CN109852687A - 一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组、试剂盒及方法。本发明根据与遗传病相关的9种基因和2种TREC，设计了具有针对性的引物组，结合二代测序技术实现了对常见遗传病基因的筛查，具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因检测领域，具体涉及一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组、试剂盒及方法。
背景技术
新生儿遗传病筛查和风险评估主要针对在新生儿期可能对孩子的生长发育和智力发育造成严重影响的一类先天性、遗传性代谢性疾病。在国外，对高危人群的若干严重隐性遗传疾病的孕前检测和遗传咨询已经显著地降低了这些疾病的发病率。例如Tay-Sachs病，这是一种婴儿期发病的常染色体隐性神经退行性疾病，患者多在2-5岁内死去；Tay-Sachs病在进行孕前携带者筛查之前，在北美德裔犹太人中的发病率为1/3600，但是经过几十年的孕前携带者筛选及相应的方法措施，其发病率已经减少了90％以上。地中海贫血是我国东南部高发的一种遗传病，其发病率达2.5％-15％，此外，脊肌萎缩症(SMA)、苯丙酮尿症、肝豆状核变性等也是预后差、在中国人群携带率比较高的遗传病。美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)和美国妇产科医师学会(ACOG)都建议对这些高发、预后差的遗传病进行携带者筛查。对于遗传病所导致的出生缺陷，能通过对新生儿遗传性相关基因进行风险评估，根据风险评估的分值采取相应的人工干预措施，从而大幅度提高患者的生存质量、大大降低家庭和社会负担。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明的目的是提供一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组、试剂盒及方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
提供了一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组，
包括用于检测HBA1和HBA2的3对引物对，其序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示；和，
用于检测HBB的3对引物对，其序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示；和，
用于检测ATP7B的23对引物对，其序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.58所示；和，
用于检测BTD的6对引物对，其序列如SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.70所示；和，
用于检测SMN1和SMN2的9对引物对，其序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.88所示；和，
用于检测GALT的11对引物对，其序列如SEQ ID NO.89-SEQ ID NO.110所示；和，
用于检测G6PD的14对引物对，其序列如SEQ ID NO.111-SEQ ID NO.138所示；和，
用于检测signal-joint TREC的引物对，其序列如SEQ ID NO.139-SEQ ID NO.140所示；和，
用于检测coding-joint TREC的引物对，其序列如SEQ ID NO.141-SEQ ID NO.142所示。
其中，不同于传统方法设计引物对T细胞的序列进行直接扩增，本发明的引物对是针对T细胞的2种环形产物signal-joint TREC和coding-joint TREC而设计的，具有相同的效果。
上述的引物组能够用于制备检测HBA1、HBA2、HBB、G6PD、GALT、ATP7B、BTD、SMN1、SMN2、signal-joint TREC和coding-joint TREC的试剂。
还提供了一种遗传病筛查的方法，包括以下步骤：
步骤1：合成上述用于检测遗传病基因的引物组；
步骤2：将引物组和提取的待检测样品置于含有PGx-PCR酶的PCR反应体系中进行扩增；
步骤3：将待检测样品、扩增产物进行纯化处理后，进行二代测序分析。
优选地，所述PGx-PCR酶包括一个Taq酶和一个高保真酶。
优选地，所述Taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5。
进一步地，所述纯化分析采用磁珠法。
还提供了一种包含上述用于遗传病筛查的引物组的试剂盒，试剂盒还包括一个Taq酶、一个高保真酶、质控品以及阴性质控品。
本发明的有益效果为：本发明根据与遗传病相关的9种基因和2种TREC，设计了具有针对性的引物组，结合二代测序技术实现了对常见遗传病基因的筛查，具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。
附图说明
图1为c.3982G>A(p.Ala1328Thr)的二代测序的局部原始数据；
图2为c.2975C>T(p.Pro992Leu)的二代测序的局部原始数据；
图3为c.95A>G(p.His32Arg)的二代测序的局部原始数据。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：用于遗传病筛查的引物组的设计
发明人经过查阅大量遗传病致病基因相关文献及数据库，通过高通量的实验筛选及相关实验验证，设计出了一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组，
包括用于检测HBA1和HBA2的3对引物对，其序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示；和，
用于检测HBB的3对引物对，其序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示；和，
用于检测ATP7B的23对引物对，其序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.58所示；和，
用于检测BTD的6对引物对，其序列如SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.70所示；和，
用于检测SMN1和SMN2的9对引物对，其序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.88所示；和，
用于检测GALT的11对引物对，其序列如SEQ ID NO.89-SEQ ID NO.110所示；和，
用于检测G6PD的14对引物对，其序列如SEQ ID NO.111-SEQ ID NO.138所示；和，
用于检测signal-joint TREC的引物对，其序列如SEQ ID NO.139-SEQ ID NO.140所示；和，
用于检测coding-joint TREC的引物对，其序列如SEQ ID NO.141-SEQ ID NO.142所示。
实施例2：遗传病筛查方法的建立
步骤一：合成实施例1中的用于遗传病筛查的引物组；
步骤二：将引物组与提取的待检测样品置于含有PGx-PCR酶的PCR反应体系中进行扩增；其中，所述PGx-PCR酶包括一个Taq酶和一个高保真酶，所述Taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5；PCR反应体系为12.5μL PGx-PCR酶，1μL DNA引物组，8.75μL DNA(50ng)和DNase-free water，0.75μL Betaine，补水至25μL；反应条件为：98℃预变性30s；循环5次(98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延伸30s)；72℃延伸5min；
步骤三：将待检测样品和扩增产物采用磁珠法纯化处理后进行二代测序分析；其中，在本实施例中采用Ion Torrent平台对纯化后的待测序产物进行测序。
实施例3：一种用于遗传病筛查的试剂盒
基于上述检测方法，本发明还提供一种用于遗传病筛查的试剂盒，其包括：
实施例1中的引物组；
PGx-PCR酶，由一个Taq酶和一个高保真酶组成，Taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5；
质控品，即已知的遗传病基因发生突变的标准品；
以及阴性质控品，为无核酸水。
通过得到的试剂盒的检测结果结合二代测序分析实现对遗传病的筛查。
实施例4：临床应用
应用实施例2的遗传病筛查的方法，检测了500名新生儿的干血片标本，并发现了29例阳性患者，其中27例为G6PD基因突变患者，2例为ATP7B基因突变患者。
患者一：男，出生3天，临床表现无异常。取干血片两个打孔片，常规提取DNA后使用本发明的遗传病筛查的方法进二代测序，结果分别发现ATP7B基因(引起肝豆状核变性疾病)内两个杂合变异：c.3982G>A(p.Ala1328Thr)和c.2975C>T(p.Pro992Leu)。经过对父母的一代测序验证，发现两个变异分别来自父母，证明两个变异将分别本患儿的两个正常的ATP7B基因，理论上如不尽快进行相关治疗，一段时候后患者体内将因为没有足够的ATP7B蛋白而导致铜离子堆积，造成肝硬化，神经系统功能异常、人格改变等严重后果。患者家属在获知该诊断结果后立即开始了铜离子螯合剂的治疗，根据临床经验这将显著改善患儿预后，有可能终身不会表现出相关临床症状。
c.3982G>A(p.Ala1328Thr)和c.2975C>T(p.Pro992Leu)的二代测序的局部原始数据如图1和图2所示，处于一列的圆圈圈住的位点即为真突变信号，其它则属于杂讯。
c.3982G>A(p.Ala1328Thr)变异的致病性分析证据：该变异在gnomAD普通人数据库东亚人群中的频率为0(PM2)，该位点位于保守功能域HAD-like domain，参与蛋白之间相互作用(PM1),生物信息学软件SIFT和Polyphen2预测该变异分别为有害的(Damaging)和很可能有害的(Probably Damaging)变异(PP3)，有文献在多例肝豆状核变性患者中检出该变异(PM)。基于以上证据，判定该变异为疑似致病性变异(Likely pathogenic：PM+PM1+PM2+PP3)。
c.2975C>T(p.Pro992Leu)变异的致病性分析证据：该变异在gnomAD普通人数据库东亚人群中的频率为0.0005(PM2)，该位点位于保守功能域P-type ATPase domain，参与蛋白之间相互作用(PM1),功能验证实验表明该变异会导致细胞对铜耐受能力下降，并影响铜离子从细胞内正常转运出去(PS3)，生物信息学软件SIFT和Polyphen2预测该变异分别为有害的(Damaging)和很可能有害的(Probably Damaging)变异(PP3)，有文献在多例肝豆状核变性患者中检出该变异，是中国人群中比较常见的致病变异(PM)，并且与已知的致病变异p.Arg778Leu、p.Ile1148Thr、p.Ser975Tyr等形成复合杂合型变异关系(PS)，ClinVar数据库记录该变异为致病性变异(Pathogenic)。基于以上证据，判定该变异为致病性变异(Pathogenic:PS+PS3+PM+PM1+PM2+PP3)。
患者二：男，出生5天，临床表现无异常。取干血片两个打孔片，常规提取DNA后使用本发明的遗传病筛查的方法进行二代测序，结果发现G6PD基因(引起蚕豆病)内一个半合子变异：c.95A>G(p.His32Arg)。因为该病为X连锁隐性遗传，本患儿为男性，其唯一一个G6PD基因的功能将因为这个半合子变异收到影响，理论上该患儿如果将来不慎食入新鲜蚕豆，或者磺胺类、呋喃类、非那西汀、氢基比林等药物及中药珍珠粉、腊梅花、川黄连等药物，有可能引发溶血，严重时可能危及生命。患者家属在获知该诊断结果后表示理解并且将积极配合。根据临床经验这将明显降低患儿将来因蚕豆病发生严重溶血的可能性。
c.95A>G(p.His32Arg)的二代测序的局部原始数据如图3所示，处于一列的圆圈圈住的位点即为真突变信号，其它则属于杂讯。
G6PD c.95A>G(p.His32Arg)变异的致病性评分证据：该变异在gnomAD普通人数据库总人群中的频率为0.0001(PM2)；该变异位于NAD(P)-binding结构域超家族，参与蛋白之间相互作用(PM1)；功能验证实验表明该变异位点可导致Glucose-6-phosphate脱氢酶活性的丧失(PS3)；生物信息学软件SIFT和Polyphen2预测该变异分别为可容忍的(Tolerated)和可能有害的(Possibly Damaging)变异；有文献报道该变异在多个类似疾病患者中检出，发生于该氨基酸残基的其他致病性变异(p.H32D，p.H32L，p.H32E)也在类似患者中检出(PM5)。基于以上证据，判定该变异为致病性变异(Pathogenic:PS3+PM1+PM2+PM5)。
SEQUENCE LISTING
<110> 普文博泰生物科技（佛山）有限公司
<120> 一种用于遗传病筛查的引物组、试剂盒及方法
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<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 69
ctgtatgccc tgggggtct 19
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 70
agggcttgta gcctgtggaa 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 71
cgtactgttc cgctcccaga 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 72
aggctgcgga aggagagttg 20
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 73
tttcagtgta attttgttat gtgtgga 27
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 74
aaaataagaa aacgactaag caagca 26
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 75
ttctgtgcac caccctgtaa 20
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 76
aaataaggac taatgagaca tcctttga 28
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 77
cacctcccca ctgatcaaaa c 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 78
aaaaattaat gcctcggtgg a 21
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 79
tcttaatcac acccttataa caaaaacc 28
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 80
caaaagtttc atgggagagc taca 24
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 81
tccttttggt tttgagtcct ttt 23
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 82
tggcccaagg gatgttctac 20
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 83
cctcgtcttt gtttagggga aa 22
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 84
tgtcaggaaa agatgctgag tga 23
<210> 85
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 85
caaaatgctt tttaacatcc atataa 26
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 86
tcactttcat aatgctggca gac 23
<210> 87
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 87
caaaatgctt tttaacatcc atataa 26
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 88
tcactttcat aatgctggca gac 23
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 89
tggtgtggac ggagaaagtg 20
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 90
gaggggacga aagcttccta a 21
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 91
gctctgagga ctgatcttga ctg 23
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 92
ggaggttcac tatccctgtg g 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 93
tctttgaagc ccaccaggta a 21
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 94
tgcagcagaa gtccctcaa 19
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 95
gacctcttga gggacttctg ct 22
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 96
agaggtaggg cttggctgtg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 97
tagcacagcc aagccctacc 20
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 98
ccctccctgc ccatccag 18
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 99
ggtgtggtca ggagggagtt 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 100
ctccaagcct ccacatcatt 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 101
caatgatgtg gaggcttgga 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 102
ttagggactc cttggggaca 20
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 103
tgtcaccttg atgacttcct atcc 24
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 104
actgggagca acctccatcc 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 105
gctaggcact ggatggaggt 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 106
caggagccca gaaatggtgt 20
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 107
ggctctctct ccccactgtc t 21
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 108
ctgccttgtg caatgactgg 20
<210> 109
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 109
cagcccagcc cttatcctc 19
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 110
gattcaaggc cctttctgct t 21
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gtggagctac ctcatgcctc t 21
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 112
aggtcaatgg tcccggagt 19
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 113
ggctatgggg tggccttt 18
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 114
gtggaggaga ggcatgaggt 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 115
gcagtggcat cagcaagaca 20
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 116
aaaggccacc ccatagcc 18
<210> 117
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 117
gtgctgaggc tgccctttc 19
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 118
ccctccacac tgctccttct 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 119
acccaaggag cccattctct 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 120
atgcccagtt ctgccttgct 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 121
aagggggatc aggaagtgag 20
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 122
catgctcctg gggactgg 18
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 123
cacagaggcc caaggtcagt 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 124
gcctcccagg agagaggaag 20
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 125
ggagggcgtc tgaatgatg 19
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 126
gaactgacct tgggcctctg 20
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 127
ggactcaaag agaggggctg a 21
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 128
agggagggca acggcaag 18
<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 129
ctgcccgcac tggttaca 18
<210> 130
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 130
ctgggggctg gtagagagg 19
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 131
ccaagggtgg aggatgatgt 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 132
aggtgttttc gggcagaagg 20
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 133
gcgtcctgaa cgcccatc 18
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 134
ctcccacccc taccagaaag 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 135
ggtgtgagac cccagaggaa 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 136
gattggggcc tgggagatac 20
<210> 137
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 137
agcgcaggtg cccgagag 18
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 138
tgcggggtat aaagggattg 20
<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 139
aaagagggca gccctctcca aggcaaa 27
<210> 140
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 140
aggctgatct tgtctgacat ttgctccg 28
<210> 141
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 141
cctgtttgtt aaggcacatt agaatctctc actg 34
<210> 142
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 142
ctaataataa gatcctcaag ggtcgagact gtc 33
Claims (7)
1.一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组，其特征在于，
包括用于检测HBA1和HBA2的3对引物对，其序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示；和，
用于检测HBB的3对引物对，其序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示；和，
用于检测ATP7B的23对引物对，其序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.58所示；和，
用于检测BTD的6对引物对，其序列如SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.70所示；和，
用于检测SMN1和SMN2的9对引物对，其序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.88所示；和，
用于检测GALT的11对引物对，其序列如SEQ ID NO.89-SEQ ID NO.110所示；和，
用于检测G6PD的14对引物对，其序列如SEQ ID NO.111-SEQ ID NO.138所示；和，
用于检测signal-joint TREC的引物对，其序列如SEQ ID NO.139-SEQ ID NO.140所示；和，
用于检测coding-joint TREC的引物对，其序列如SEQ ID NO.141-SEQ ID NO.142所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于遗传病筛查的复合扩增引物组在制备检测HBA1、HBA2、HBB、G6PD、GALT、ATP7B、BTD、SMN1、SMN2、signal-joint TREC和coding-joint TREC的试剂中的应用。
3.一种遗传病筛查的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：合成权利要求1所述的引物组；
步骤2：将引物组和提取的待检测样品置于含有PGx-PCR酶的PCR反应体系中进行扩增；
步骤3：将待检测样品、扩增产物进行纯化处理后，进行二代测序分析。
4.根据权利要求3所述的一种遗传病筛查的方法，其特征在于，所述PGx-PCR酶包括一个Taq酶和一个高保真酶。
5.根据权利要求4所述的一种遗传病筛查的方法，其特征在于，所述Taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5。
6.根据权利要求3所述的一种遗传病筛查的方法，其特征在于，所述纯化分析采用磁珠法。
7.一种用于遗传病筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测遗传病基因的引物组、一个Taq酶、一个高保真酶、质控品以及阴性质控品。
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