CN111321121A - 两株新的大熊猫c反应蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两株新的大熊猫C反应蛋白(CRP)单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，具体涉及大熊猫重组CRP杂交瘤细胞株的筛选，从而获得大熊猫CRP单克隆抗体，并应用于分析大熊猫血液CRP浓度。本发明通过利用细胞融合技术，获得了分泌抗大熊猫CRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株2株(保藏编号为CCTCC NO：C2019297和CCTCC NO：C2019298)，收集并纯化细胞株培养上清，获得高效价的大熊猫CRP单克隆抗体，然后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对大熊猫血清中CRP蛋白浓度进行检测，并建立了大熊猫血液CRP浓度检测技术体系，作为大熊猫炎症状态判断指标之一。

Description

两株新的大熊猫C反应蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及制备两株大熊猫重组C反应蛋白(CRP)杂交瘤细胞株，从而得到高效价大熊猫CRP单克隆抗体，并应用于大熊猫血液CRP浓度测定。

背景技术

C-反应蛋白(CRP)，在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质，可作为炎症的生物标志物。人类CRP包括200多个氨基酸，其一级结构包含5个相同的亚单位，亚单位间以非共价键相结合，每个亚单位在其表面都含有CRP配体结合位点，构成一种环状五聚体蛋白。CRP具有物种特异性，例如大熊猫CRP与人CRP的蛋白质序列只有66.99％的相似性，与狗CRP只有70.27％。我们前期实验显示，已开发的人和狗CRP检测试剂盒均无法用于大熊猫CRP浓度检测。因此需要开发大熊猫CRP单克隆抗体用于检测大熊猫的炎症状态。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，可通过骨髓瘤细胞与B淋巴细胞进行细胞融合筛选杂交瘤细胞，并通过收集、纯化杂交瘤细胞分泌液得到单克隆抗体。本发明通过筛选大熊猫CRP杂交瘤细胞，得到高效价的大熊猫CRP抗体，建立特异性的大熊猫CRP抗体ELISA检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种抗大熊猫CRP亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗大熊猫CRP亚基单克隆抗体及制备方法，解决现有技术中没有特异的抗大熊猫CRP特异抗体的问题。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号为CCTCC NO：C2019297。

本发明还提供了另一种杂交瘤细胞株，为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，保藏编号为CCTCC NO：C2019298。

第二方面，本发明保护抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1、抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2在生产抗大熊猫CRP单克隆抗体中的应用。

第三方面，本发明提供了一种抗大熊猫CRP单克隆抗体，是由抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2产生。

优选地，上述抗大熊猫CRP单克隆抗体的亚型为IgG1。

第四方面，本发明还保护上述抗大熊猫CRP单克隆抗体在western blot技术、ELISA技术中的应用。

第五方面，本发明还提供了一种抗大熊猫CRP单克隆抗体的制备方法，包括步骤：培养抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，收集细胞培养上清，纯化并浓缩得到抗大熊猫CRP单克隆抗体。

优选地，制备方法包括步骤：S1：根据NCBI上公布的大熊猫CRP蛋白氨基酸序列(MNHKVHHHHHHMELGTLEGSQGNTYRKAFVFPTESATSFVTLFAPVQKPLKAFTVCLQAYTDLTRPYSLFSYATRTQYNEILLFKERPGLYSVSVGGSDAYIKAPETFFAPKHFCVTWESKTGITELWVDGKAMVRTSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGRFDKNQSLLGDVGEVNMWDYVLSPDEISTVYNGGVFSPNFLNWQDLKYEIQGEVFLKNQLWP)，构建原核表达载体，通过原核表达制备大熊猫CRP重组蛋白CRP_panda，作为生产特异性抗体的免疫原；S2：将步骤S1中的免疫原和佐剂一起注射至小鼠腹腔免疫小鼠，多次免疫，直至血清效价达标为止；S3：采用常规方法进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；S4：对步骤S3得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，通过有限稀释法得到抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，并进行亚型鉴定；S5：对步骤S4中所得的抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2进行大量培养，收集细胞培养的上清液，纯化并浓缩得到特异性抗大熊猫CRP单克隆抗体。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗CRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株(CRP杂交瘤细胞株CRP_panda_1、CRP_panda_2)，收集并纯化细胞株培养上清，获得了高特异性CRP单克隆抗体，并通过western blot检测抗体纯度，适合酶联免疫吸附试验(ELISA)，同时为CRP蛋白的定位和组织表达信息及利用CRP高特异性的单克隆抗体对CRP受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究。本发明采用的步骤方法简单，得到的抗体效价高，完全适合于ELISA检测方法，从而可以在短时间内得到检测结果，从而判断大熊猫的炎症状态。

保藏信息：抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号：CCTCCNO：C2019297；抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，保藏编号为CCTCC NO：C2019298，均于2019年12月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例3中采用的大熊猫血清样品稀释倍数与CRP蛋白浓度标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例1

本实施例提供大熊猫CRP杂交瘤细胞的制备方法，具体包括如下步骤。

1、特异重组蛋白的设计与合成

根据NCBI数据库大熊猫基因组中CRP氨基酸序列，序列为：

MNHKVHHHHHHMELGTLEGSQGNTYRKAFVFPTESATSFVTLFAPVQKPLKAFTVCLQAYTDLTRPYSLFSYATRTQYNEILLFKERPGLYSVSVGGSDAYIKAPETFFAPKHFCVTWESKTGITELWVDGKAMVRTSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGRFDKNQSLLGDVGEVNMWDYVLSPDEISTVYNGGVFSPNFLNWQDLKYEIQGEVFLKNQLWP(SEQ ID NO：1所示)，并通过原核表达得到重组蛋白，作为生产特异性抗体的免疫原(CRP_panda)，浓度为0.6mg/ml，用于免疫实验小鼠和ELISA筛选阳性克隆。氨基酸人工合成部分委托上海生工生物公司完成。

2、抗原小鼠免疫

实验小鼠准备：8-10周龄Balb/c雌性小鼠3只，适应环境1周。

抗原处理：在免疫之前准备好灭菌的玻璃注射器、一次性三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原吸进注射器中(共1000μl，四只的量)，再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中(共1000μl，四只的量)；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化，将抗原CRP_panda和佐剂按照1：1的比例混合乳化完全后(乳化大概5分钟，至油包水状态即可)，最后再将乳化好的混合液转入一次性注射器。

免疫小鼠：乳化混合液注射通过腹腔注射小鼠，达到免疫小鼠的目的，且需要经过多次免疫，采集小鼠尾部血液，分离血清检测免疫效价，直至血清效价达标为止。首次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，之后注射用量为首次免疫的一半，且采用弗氏不完全佐剂进行乳化。抗原浓度大，体积小，可用氯化钠稀释后再与佐剂1：1混合乳化。首免，腹腔注射，250μl一只。(抗原量为150ug/只)。两周后进行第二次免疫，腹腔注射，250μl一只(从第二次免疫开始抗原都为75ug/只，之后免疫间隔时间为一周)。

免疫效价检测：第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rpm，8min，取血清测定其效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标，正常情况下需要免疫3-6次，根据测定结果决定是否加强免疫。

包被ELISA板子：

(1)需要包被氨基酸浓度为2ug/ml，工作浓度为0.6mg/ml，每块板子5.5ml，因而配1板(96孔板)需要18.3μl的工作浓度抗原与5.5ml的包被液混匀，加样是50μl/孔，加好之后用封板膜密封，放入4℃冰箱过夜(每次包被ELISA板子的时间应相对固定，减小误差)。

(2)将上述的96孔板用洗板机添加洗液或手动洗涤3-5次后拍干板中液体。

(3)用包被液配制2.5％BSA封闭液，加封闭液200μl/孔，用封板膜密封，室温放置半天。

(4)板子中液体甩掉并拍干水分。

(5)用真空包装机包装好，做好标记，放入-20℃的冰箱中保存备用。

小鼠血清效价测定(ELISA)：

(1)取血清：小鼠尾部采血10滴左右，12000rpm，8min，做好标记，将待测血清稀释到一定的倍数。

表1血清稀释表

(2)加样：分别在相应孔中加入待测血清(每个稀释倍数的血清做1孔)、阴性对照1孔，各加50μl/孔。

温育：用封板膜封板后置37℃温育箱(水平振荡200rpm)中温育30分钟。

洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或手动洗涤3-5次，尽量扣干板内水分。

(3)加双抗：双抗稀释10000倍，50μl/孔。

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或手动洗涤3-5遍，尽量扣干板内水分。

(6)显色：每孔加显色剂TMB 100μl，轻轻振荡混匀，温育箱显色6-10min。

(7)比色测定：每孔加终止液50μl(1M HCl)，轻轻振荡混匀，酶标仪450nm处读数，保存结果并分析。

3、细胞融合

3.1SP2细胞的复苏

首先要注意无菌操作，以防细胞污染，事先将15ml的离心管中加入5-10ml无菌的PBS缓冲液。冻存的SP2细胞(骨髓瘤细胞)从液氮中取出后快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；将细胞加入PBS中，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，用PBS重复两次清洗SP2细胞后，将细胞养在培养瓶中，做好标记，显微镜下观察细胞密度，最后将培养瓶放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3.2SP2细胞的传代

当培养瓶中的细胞长满瓶底80％左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加5-10ml PBS，吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤完后加2ml 10％完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。(需传代足够多SP2细胞用于细胞融合)

3.3免疫脾细胞制备

(1)处死小鼠

小鼠眼眶采血后，12000r/min离心8min，分装血清，-20℃保存备用。再断颈椎处死小鼠(不要伤及内脏)，放入75％酒精中浸泡。

(2)取小鼠脾脏

首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75％的酒精中浸泡5-10分钟，放在9cm的无菌平皿中，摆放在利于自己操作的位置(超净台中)，进行解剖。通过无菌操作取出小鼠脾脏，并尽量去除脂肪组织。

(3)脾细胞悬液制备

先用PBS洗涤脾脏，洗3-5次后，将脾脏置于无菌平皿中，用眼科剪刀将脾脏尽可能的剪碎后，加PBS轻吹洗涤，用70微米的细胞过滤筛进行过滤，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5-10ml PBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次，洗涤完后加2ml不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。

3.4SP2细胞悬液的制备

将提前培养好的SP2细胞用加样枪吸取细胞液吹打瓶底使绝大部分细胞悬浮，再将所有细胞液转移至50ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加PBS 5-10ml，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2ml DMEM不完全培养液重悬细胞；稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。

3.5细胞融合

(1)细胞计数后，再将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：4(1：10至1：2之间)的比例混合；600rpm，离心3min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动散开成细胞悬液。

(2)1min内缓慢加入37℃预热好的0.4-0.7ml 50％PEG溶液(根据细胞量的多少而增减PEG用量)，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

(3)开始匀速缓慢加37℃预热的不完全培养液10ml以终止PEG作用，边滴边叩击并旋转离心管，加完后静置2min。

(4)离心，800rpm，5min，弃上清；再用5-10ml PBS或DMEM不完全培养液洗涤2次，以去除PEG。

(5)离心后弃上清，用40ml HAT选择培养液(39.2ml 10％DMEM完全培养液+0.8mlHAT)重悬细胞。

(6)上述融合细胞加入96孔细胞培养板内(若准备了巨噬细胞，将细胞培养液吸干，加100μl不完全培养液静置5-10min后吸干培养液，最后将融合细胞加入巨噬细胞培养板中)，每孔加200μl；将培养板置于CO₂培养箱中培养。

3.6选择培养

培养的第四天半液法换HAT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μl，弃掉，再加入新的每孔100μl HAT培养液(HAT培养液配制为：10％的完全培养液：HAT＝1:50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200μl 50×HAT。

培养的第七天半液法换HT培养液，用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μl，弃掉，再加入新的每孔100μl HT培养液(HT培养液的配制为：10％的完全培养液：HT＝1：50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200μl 50×HT。

3.7检测培养液中的抗体

对杂交瘤细胞进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞：在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时(大概在第10-13天)，可吸取培养液检测其有无分泌抗体。

(1)将CRP_panda重组蛋白包被的ELISA板从冰箱拿出，恢复室温后，向板中加入要检测的培养液100μl每一孔(注意不要污染细胞)，留两孔做阴阳性对照，阴性对照用10％的DMEM完全培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清(用融合前小鼠眼眶采血的血清)。

(2)温育：用封板膜封板后置37℃温育箱中水平振荡200rpm温育1小时。

(3)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或手动洗涤3-5次，最后尽量扣干水分。

(4)加双抗：将羊抗鼠HRP稀释10000倍，50μl每孔。

(5)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或手动洗涤3-5遍，最后尽量扣干水分。

(7)显色：每孔加显色剂TMB100μl，轻轻振荡混匀，温育箱显色6-10min。

(8)比色测定：每孔加终止液50μl(1M HCl)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定OD值。

选取OD值高的细胞孔(至少为阴性对照的3倍)扩至多孔培养后，再次重复上述ELISA试验检测细胞分泌液中抗体，最后选择能够保持高OD值的细胞进行后续有限稀释。

3.8有限稀释筛选单克隆细胞

(1)阳性孔细胞的计数：先将孔中的细胞悬浮后转移到15ml的离心管中(边吹打边旋转，使细胞悬浮)，再补加10％的DMEM完全培养液至2ml；进行细胞计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验。

(2)将细胞液加入37℃预热的200ml完全培养液中，混匀，加入96孔培养板(边加边轻轻摇晃加样槽，使细胞均匀分布，从而每200μl含有单个细胞)，200μl/孔，共十块96孔板。

(3)将培养板置CO₂培养箱中培养。

(4)培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录只有单个克隆的孔。

(5)培养第4-7天给有记录的单个细胞的孔进行换液，加10％完全培养液100μl/孔。

(6)第8-10天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将有单个细胞生长并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测(做ELISA实验)，记录阳性强的孔。找出的单个克隆阳性强的孔，需做抗体亚型鉴定，才能判断是否为单克隆抗体。

本发明最终筛选得到两株抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1(保藏编号为CCTCC NO：C2019297)和CRP_panda_2(保藏编号为CCTCC NO：C2019298)。

3.9细胞株亚型鉴定(ELISA)

使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA试剂盒进行亚型鉴定。试剂盒信息：北京博奥龙免疫技术有限公司，货号：BF16001规格：2*96孔板。

实验步骤：(1)首先将试剂盒恢复室温，然后用纯水把清洗液配成工作浓度(1份浓缩清洗液加19份纯水)。

(2)取出酶标版。每个标本需要8孔，阳性对照8孔，阴性对照8孔。

(3)将标本检测空每孔先加入标本稀释液各50μl，然后将50微升细胞培养上清液加入酶标微孔板，每个标本加8孔；阳性对照和阴性对照不加标本稀释液也是各加8孔每孔100μl。贴上封板膜37℃温育30分钟。

(4)弃去板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干。再在每个标本的8个空中分别加入8中酶标二抗各100μl，通用阳性、阴性对照的各孔也一样。贴上封板膜37℃温育30分钟。

(5)吸弃板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜避光37℃温育20分钟。

(6)将会看到孔内液体变成蓝色，显示蓝色的孔所对应的酶标二抗即为此标本的Ig类或亚类。将反应终止液(每孔50μl)终止反应后用酶标仪450nm测定波长，参考高值所对应的酶标二抗，阳性对照OD值一般不小于0.8，阴性对照一般不高于0.15，阳性判定标准：样品OD值大于OD+0.15，阴性OD低于0.05按0.05算。

结果：若为单抗，每个样品应只有一个孔显色，即只有一个亚型，若有多个孔显色，所选出的细胞分泌的并不是单抗，应继续筛选。

亚型鉴定结果如下表2所示。

表2亚型鉴定结果

经鉴定筛选所得到的抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1(保藏编号为CCTCC NO：C2019297)和CRP_panda_2(保藏编号为CCTCC NO：C2019298)所分泌的抗体亚型均为IgG1型。

3.10细胞株的扩大培养

(1)批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中(边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移)培养，并加1000μl的10％完全培养液培养。

(2)观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养(先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10％的完全培养液7-9ml)。

(3)观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养(细胞传代)。

(4)可传5-10个大培养瓶进行培养，细胞长好后将细胞冻存，细胞分泌液收集，用于下一步抗体过柱纯化试验。

3.11抗体纯化

所用柱子为Pierce^TM Protein G Agarose。

(1)准备待过柱样品(细胞培养液或血清)，从冰箱中取出在常温下融化(选择9株细胞的细胞培养液进行过柱)。

(2)填充柱子，柱体积为2-5ml。

(3)洗柱：用25ml PBS洗涤(五倍柱子容积的PBS)。

(4)纯化：再向柱内加入5ml待纯化的样品，收集通过柱子的样品。

(5)洗涤：用40ml PBS洗涤(八倍柱子容积的PBS)，再用约20ml的甘氨酸洗脱(加入甘氨酸后先静置10分钟)。

(6)用EP管收集过滤后的液体，每管1ml(每管加5μl 1M Tris，调pH)。

(7)用考马斯亮初测浓度，如不变蓝则不继续收集。

(8)洗柱：用20mlPBS冲洗。

(9)保护柱体：加5ml的PBS和2％NaN₃保护柱床，4℃保存。

(10)将收集的样品加入10000MWCO的离心管中。

(11)离心浓缩，5000rpm，15min，至液体只剩1-2ml为止。

(12)测定抗体浓度。

(13)将9个抗体分别分装后，-80℃保存。

3.12细胞冻存

(1)将鉴定的抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和CRP_panda_2培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中(细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长)，在将细胞转移至15ml或50ml的离心管中。

(2)离心，1000转/5分钟。

(3)用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后预估细胞量加入10ml PBS悬浮。

(4)取10微升悬浮细胞稀释100倍，进行细胞计数，冻存细胞密度至少为1*10⁶/ml，活细胞率大于80％。

(5)将悬浮细胞离心后，用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液(冻存液＝9ml血清+1mlDMSO，颠倒混匀，过滤备用)，混匀。

(6)最后加入冻存管中，每管1ml细胞液。放入冻存盒，先放-80℃24小时后，再将细胞放入液氮中长期保存。

实施例2

本实施例提供杂交瘤细胞的应用，即大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的抗体应用于ELISA检测，包括如下步骤。

(1)将纯化的9个抗体分别偶联标记HRP(CRP-HRP)，此步骤委托上海生工生物公司完成。

(2)用9个抗大熊猫CRP亚基单克隆抗体按照包被ELISA板子的方法包被板子(包被抗体浓度2ug/ml)，与9个CRP-HRP进行两两配对筛选ELISA结果较好的配对，其中检测阳性对照样本为50μl/孔5μg/ml的CRP重组蛋白，用PBS 50μl/孔作为阴性对照。

(3)通过ELISA方法，将筛选得到最好配对的CRP抗体与CRP-HRP用于大熊猫血清样本检测。

实施例3

本实施例提供一种大熊猫血清中CRP浓度检测方法，包括如下步骤。

(1)用筛选确定的CRP抗体按照包被ELISA板子的方法包被ELISA板子。

(2)用CRP重组蛋白倍比梯度稀释作为标准曲线，向板中加入50μl/孔。CRP重组蛋白梯度稀释浓度为32ug/ml、16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0ug/ml(PBS)，标准曲线见图1。标准曲线显示该抗体在稀释倍数2-16范围内与抗体浓度呈现显著的线性关系。

(3)一份大熊猫血清样品同样做倍比梯度稀释(稀释倍数设定为：2倍、4倍、8倍、16倍)用于CRP蛋白浓度检测(备注：整个加样过程尽量控制在5分钟以内完成)。

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育箱中温育1小时。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或者手动洗涤3-5次，最后尽量扣干水分。

(6)加CRP-HRP：用PBS将CRP-HRP稀释2500倍，50μl/孔。

(7)温育：用封板膜封板后置37℃温育箱中温育30分钟。

(8)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或者手动洗涤3-5次，最后尽量扣干水分。

(9)显色：用柠檬酸钠缓冲液将显色剂TMB稀释后，100μl/孔，温育箱中37℃温育，所有样品都显色10min。

(10)比色测定：显色结束后，加终止液50μl/孔(1M HCl)，迅速完成加终止液的操作后，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。根据测定的OD值，计算血清中CRP蛋白的浓度(表3)，可见该样品的浓度为101.858μg/ml。

表3大熊猫血清检测结果

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都大熊猫繁育研究基地

<120> 两株新的大熊猫C反应蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

<130> 2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Glu Leu Gly Thr

1 5 10 15

Leu Glu Gly Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Arg Lys Ala Phe Val Phe Pro

20 25 30

Thr Glu Ser Ala Thr Ser Phe Val Thr Leu Phe Ala Pro Val Gln Lys

35 40 45

Pro Leu Lys Ala Phe Thr Val Cys Leu Gln Ala Tyr Thr Asp Leu Thr

50 55 60

Arg Pro Tyr Ser Leu Phe Ser Tyr Ala Thr Arg Thr Gln Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Ile Leu Leu Phe Lys Glu Arg Pro Gly Leu Tyr Ser Val Ser Val Gly

85 90 95

Gly Ser Asp Ala Tyr Ile Lys Ala Pro Glu Thr Phe Phe Ala Pro Lys

100 105 110

His Phe Cys Val Thr Trp Glu Ser Lys Thr Gly Ile Thr Glu Leu Trp

115 120 125

Val Asp Gly Lys Ala Met Val Arg Thr Ser Leu Lys Lys Gly Tyr Thr

130 135 140

Val Gly Ala Glu Ala Ser Ile Ile Leu Gly Gln Glu Gln Asp Ser Phe

145 150 155 160

Gly Gly Arg Phe Asp Lys Asn Gln Ser Leu Leu Gly Asp Val Gly Glu

165 170 175

Val Asn Met Trp Asp Tyr Val Leu Ser Pro Asp Glu Ile Ser Thr Val

180 185 190

Tyr Asn Gly Gly Val Phe Ser Pro Asn Phe Leu Asn Trp Gln Asp Leu

195 200 205

Lys Tyr Glu Ile Gln Gly Glu Val Phe Leu Lys Asn Gln Leu Trp Pro

210 215 220

Claims (9)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：

所述杂交瘤细胞株为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号为CCTCC NO：C2019297。

2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：

所述杂交瘤细胞株为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，保藏编号为CCTCC NO：C2019298。

3.权利要求1或权利要求2所述的杂交瘤细胞株在生产抗大熊猫CRP单克隆抗体中的应用。

4.一种抗大熊猫CRP单克隆抗体，其特征在于：

所述抗大熊猫CRP单克隆抗体是由权利要求1和/或权利要求2所述的杂交瘤细胞株产生。

5.根据权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体，其特征在于：

所述抗大熊猫CRP单克隆抗体的亚型为IgG1。

6.权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体在western blot技术中的应用。

7.权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体在ELISA技术中的应用。

8.权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤：

培养权利要求1和/或权利要求2所述的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清，纯化并浓缩得到抗大熊猫CRP单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体的制备方法，其特征在于,具体包括步骤：

S1：根据如SEQ ID NO：1所示的大熊猫CRP蛋白氨基酸序列，构建原核表达载体，之后制备大熊猫CRP重组蛋白，作为生产特异性抗体的免疫原；

S2：将步骤S1中所述的免疫原和佐剂一起注射至小鼠腹腔免疫小鼠，多次免疫，直至血清效价达标为止；

S3：采用常规方法进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；

S4：对步骤S3得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，通过有限稀释法得到权利要求1和/或权利要求2所述的杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；

S5：对步骤S4中所得的权利要求1和/或权利要求2所述的杂交瘤细胞株进行大量培养，收集细胞培养的上清液，纯化并浓缩得到特异性抗大熊猫CRP单克隆抗体。

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