抗体制备需经过动物或细胞实验，导致检测成本偏高。所以，有必要发展一种快速经济、稳定性好、灵敏度高、特异性强的检测方法。

基于核酸适配体构建的适配体传感器已经成为用于从小分子到细胞检测的一个强大的分析平台，在某些情况下可能替代抗体检测。此外，适配体传感器可在恒温条件下检测均匀溶液中的目标分子，有利于其在现场快速检测中的应用。然而，大多数致病菌适配体传感器都是通过磁性力分离来输出识别信号，分离过程会使检测过程复杂化，严重影响传感精度。因此，本技术提出了一种免分离的适配体传感器(即酶切保护适配体传感器)用于检测金黄色葡萄球菌。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法。本发明采用的技术方案为：核酸适配体捕捉样品中的金黄色葡萄球菌并特异性结合，与金葡结合的适配体不会被外切酶酶切，进而完整的适配体可与分子信标进行杂交，释放荧光信号(图1)。通过荧光强度与菌液浓度的线性曲线，即可定量检测样品中的金黄色葡萄球菌。包括如下步骤：

(1)靶标识别：将含有金黄色葡萄球菌的培养液在8000rpm条件下离心5min，使用PBS缓冲液(1x)清洗沉淀物三次后重悬于PBS缓冲液中，取8μL菌悬液与8μL 20μM的核酸适配体SA43溶液、8μL外切酶I缓冲液(10x)和46μL水混匀后在37℃结合30min；

(2)酶解：将步骤(1)中混合物加入2μL的核酸外切酶I(6.4U/μL)和核酸外切酶III(64U/μL)溶液，混匀后置于37℃酶切30min；

(3)灭酶：将步骤(2)中反应后的混合物置于90℃条件下灭酶5min；

(4)分子信标杂交：取8μL 10μM的分子信标MB溶液加入到步骤(3)灭酶后的混合物中，混匀后置于90℃条件下褪火5min，然后室温静置10min后待测；

(5)荧光信号检测：取步骤(4)反应后的溶液35μL加入到384孔板中，测定样品的荧光信号，其中激发波长为488nm，发射波长为518-650nm；

(6)建立金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度的标准曲线：配制一系列不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液，然后将不同浓度的菌悬液分别与一定量步骤(1)中制备的核酸适配体SA43溶液混合均匀，37℃条件下结合30min，重复步骤(2)～(5)，根据荧光检测结果，建立以金黄色葡萄球菌浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线；

(7)实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌的菌悬液加入到实际样品中，以步骤(1)～(5)所述操作测定出相应的荧光值，基于步骤(6)所建立的标准曲线，计算得到实际样品中所含的金黄色葡萄球菌浓度。

优选地，所述的核酸适配体SA43序列为：5’-GCAAT GGTAC GGTAC TTCCTCGGCACGTTC TCAGT AGCGC TCGCT GGTCA TCCCACAGCT ACGTC AAAAG TGCAC GCTAC TTTGCTAA-3’，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

优选地，所述的分子信标MB序列为：5’-GTTCATAGAC GTTTT TGACG TAGCT GTGGGATGAC CAGCG AGCGC TACTG AGAAC GTGCC GAGGAAGACG TCTAT GAAC-3’，其中5’和3’分别进行FAM和BHQ1修饰，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

优选地，所述的金黄色葡萄球菌菌悬液浓度为10²-10⁷CFU/mL。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

(1)核酸适配体对金黄色葡萄球菌具有特异性识别作用，且具有易合成、可反复使用和长期保存的优点；

(2)可检测完整的金葡细胞，且可在一支EP管中完成，不需要繁琐的设备；

(3)采用酶切保护的原理，不需要像磁性纳米离子涉及到分离的步骤，提高检测灵敏度的同时简化了操作步骤；

(4)无需培养、浓缩和纯化过程，可快速、简单、灵敏、特异性检测食品中的金黄色葡萄球菌，样品前处理简单，大大缩短了检测时间。

附图说明

图1基于酶切保护适配体传感器检测金黄色葡萄球菌的实验原理；

图2酶切保护适配体传感器工作原理的电泳分析；

图3酶切保护适配体传感器检测金黄色葡萄球菌的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例对对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：利用凝胶电泳分析验证酶切保护适配体传感器的工作原理

凝胶电泳分析结果如图2所示。由图可知，分子信标MB在没有核酸适配体SA43时可自行猝灭(line 2，荧光暗淡)；而当MB与SA43结合后，产物条带滞后，信号显著增强(line3)，表明SA43与MB可成功杂交。当加入核酸外切酶I和核酸外切酶III时，SA43的条带消失(line 4,6)，表明适配体会被外切酶有效酶解。而由于在加入MB之前，核酸外切酶已被灭活，因此分子信标MB不会被酶切。当金黄色葡萄球菌存在时，该菌可以保护SA43不被外切酶彻底酶切(line 5,7)，但SA43会被截短，因为与初始适配体相比，该条带移动更快(line7)。不过，截短的SA43仍然可以与分子信标MB有效杂交，因为在MB条带后存在一条条带滞后(line 5)。

实施例2：反应条件的优化

取一定量洗涤重悬的金黄色葡萄球菌菌液与一定体积和浓度的适配体SA43混匀后反应30min，再加入一定浓度的外切酶I和III酶切30min，然后置于90℃条件下灭酶活5min，添加一定量的分子信标MB于上述混合物中，混匀后置于90℃条件下褪火5min，然后室温静置10min后测定荧光信号。本发明对核酸外切酶I和核酸外切酶III的浓度、分子信标MB浓度、适配体SA43与MB的添加比例进行了优化。优化结果为：外切酶I添加量为0.16U，外切酶III添加量为1.6U，SA43与MB的比例为2:1，MB的浓度为1.0μM。

实施例3：金黄色葡萄球菌标准曲线的绘制

制备不同浓度梯度的金葡菌悬液：0,10,10²,10³,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷,10⁸,10⁹,10¹⁰,10¹¹CFU/mL，取8μL上述菌悬液与8μL 20μM的适配体SA43溶液、8μL核酸外切酶I缓冲液(10x)和46μL水混匀后在37℃条件下结合30min，随后加入2μL的核酸外切酶I(6.4U/μL)和核酸外切酶III(64U/μL)溶液，混匀后置于37℃条件下酶切30min，酶切结束将混合物置于90℃条件下灭酶活5min，然后取8μL 10μM的MB溶液加入到上述混合物中，混匀后置于90℃条件下褪火5min并室温静置10min，然后测定荧光信号。实验结果为在10²到10⁷区间的菌液浓度中，荧光强度与菌液浓度对数值呈现良好的线性关系，线性方程y＝2952x-352.9(表示荧光强度，x表示菌液浓度对数值)，R2＝0.9913，检测限为64CFU/mL。

实施例4：对实际样品中加标金黄色葡萄球菌的检测

本发明选用的实际样品包括自来水、纯牛奶和猪肉，对样品进行分装和灭菌后，再加入一定量的金黄色葡萄球菌溶液(lg 4CFU/mL和lg 6CFU/mL)。取上述菌液在8000rpm条件下离心5min，使用PBS缓冲液(1x)清洗沉淀物三次后重悬于PBS缓冲液中，取8μL重悬后的菌液与8μL 20μM的核酸适配体SA43溶液、8μL外切酶I缓冲液(10x)和46μL水混匀后在37℃条件下结合30min，随后加入2μL的核酸外切酶I(6.4U/μL)和核酸外切酶III(64U/μL)溶液，混匀后置于37℃条件下酶切30min，酶切结束将混合物置于90℃条件下灭酶活5min，然后取8μL 10μM的MB溶液加入到上述混合物中，混匀后置于90℃条件下褪火5min并室温静置10min，然后测定荧光信号。从标准曲线中求得对应的实际样品中可被检测到的金黄色葡萄球菌的菌落总数，实验结果如表1所示。

表1实际样品中金黄色葡萄球菌的加标回收率

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法

<141> 2020-04-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(SA43)

<400> 1

gcaatggtac ggtacttcct cggcacgttc tcagtagcgc tcgctggtca tcccacagct 60

acgtcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(MB)

<400> 2

gttcatagac gtttttgacg tagctgtggg atgaccagcg agcgctactg agaacgtgcc 60

gaggaagacg tctatgaac 79

Claims (6)

1.一种基于酶切保护适配体传感器的金黄色葡萄球菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)靶标识别：金黄色葡萄球菌培养液在8000rpm条件下离心5min，使用1x的PBS缓冲液清洗沉淀物三次后重悬于PBS缓冲液中，将8μL,20μM核酸适配体SA43溶液与8μL金黄色葡萄球菌菌悬液、8μL 10x的外切酶I缓冲液、46μL双蒸水混匀后在37℃结合30min；

所述核酸适配体SA43可特异性识别金黄色葡萄球菌，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；

(2)酶解：将步骤(1)中混合物加入2μL，6.4U/μL外切酶I和64U/μL外切酶III溶液，混匀后置于37℃酶切30min；

(3)灭酶：将步骤(2)中反应后的混合物置于90℃条件下灭酶5min；

(4)分子信标杂交：将8μL,10μM分子信标MB溶液加入到步骤(3)灭酶后的混合物中，混匀后置于90℃条件下褪火5min，然后室温静置10min后待测；

所述分子信标MB可与上述核酸适配体SA43的中间区域互补杂交，在MB的5’端和3’端分别标记有6-carboxyfluorescein荧光分子和black hole quencher 1猝灭分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

(5)荧光信号检测：取步骤(4)反应后的溶液35μL加入到384孔板中，测定样品的荧光信号，其中激发波长为488nm，发射波长为518-650nm；

(6)建立金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度的标准曲线：配制一系列不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液，然后将不同浓度的8μL菌悬液分别与8μL,20μM核酸适配体SA43溶液、8μL10x的外切酶I缓冲液、46μL双蒸水混合均匀，37℃条件下结合30min，重复步骤(2)～(5)，根据荧光检测结果，建立以金黄色葡萄球菌浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线；

(7)实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌菌悬液加入到实际样品中，以步骤(1)～(5)所述操作测定出相应的荧光值，基于步骤(6)所建立的标准曲线，计算得到实际样品中所含的金黄色葡萄球菌的浓度；所述快速检测方法不涉及疾病的预防、诊断和/或治疗用途。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中外切酶I缓冲液的终浓度为1x，核酸适配体SA43溶液的终浓度为2.0μM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中外切酶I的终浓度为0.16U，外切酶III的终浓度为1.6U。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中分子信标MB溶液的终浓度为1.0μM。

5.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中一系列金黄色葡萄球菌菌悬液的终浓度为0-10¹⁰CFU。

6.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中的实际样品包括但不限于自来水、纯牛奶和猪肉。

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