CN111206092B

CN111206092B - 一种疾病筛查引物探针组合及其应用、试剂盒与检测方法

Info

Publication number: CN111206092B
Application number: CN202010242216.4A
Authority: CN
Inventors: 陈艳; 陈珺
Original assignee: Shanghai Gemple Biotech Co ltd
Current assignee: Shanghai Gemple Biotech Co ltd
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: CN111206092A

Abstract

本发明公开了一种同时进行脊髓性肌萎缩症和原发性免疫缺陷病筛查的引物探针组合及其应用、检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒内包括筛查检测脊髓性肌萎缩症基因检测的引物和探针，筛查检测原发性免疫缺陷病(重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症)基因(TREC，KREC)检测的引物和探针。本发明可建立灵敏度高、准确性高、成本低、周期短的多重数字PCR检测体系，在1个反应内实现同时对遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)致病基因SMN1拷贝数、对重症联合免疫缺陷病相关标记物TREC拷贝数以及对无丙种球蛋白血症相关标记物KREC拷贝数的定量检测，从而一次性筛查上述三种疾病。

Description

一种疾病筛查引物探针组合及其应用、试剂盒与检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及核酸检测领域，更具体地，是涉及一种同时筛查遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)和原发性免疫缺陷病的多重数字PCR检测方法、引物探针组合及检测试剂、试剂盒应用。

背景技术

脊髓性肌肉萎缩症(SMA)是一种遗传性神经肌肉病，其特征是脊髓前角的运动神经元退化，导致严重的、渐进性的对称性肌肉无力和萎缩。SMA患者可能丧失行动能力，并且难以完成呼吸和吞咽等基本生活功能。如果不进行治疗，大多数患有较严重疾病类型(SMAI型)的婴儿在没有呼吸干预的情况下，无法活到两岁。据统计，新生儿SMA发病率为1/6000～1/10000，人群携带率为1/35～1/50，居致死性常染色体遗传病第二位。目前，SMA已经出现了针对性的特效治疗，美国FDA已经批准了Spinraza和Zolgensma两种特效药物的上市，在我国NMPA也已批准了Spinraza上市，并于2019年10月份启动了首批患者的治疗。临床研究试验表明，在疾病症状前阶段给予SMA患儿Spinraza的治疗，能显著的提高患儿存活率，降低呼吸干预率，减少运动发育落后。因此，对SMA患者进行早期诊断及早期治疗至关重要。

原发性免疫缺陷病(primary immunodeficiency disease，PID)是一类由于基因缺陷造成的免疫系统损伤性疾病，多数为单基因缺陷，如不及时诊治，大部分患儿在年幼时即发生反复严重感染，甚至可导致死亡。其中，重症联合免疫缺陷病(severe combinedimmunodeficiency，SCID)是最严重的联合免疫缺陷病，发病率约为1：58000。大部分SCID患者出生时无明显异常，但随着母传抗体的消耗，患儿自己无法建立自身免疫系统，在婴儿早期(3～6月龄)开始发生严重的反复感染。此外，婴儿接种减毒活疫苗(如卡介苗、水痘疫苗等)时，可能患上严重的传染性疾病。反复腹泻、严重感染会造成SCID患儿体型消瘦、生长发育缓慢，不经治疗，SCID患儿在2岁前的死亡接近100％。目前SCID患儿可通过同种异体造血干细胞移植、基因治疗或酶替代治疗进行免疫重建。异体造血干细胞移植是目前最常用并有效的治疗方法。一项研究通过随访240例移植后的SCID患者，认为＜3.5月龄的SCID患者移植的存活率显著高于＞3.5月龄或继发感染的患儿，且移植后的存活率主要与患儿有无感染相关，与移植物的来源无明显关联。因此，对SCID患者进行早期诊断及早期治疗，可显著改善患儿的预后。

X连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia，XLA)，又称Bruton无丙种球蛋白血症，是由于Bruton酪氨酸激酶BTK基因突变，使B细胞系列发育障碍，从而导致外周血B淋巴细胞缺乏、血清免疫球蛋白水平降低或缺失、感染易感性增加的一种原发性体液免疫缺陷病，是原发性B细胞缺陷的典型代表。XLA绝大多数为男性患儿，多于出生后4-12个月开始出现反复感染症状。此外，个别XLA患儿还可以发生肿瘤、自身免疫和炎症性疾病。未接受正规治疗的XLA患儿预后差，大约50％以上会伴发肺部慢性感染，且常有阻塞性肺部疾病或肺源性心脏病；伴发慢性播散性肠道病毒感染者也不少见；约2％的患儿伴发淋巴网状组织恶性肿瘤而死亡。静脉免疫球蛋白(IVIG)是XLA的一线治疗方法，可控制大多数XLA患儿的感染症状，使全身状况迅速改善。但如果IVIG治疗开始较晚，感染所致的器质性损害将是不可逆的。而早期诊断和常规使用丙种球蛋白替代治疗可使本病的预后大大改观，绝大部分患儿能够无症状生存。

以上3种疾病都属于我国的第一批罕见病目录中的重大出生缺陷疾病，且都具有出生时无明显症状、有可治疗干预手段、诊断治疗时机对预后影响大的特点。因此，针对以上疾病开发筛查试剂，可帮助提前检出潜在患儿，及早干预治疗，避免不可逆损伤发生。

其中，脊髓性肌萎缩症的主要致病基因是位于染色体5q11.2-q13.3的SMN1基因，约80％～95％的SMA患者存在SMN1基因的纯合缺失，少数存在复合杂合突变，最终导致SMN蛋白表达量下降。在人类基因组上，SMN基因存在2个高度同源的拷贝，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2；二者序列仅存在5个碱基差异，其中有2个碱基位于第7和8号外显子，另外三个位于内含子6、7内。尽管序列相似，但SMN2蛋白仅具有约5-10％的SMN1蛋白活性，仅对SMN1缺失存在少量的补偿作用。目前SMA疾病进行分子检测的方法主要包括多重连接依赖性探针扩增(MLPA)方法、荧光定量PCR方法、PCR-RFLP方法等。MLPA方法原理是针对c.840C>T位点设计不同的探针序列，SMN1基因扩增子可以扩增出不同的片段长度，以峰的高度来反映拷贝数变异。荧光定量PCR方法可以定量检测SMN1的拷贝数变化。PCR-RFLP方法是首先对目标区域进行扩增，然后通过限制性内切酶或一代测序的方法来区分。

T细胞受体切除环(T-cell Receptor Excision Circles，TRECs)是在胸腺发育成熟过程中，编码T细胞受体的基因进行重组，重组过程中生成了小片段的游离环状DNA。T细胞分裂过程中TRECs不复制，因此可作为判断胸腺输出初始T淋巴细胞功能的可靠指标。B细胞早期成熟发育过程中亦可产生类似于TREC的DNA片段，即kapa重排剪切环(k-deletingrecombination excision circles，KREC)，同TREC性质相仿，KREC可作为近期骨髓输出B细胞的标志。T细胞受体切除环和kapa重排剪切环都被应用到了新生儿原发性免疫缺陷病(PID)的筛查中。TREC拷贝数可作为重症联合免疫缺陷病(SCID)的筛查标志物，在新生儿中若TRECs减少或缺失，则高度怀疑SCID，进一步行流式细胞及基因诊断确诊。KREC拷贝数可作为X－连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的筛查标志物，在新生儿中若KRECs减少或缺失，则高度怀疑XLA,进一步进行免疫检查及基因诊断确诊。目前，原发性免疫缺陷病进行新生儿筛查的主要方法包括荧光定量PCR方法和时间分辨荧光能量共振转移等，检测TREC和KREC拷贝数的方法有荧光定量PCR方法等。

现有检测方法存在以下缺陷：

1、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)方法来检测SMN1基因拷贝数，实验操作复杂，周期相对较长，一般实验操作需要3天左右时间，试剂昂贵，不容易临床推广。

2、荧光定量PCR方法来检测SMN1基因拷贝数，需要依赖于正常对照样本的检测结果，并且计算比较复杂，而且无法区分微小变化差异的拷贝数变化。

3、PCR-RFLP方法来检测SMN1基因拷贝数，只能检测纯合缺失的情况，不能检测含有1个拷贝的携带者。

4、荧光定量PCR方法来检测TREC和KREC拷贝数，实时荧光定量扩增法主要通过标准质控品的曲线对目标序列拷贝数进行相对定量，其检测结果的准确性和稳定性受标准品影响较大，最终导致较高的假阳性和假阴性。此外，目前也有采用数字PCR方法来单独检测SMN1或者TREC、KREC的拷贝数，但是尚无能够将以上指标同时检测、实现3种遗传病同时筛查的技术方案。

发明内容

本发明的目标及解决的技术问题是提供一种同时筛查遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)和原发性免疫缺陷病的多重数字PCR检测方法，具体是提供一种同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的方法，以及相应的探针和引物和试剂盒应用，建立灵敏度高、准确性高、成本低、周期短的多重数字PCR检测体系，在1个反应内实现同时对遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)致病基因SMN1拷贝数、重症联合免疫缺陷病(SCID)相关标记物TREC拷贝数以及无丙种球蛋白血症(XLA)相关标记物KREC拷贝数的定量检测和筛查。

本发明的技术方案如下：

一种引物探针组合，其包括如下引物探针组的至少一种：

(1)用于检测SMN1基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：AAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTC(SEQ ID NO.1)；如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：CTTACTCCTTAATTTAAGGAATGTG(SEQ ID NO.2)；如SEQ ID NO.3所示序列的探针：TACAGGGTTTCAGACAAAA(SEQ ID NO.3)；

(2)用于检测TREC基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：ATGCTGACACCTCTGGTTTT(SEQ ID NO.4)；如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：TGAGAACGGTGAATGAAGAG(SEQ ID NO.5)；如SEQ ID NO.6所示序列的探针：CGGTGATGCATAGGCACCTGCAC(SEQ ID NO.6)；

(3)用于检测KREC基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物：CTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTG(SEQ ID NO.7)；如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物：GAGCCAGCTCTTACCCTAGAGTTT(SEQ ID NO.8)；如SEQ ID NO.9所示序列的探针：CACGGGCAGCAGGTTGGC(SEQ ID NO.9)；

(4)用于检测内参TRAC基因的引物探针组，含有：如SEQ ID NO.10所示序列的上游引物：GTCCTAACCCTGATCCTC(SEQ ID NO.10)；如SEQ ID NO.11所示序列的下游引物：CTGGATTTAGAGTCTCTCAG(SEQ ID NO.11)；如SEQ ID NO.12所示序列的探针：AACCCTGACCCTGCCGTGTA(SEQ ID NO.12)；

上述各探针还包括荧光修饰剂和荧光淬灭剂。

作为本发明方案的一种优选，用于检测SMN1基因的探针、用于检测内参TRAC基因的探针采用FAM进行荧光修饰，用于检测TREC基因的探针、用于检测KREC基因的探针采用HEX或VIC进行荧光修饰；或者，

用于检测SMN1基因的探针、用于检测内参TRAC基因的探针采用HEX或VIC进行荧光修饰，用于检测TREC基因的探针、用于检测KREC基因的探针采用FAM进行荧光修饰。

作为本发明方案的一种优选，所述荧光淬灭剂可选自MGB、BHQ1的至少一种。

基于同样的发明构思，本发明还提供所述引物探针组合在制备同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的检测试剂中的应用。

基于同样的发明构思，本发明还提供一种同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的试剂盒，其含有所述引物探针组合。

作为本发明方案的一种优选，所述的试剂盒还包括扩增试剂、待测DNA模板。

基于同样的发明构思，本发明还提供一种同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的方法，包括如下步骤：

1)提取样本DNA；

2)以步骤1)提取的样本DNA为模板，使用所述引物探针组合，进行数字PCR扩增反应；

3)根据荧光信号进行判断。

多重反应中条件优化的难点在于使各指标的单阳、双阳甚至三阳的信号雨点尽可能聚集成群且群间相互分开，具体采用的思路是不断调整和优化各指标的引物及探针浓度。作为本发明方案的一种优选，步骤2)中，所述引物探针组合的各引物及探针的浓度为：SMN1、TREC、KREC、TRAC基因扩增引物终浓度选择400～1000nM，探针终浓度选择100～400nM。

进一步优选地，步骤2)中，所述引物探针组合的各引物及探针的浓度为：检测SMN1基因、TREC基因、KREC基因、TRAC基因上游引物和下游引物的终浓度均为900nM，检测SMN1基因探针终浓度150nM，检测TREC基因探针终浓度250nM，检测KREC基因探针终浓度125nM，检测内参TRAC基因探针终浓度225nM。

作为本发明方案的一种优选，步骤2)中，PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃保持。

作为本发明方案的一种优选，所述数字PCR为微滴式数字PCR或芯片式数字PCR。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一，与目前方法相比，本发明不仅可以筛查由于SMN1基因缺失导致的脊髓性肌萎缩症，还可以对TREC和KREC基因进行定量，从而筛查重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症，可以同时实现新生儿脊髓性肌萎缩症和免疫缺陷病的筛查。

第二，与现有筛查使用试剂盒相比，检测结果准确、筛查成本更低、操作时间更短(1天内可完成从样本处理至结果分析的全过程)，满足临床筛查低成本、高通量、短周期的检测需求。

第三，在优选的实施方式中，本发明采用的是微滴式数字PCR检测技术。微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。本发明采用的方法不需要做标准曲线就可以对样本中的靶基因的拷贝数目进行绝对定量，分析简便且结果可重复性好。

第四，本发明中进行了多重检测的优化，在FAM及VIC双通道下实现了SMN1、TREC、KREC和内参基因的同步检测，大幅降低了试剂耗材成本及样本用量。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1是本发明实施例中干血片样本1检测二维图；

图2是本发明实施例中干血片样本2检测二维图；

图3是本发明实施例中干血片样本3检测二维图；

图4是本发明实施例中干血片样本4检测二维图；

图5是本发明实施例中干血片样本5检测二维图。

具体实施方式

针对实践中对重大出生缺陷疾病脊髓性肌萎缩症(SMA)、重症联合免疫缺陷病(SCID)以及无丙种球蛋白血症(XLA)的早期诊断、及早干预治疗的需求，本发明提供一种在1个反应内实现同时对遗传病脊髓性肌萎缩症(SMA)致病基因SMN1拷贝数、重症联合免疫缺陷病(SCID)相关标记物TREC拷贝数以及无丙种球蛋白血症(XLA)相关标记物KREC拷贝数的定量检测和筛查的引物探针组合、试剂盒及检测方法。

发明人对已有技术进行了调研，发现了如下相关技术：

专利文献CN201810874063-脊髓性肌萎缩症检测试剂盒及其应用，公开了一种脊髓性肌萎缩症检测试剂盒，用数字PCR定量检测SMN1基因第7外显子拷贝数，此方法仅能检测脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1，而不能用于检测重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症。

专利文献CN201910741038-一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法，公开了一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法，采用荧光定量方法检测TREC和KREC含量，需要依赖于标准品，需要依赖于标准曲线来进行定量，其检测结果的准确性和稳定性受标准品影响较大，最终导致较高的假阳性和假阴性。

2019年公开发表的杂志论文文献《A Multiplex,Droplet Digital PCR Assayfor the Detection of T-Cell Receptor Excision Circles and Kappa-DeletingRecombination Excision Circles，Clinical Chemistry.Volume 66,Issue 1,Pages229–238》开发了用多重数字PCR来定量检测TREC和KREC含量，文献介绍了开发的方法用于检测全血gDNA检测。

2018年公开发表的杂志论文文献《Multiplex Droplet Digital PCR MethodApplicable to Newborn Screening,Carrier Status,and Assessment of SpinalMuscular Atrophy，Clinical Chemistry.64(12):1753-1761》，开发了多重数字PCR来检测SMN1和SMN2基因拷贝数变化，用于新生儿脊髓性肌萎缩症的筛查。

和上述两篇公开发表的杂志论文相比，优势在于这两篇文献介绍的是三重数字PCR体系，而本发明是四重数字PCR体系，成功实现在一个反应内不仅同时定量检测TREC和KREC含量，还能检测脊髓性萎缩症致病基因SMN1的拷贝数变化，因而可以在一次反应内完成脊髓性萎缩症、重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症三种疾病的筛查，节省了检测成本，节省了样本用量。

本发明的特点在于：

(1)本发明采用微滴式数字PCR来同时检测SMN1、TREC和KREC的拷贝数，同时包括帮助进行质控及均一化的内参基因。微滴式数字PCR是绝对定量方法，不需要标准曲线就可以对检测分子起始量进行绝对定量，而且是终点PCR检测，不依赖Ct值，不依赖扩增效率，能克服PCR抑制剂的影响，具有更好的准确度、精密度和重复性。对于SMN1基因拷贝数，能检测纯合缺失，也能检测含有1个拷贝的携带者，能区分微小差异的拷贝数变化。对于TREC和KREC拷贝数检测，不需要依赖于标准曲线，检测更为精准。

(2)利用多重微滴数字PCR方法，进行四重PCR检测，同时检测SMN1外显子7拷贝数变化，对TREC和KREC基因进行定量检测，同时对内参TRAC进行定量检测。

检测SMN1基因外显子7探针用FAM标记，选用内参TRAC基因用FAM标记，调整两种探针的用量，来绝对定量检测SMN1基因外显子7的拷贝数变化来实现对SMA患者以及携带者的筛查；检测TREC和KREC基因探针均用HEX标记，调整两种探针的用量，来绝对定量检测TREC和KREC的拷贝数，根据TREC拷贝数来筛查重症联合免疫缺陷病，根据KREC拷贝数来筛查无丙种球蛋白血症。

(3)与目前方法相比，本发明不仅可以筛查由于SMN1基因缺失导致的脊髓性肌萎缩症，还可以对TREC和KREC基因进行定量，从而筛查重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症，可以同时实现新生儿脊髓性肌萎缩症和免疫缺陷病的筛查。

(4)与现有筛查使用试剂盒相比，检测结果准确、筛查成本更低、操作时间更短(1天内可完成从样本处理至结果分析的全过程)，满足临床筛查低成本、高通量、短周期的检测需求。

本发明提供的同时进行脊髓性肌萎缩症和原发性免疫缺陷病筛查的检测试剂盒，试剂盒内包括筛查检测脊髓性肌萎缩症基因检测的引物和探针，筛查检测原发性免疫缺陷病(重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症)基因(TREC，KREC)检测的引物和探针。

在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

本实施例包括如下步骤：

1、引物和探针设计和使用浓度确定

1.1引物和探针设计

由于SMN1和SMN2基因的高度同源性，二者仅存在5个碱基差异，其中有2个碱基位于第7和8号外显子，另外三个位于内含子6和内含子7上。因此检测探针设计在exon7上有差异碱基上，上游引物设计在In6c.739-44(835-44)G>A)差异碱基上，以此增加引物和探针对于SMN1基因的特异性,降低SMN2同源序列的非特干扰。

针对SMN1基因、TREC基因、KREC基因、及内参基因TRAC基因，用UCSC上下载的序列为来源，使用Primer 5.0软件和Beacon Designer 7软件设计PCR引物和Taqman探针。每个基因均设计三对引物和探针序列。

1.2引物和探针筛选和确定

先通过双重ddPCR实验正交实验确认SMN1和内参TRAC基因的引物和探针最优序列组合，然后通过三重ddPCR实验正交实验确认最优的TREC和KREC基因的引物和探针最优序列组合。所选引物和探针序列对于基因的结合有很好的特异性，有较高的PCR扩增效率。确定最优序列如下表1：

表1

为了确认最优的探针修饰组合，SMN1、TREC、KREC基因探针另外合成了用HEX修饰的探针，TRAC基因探针另外合成了用FAM修饰的探针，分别用FAM通道双重加HEX通道双重组合方式，各个基因探针组合采用排列组合方式进行不同组合方式实验摸索。通过实验发现，SMN1或TRAC的拷贝数数量级接近，但高于TREC或KREC，当高拷贝数的SMN1基因或TRAC基因和低拷贝数的TREC或KREC基因在同一通道检测时，SMN1基因或TRAC基因的阳性雨点会影响TREC或KREC阳性雨点，造成TREC或KREC拷贝数偏高。所以决定将SMN1基因和TRAC基因在同一通道检测，TREC和KREC基因在同一通道检测。最终确定的最优的引物和探针序列，探针修饰组合如下表2所示。

表2

序列名称	序列	修饰
			SMN1-FP	5'-AAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTC-3'
SMN1-RP	5'-CTTACTCCTTAATTTAAGGAATGTG-3'
			SMN1-P	5'-TACAGGGTTTCAGACAAAA-3'	5'-FAM，3'-MGB
TREC-FP	5’-ATGCTGACACCTCTGGTTTT-3’
			TREC-RP	5’-TGAGAACGGTGAATGAAGAG-3’
TREC-P	5’-CGGTGATGCATAGGCACCTGCAC-3’	5'-HEX，3'-BHQ1
			KREC-FP	5’-CTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTG-3’
KREC-RP	5’-GAGCCAGCTCTTACCCTAGAGTTT-3’
			KREC-P	5’-CACGGGCAGCAGGTTGGC-3’	5'-HEX，3'-BHQ1
TRAC-FP	5’-GTCCTAACCCTGATCCTC-3’
			TRAC-RP	5’-CTGGATTTAGAGTCTCTCAG-3’
TRAC-P	5’-AACCCTGACCCTGCCGTGTA-3’	5'-FAM，3'-BHQ1

1.3引物和探针使用浓度确定

多重反应中条件优化的难点在于使各指标的单阳、双阳甚至三阳的信号雨点尽可能聚集成群且群间相互分开，具体采用的思路是不断调整和优化各指标的引物及探针浓度。SMN1、TREC、KREC、TRAC基因扩增引物终浓度选择400～1000nM，探针终浓度选择100～400nM，通过大量正交实验对比，确定最优的引物和探针终浓度为：检测SMN1基因、TREC基因、KREC基因、TRAC基因上游引物和下游引物的终浓度均为900nM，检测SMN1基因探针终浓度150nM，检测TREC基因探针终浓度250nM，检测KREC基因探针终浓度125nM，检测内参TRAC基因探针终浓度225nM。

2、反应条件确定

本检测体系采用的扩增试剂为商用的伯乐的2X ddPCR预混液(即ddPCR核酸扩增试剂混合物)，通过摸索不同的退火温度来确定最佳的反应条件，最终确定的条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃保持。

3、所发明的试剂盒检测实际样本

3.1样本处理

选用5个干血片样本，其中干血片1、2、3样本分别用五色石的荧光定量检测试剂盒检测过分别为SMN1外显子7纯合缺失，杂合缺失，野生型；干血片4样本为经临床诊断确诊为SCID的儿童来源的干血片；干血片5样本为经临床诊断确诊为XLA的儿童来源的干血片。

干血片DNA的提取，所用的提取方法为实验室自行研发的方法，提取步骤如下：

(1)使用洁净打孔器取直径3mm的待测干血片，并放入1.5mlEP管，加入100μl含0.5％(V/V)Triton X-100的PBS(市售)，800rpm震荡10min，尽量吸去溶液；

(2)加入100μl PBS(市售)，12000rpm离心1min，尽量吸去溶液；

(3)加入100μl Generation DNA Elution Solution II(市售)，800rpm震荡10min，尽量吸去溶液；

(4)加入30μl Generation DNA Elution Solution II，在99℃水浴锅水浴30min后，12000rpm离心1min，转移溶液至新管保存。转移的溶液即为抽提的DNA。

干血片DNA抽提部分，除了本实施例内所述抽提方法步骤，还可以用其它的商业试剂盒来进行抽提，例如市售凯杰(Qiagen)痕量DNA提取试剂盒等。

需要说明的是，新生儿样本可以选用新生儿干血片样本或者选用新生儿的外周血样本。

3.2 PCR反应配制：2X ddPCR预混液(即ddPCR核酸扩增试剂混合物)10μl；检测SMN1基因、TREC基因、KREC基因和TRAC基因上下游引物，终浓度均为900nM；检测SMN1基因探针，终浓度为150nM；检测TREC基因探针，终浓度为250nM；检测KREC基因探针，终浓度为125nM；检测TRAC基因探针，终浓度为225nM；待测DNA模板3μl；用水补足20μl。

3.3生成微滴：

将上述PCR扩增反应体系加入到8道微滴制作板内，加入70μl微滴生成油，用QX200微滴生成器制备PCR微滴反应液。

3.4进行PCR扩增：

将制备好的PCR微滴反应液加入96孔PCR板中，用封膜板进行热封膜后，将96孔PCR板放入PCR仪中进行扩增反应。PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃保持。

3.5结果读取：将扩增好的96孔PCR板放入QX200Droplet Reader读取荧光信号，检测FAM和HEX的荧光信号。结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。

3.6结果分析

用QuantaSoft软件进行数据分析，结果如图1、图2、图3、图4、图5所示。

在进行结果判读前，先评估检测孔内微滴生成数，若微滴生成数量＜10000，则需要重新检测；若微滴数量≥10000，接下来需要评估内参TRAC基因检出拷贝数，用来质控干血片提取出的DNA质量是否有问题或者加入DNA量是否合适，若TRAC基因检测300～10⁵拷贝数/孔，则继续结果判读，若TRAC基因检测＜300拷贝数/孔或者＞10⁵拷贝数/孔，则重新检测。

SMN1基因拷贝数变异CNV分析，QuantaSoft软件根据不同的阳性微滴会自动计算出SMN1基因和内参TRAC基因的拷贝数，根据SMN1基因和内参TRAC基因拷贝数比值计算出SMN1基因的拷贝数CNV。

采用已知临床疾病信息的病人及健康人群样本，经过多轮测试后，我们设置阈值如下，如果SMN1/TRAC的比值为小于0.1，则判定SMN1外显子7发生纯合缺失，CNV为0拷贝；如果SMN1/TRAC的比值为0.35-0.65，则判定SMN1外显子7杂合缺失，CNV为1拷贝；如果SMN1/TRAC的比值为大于等于0.8，则判定SMN1外显子7未发生缺失，CNV为正常2拷贝或者以上。

TREC和KREC基因拷贝数需要进行换算，待检样本进行ddPCR反应体系中基因拷贝数向每单位体积(μl)原始血液中基因拷贝数的换算，该步骤结果为最终的样本检测结果，用于样本结果判定。待测样本的ddPCR反应体系中基因拷贝数向原始血液中基因拷贝数的换算公式如下：基因copies/μl blood＝(每个反应基因拷贝数/每个反应样本体积)*(样本洗脱体积/干血片含血量)。在本实施例中，待检样本中DNA的提取采用一个直径3mm的干血片(约含3μl血量)，洗脱体积为30μl，每个反应样本体积为3μl，根据计算公式：基因copies/μl blood＝(每个反应基因拷贝数/3)*(30/3)＝每个反应基因拷贝数*2。我们设定了阈值如下，TREC拷贝数＜20copies/μl blood，判读为TREC阳性；KRECs拷贝数＜10copies/μlblood，判读为KREC阳性。

以上任一检测结果判读为阳性，则需要重新抽提干血片gDNA进行再次检测确认，再次确认时可采用四重或仅对目标标志物进行检测。

本实施例中，干血片样本1检测结果如图1，干血片样本2检测结果如图2，干血片样本3检测结果如图3，干血片样本4检测结果如图4，干血片样本5检测结果如图5，纵坐标为第一通道(FAM通道)，检测雨点表示内参TRAC基因和SMN1基因，横坐标为第二通道(HEX通道)，检测雨点表示TREC基因和KREC基因。各图中NEG表示未包含DNA的微滴，SMN1+表示SMN1基因阳性雨点，TRAC+表示TRAC基因阳性雨点，TREC+表示TREC基因阳性雨点，KREC+表示KREC基因阳性雨点，TREC+KREC+表示TREC基因和KREC基因双阳雨点，SMN1+TRAC+表示SMN1基因和TRAC基因双阳雨点，TRAC+TREC+表示TRAC基因和TREC基因双阳雨点，TRAC+KREC+表示TRAC基因和KREC基因双阳雨点。

本实施例中5个干血片样本检测结果和判读结果如下表3所示.

表3

检出1号样本为SMN1外显子7纯合缺失，2号样本SMN1外显子杂合缺失，3号样本SMN1外显子7正常拷贝，4号样本TREC阳性，5号样本KREC阳性，和预期结果一致。

需特别说明的是，本发明四个检测指标基因SMN1、TRAC、TREC、KREC引物和探针组合除了应用于本发明上述实施例所示的微滴式数字PCR平台，也可以应用于其它数字PCR平台，比如芯片式数字PCR平台等。

本发明内所述四种基因SMN1、TRAC、TREC、KREC的检测探针修饰，在以上实施例中为用于检测SMN1基因的探针、用于检测内参TRAC基因的探针分别采用FAM进行荧光修饰；用于检测TREC基因的探针、用于检测KREC基因的探针分别采用HEX进行荧光修饰；此外，也可以用其它的探针修饰，例如TREC和KREC基因探针也可以用VIC修饰；或者采用SMN1、TRAC基因探针用HEX/VIC修饰，TREC、KREC基因探针用FAM修饰组合检测。

在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

序列表

<110> 上海捷易生物科技有限公司

<120> 一种疾病筛查引物探针组合及其应用、试剂盒与检测方法

<130> H20100040

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

Claims

1.一种引物探针组合，其特征在于，包括如下引物探针组：

上述各探针还包括荧光修饰剂和荧光淬灭剂。

2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，用于检测SMN1基因的探针、用于检测内参TRAC基因的探针采用FAM进行荧光修饰，用于检测TREC基因的探针、用于检测KREC基因的探针采用HEX或VIC进行荧光修饰；或者，

3.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光淬灭剂选自MGB、BHQ1的至少一种。

4.根据权利要求1-3任意一项所述引物探针组合在制备同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的检测试剂中的应用。

5.一种同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-3任意一项所述引物探针组合。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂、待测DNA模板。

7.一种非疾病诊断目的同时对SMN1拷贝数、TREC拷贝数以及KREC拷贝数进行定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取样本DNA；

2)以步骤1)提取的样本DNA为模板，使用权利要求1-3中任一所述引物探针组合，进行数字PCR扩增反应；

3)根据荧光信号进行判断。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物探针组合中各引物及探针的浓度为：SMN1、TREC、KREC、TRAC基因扩增引物终浓度选择400～1000nM，探针终浓度选择100～400nM。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物探针组合中各引物及探针的浓度为：检测SMN1基因、TREC基因、KREC基因、TRAC基因上游引物和下游引物的终浓度均为900nM，检测SMN1基因探针终浓度150nM，检测TREC基因探针终浓度250nM，检测KREC基因探针终浓度125nM，检测内参TRAC基因探针终浓度225nM。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃保持。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述数字PCR为微滴式数字PCR或芯片式数字PCR。