CN111172085B - 一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用；将枯草芽孢杆菌Bsbc01经活化培养，制得活化菌种；然后经扩大培养，制得发酵种子；再将发酵种子接种于诱导发酵培养基中，经诱导发酵，制得发酵液。本发明首次发现，当发酵培养基中含有胰蛋白胨和大豆蛋白胨经胰蛋白酶和中性蛋白酶分解后的小分子蛋白存在时，可以诱导枯草芽孢杆菌Bsbc01产生抗真菌的抗菌物质，从而使发酵液中富含可以杀灭真菌的代谢产物。

Description

一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
农业真菌性病害在我国广泛分布，病害真菌种类复杂多样，真菌性病害占全部植物病害70％—80％以上。真菌性病害不仅对植株本身产生破坏作用，还会传播到果实和种子中，降低果实的商品价值。更严重的是黄曲霉、禾谷镰孢霉菌和尖孢镰刀菌等会产生霉菌毒素物质，直接威胁采食动物和人类的生命健康。因真菌能形成孢子形态，具有潜伏侵染特性，可以跟随种子在合适条件下萌发继续产生破坏作用。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种,广泛分布在土壤及腐败的有机物中,易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢杆菌能形成孢子具有很好的抗逆性，并且它还有生长繁殖快、营养需求低，能高效分泌许多代谢产物，且不会产生毒素物质等特点，被认为是一种无致病性的安全微生物。
枯草芽孢杆菌和真菌都是典型的需氧型微生物，枯草芽孢杆菌可以通过自身快速繁殖来和致病性真菌竞争自由氧来抑制致病性真菌的生长。枯草芽孢杆菌会产生氨基糖类、肽类和酯肽类等抗菌物质，目前枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质对细菌类致病菌有很好地杀灭作用，但是对真菌类致病菌作用效果不明显，所以诱导枯草芽孢杆菌产生抗真菌的代谢产物是提高枯草芽孢杆菌防治和治疗农业真菌性病害的有效途径之一。
中国专利文献CN109929784A(申请号201910323006.5)公开了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No.17239。本发明首次公开了一种具有从青藏高原养殖区筛选获得的枯草芽孢杆菌，该菌较现有已知枯草芽孢杆菌具有显著的低氧耐受特性，作为动物饲料添加剂较现有枯草芽孢杆菌具有更好的应用效果。
虽然现有枯草芽孢杆菌中也有报道可以产生抗真菌物质，但在实际应用过程中，效果并不显著。目前均采用基因工程手段进行改造，如中国专利文献CN109136250A(申请号201811041119.8)公开了通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，该方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS-LPComAR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组comA基因的方法构建了一个高产bacillomycin D菌株，命名为fmbJcomA。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产bacillomycin D的能力大幅度提高。但该菌在低氧条件下，相关能力大幅下降。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用。本发明在通过液体培养基配方及培养方式的优化后，在低氧条件下不仅发酵液枯草芽孢杆菌活菌量明显提升，而且对致病性真菌的抑制效果有明显提升。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌Bsbc01经活化培养，制得活化菌种；
(2)将步骤(1)制得的活化菌种经扩大培养，制得发酵种子；
(3)将步骤(2)制得的发酵种子接种于诱导发酵培养基中，经诱导发酵，制得发酵液；
所述诱导发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨5～15g，豆粕粉15～25g，玉米粉40～60g，氯化钠4～6g，磷酸氢二钾2～3g，中性蛋白酶80～120U，胰蛋白酶8～12U，高温淀粉酶45～55U，糖化酶45～55U，余量水，pH6.8～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌Bsbc01来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC NO.17239。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化培养条件为28～32℃、120rpm培养45～50h。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化培养的培养基，每升组份如下：
胰蛋白胨1.5～1.9g，大豆蛋白胨0.2～0.4g，氯化钠0.8～1.2g，磷酸氢二钾0.4～0.6g，葡萄糖0.4～0.6g，pH6.8～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩大培养活化培养条件为28～32℃、120rpm培养45～50h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩大培养的培养基，每升组份如下：
胰蛋白胨1.5～1.9g，大豆蛋白胨0.2～0.4g，氯化钠0.8～1.2g，磷酸氢二钾0.4～0.6g，葡萄糖0.4～0.6g，pH6.8～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵种子按体积百分比5％～10％的比例接种于诱导发酵培养基中。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，诱导发酵条件为：在通气量4.5～5.5L/h、温度32～38℃的条件下培养20～30h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，诱导发酵培养基采用如下方法制备：
将诱导发酵培养基原料按比例混合后，在35～39℃酶解0.5～3h，然后升温至95℃以上，保温1～3h，自然冷却，即得。
有益效果
1、本发明首次发现，当发酵培养基中含有胰蛋白胨和大豆蛋白胨经胰蛋白酶和中性蛋白酶分解后的小分子蛋白存在时，可以诱导枯草芽孢杆菌Bsbc01产生抗真菌的抗菌物质，从而使发酵液中富含可以杀灭真菌的代谢产物；
2、本发明所述的诱导枯草芽孢杆菌Bsbc01在低氧浓度条件下于诱导发酵培养基中发酵培养时，可以显著提升杀灭真菌的代谢产物的生成量。
附图说明
图1是实施例1中对照组1-3和实验组配制的诱导发酵培养基经12％SDS-pAGE电泳后蛋白分布情况结果照片；
图2是实施例2中对照组1-4和实验组配制的发酵液处理前后及发酵过程中还原糖含量的变化曲线图；
图3是小分子蛋白可以诱导枯草芽孢杆菌Bsbc01产抗真菌物质的对比试验结果照片；
图4是枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵液对不同致病性真菌的抑制情况柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明所保护范围不限于此。
菌株来源
实施例中所述枯草芽孢杆菌Bsbc01为现有已知菌株，可购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC NO.17239。
原料来源
中性蛋白酶、胰蛋白酶、高温淀粉酶、糖化酶均为普通市售产品，购自北京国药试剂有限公司。
实施例1、发酵液蛋白胨和豆粕粉处理前后大分子蛋白比较
实验组：
诱导发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨10g，豆粕粉20g，玉米粉50g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，中性蛋白酶100U，胰蛋白酶10U，高温淀粉酶50U，糖化酶50U，余量水，pH7；
对照组1：
发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨10g；豆粕粉20g；玉米粉50g；氯化钠5g；磷酸氢二钾2.5g，中性蛋白酶150U，高温淀粉酶50U，糖化酶50U，余量水，pH7；
对照组2：
发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨30g，玉米粉50g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，中性蛋白酶100U，胰蛋白酶10U，高温淀粉酶50U，糖化酶50U，余量水，pH7；
对照组3：
发酵培养基，每升组份如下:
豆粕粉30g，玉米粉50g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，中性蛋白酶100U，胰蛋白酶10U，高温淀粉酶50U，糖化酶50U，余量水，pH7；
检测过程
①分别取对照组1-3和实验组培养基，各取100ml，实验组在37℃条件下保温30min，对照组1-3不经过在37℃条件下保温30min的步骤，然后分别通过旋转蒸发仪将两个发酵液浓缩到5ml，加25ml 0.6wt％KOH，常温下磁力搅拌1h，4000rpm，离心10min，取上清；
②100μl上清+100μl loading buffer，混匀后煮沸8min；
③取10μl，在12wt％SDS-pAGE胶上点样，在5％浓缩胶内保持恒流15mA，约40-50min，进入分离胶，调节电流至20mA，直至前言接近地面1cm处；
④剥胶后染色2h，脱色过夜；
实验结果见图1，从图1中可以看出：在通过胰蛋白酶和中性蛋白酶处理后发酵液中的大分子蛋白物质全部分解，变成小分子肽类物质；而没有经过37℃条件下保温30min酶解步骤的对照组1-3，因为豆粕粉所含蛋白质分量较大，蛋白胨所含蛋白质分子量比较小，导致对照3含有较多大分子类蛋白，而对照2小分子蛋白较多。
实施例2、发酵液处理前后及发酵过程中还原糖含量变化
实验组：
诱导发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨10g，豆粕粉20g，玉米粉50g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，中性蛋白酶100U，胰蛋白酶10U，高温淀粉酶50U，糖化酶50U，余量水，pH7；
对照组4：
发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨10g，豆粕粉20g，玉米粉50g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，中性蛋白酶100U，胰蛋白酶10U，糖化酶100U，余量水，pH7；
检测过程
①取对照组1-4、实验组发酵培养基在37℃条件下保温30min后，接种，然后每隔4h取枯草芽孢杆菌发酵液各10ml，4000rpm，离心10min，取上清；
②将样品分别取2ml上清液各加入2ml DNS试剂，充分混匀后，放置沸水浴中煮沸10min，泠却后定容至15ml。
③以蒸馏水为空白对照，在550nm下测定各试液的吸光值，然后通过葡萄糖标准曲线计算发酵液中还原糖含量；
④分别接种枯草芽孢杆菌Bsbc01进行培养，培养条件为30℃、120rpm。
实验结果见图2，从图2看出在通过高温淀粉和糖化酶水解后，实验组和对照组1-3玉米和豆粕中不能被微生物利用的淀粉和纤维等大分子碳源被分解成可以被微生物利用的还原糖，接种后还原糖在8-16h被迅速利用，20h后随着可利用的碳源减少，枯草芽孢杆菌Bsbc01会形成孢子，有利于产品的运输和保存。
从图2可以看出，初始阶段，因为玉米等碳源物质所含都是淀粉等大分子能量物质，微生物不能直接利用，经过酶解后淀粉物质被分解成可以被微生物利用的还原糖，在微生物生长繁殖过程中还原糖被利用，所以含量逐渐减少，最后没有碳源物质后，枯草芽孢杆菌Bsbc01因缺乏碳源物质就会自己形成芽孢。
实施例3、枯草芽孢杆菌Bsbc01诱导产抗真菌物质实验
1)将枯草芽孢杆菌Bsbc01分别经活化培养和扩大培养，制得发酵种子；
活化培养条件为30℃、120rpm培养48h；
活化培养的培养基，每升组份如下：
胰蛋白胨1.7g，大豆蛋白胨0.3g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，葡萄糖0.5g，pH7.0。
扩大培养活化培养条件为30℃、120rpm培养48h。
扩大培养的培养基，每升组份如下：
胰蛋白胨1.7g，大豆蛋白胨0.3g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，葡萄糖0.5g，pH7.0。
将上述制得的发酵种子按照体积百分比10％的比例分别接种与上述实验例及对照组1～4中配制的培养基中，分别按照如下发酵方式进行发酵培养：
发酵方式I：按照枯草芽孢杆菌常规培养方式，将枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵种子进行接种，在通气量30L/h、35±2℃条件下，发酵培养24h；
发酵方式II：按照枯草芽孢杆菌常规培养方式，将枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵种子进行接种，在通气量5L/h、35±2℃条件下，发酵培养24h；
然后分别将按上述发酵方式I和发酵方式II制得的发酵液进行如下抑制真菌对比试验：
分别将通过不同发酵方式由对照组1-4及实验组的发酵培养基发酵获得的发酵液对尖香蕉枯萎病致病菌孢镰刀菌进行平板对峙实验，结果如下：
实验结果见图3，从图3可以看出发酵方式I枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵液均没有明显的抑真菌效果，发酵方式II实验组和对照组4有抑制真菌的效果，但是对照组4效果明显不如实验组抑制真菌效果。
实施例4、枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵液对和抗真菌药物酮康唑抑制真菌效果比较
①致病菌尖孢镰刀菌培养：从尖孢镰刀菌冻存管中取100μl加入到10ml PDA培养液中，30℃培养48h。
②将致病菌尖孢镰刀菌的培养液通过涂布的方式均匀的涂布到PDA固体培养基上。
③分别将实施例3中发酵方式I和发酵方式II两种发酵方式获得的枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵液、2％酮康唑、3％酮康唑、4％酮康唑5％酮康唑、7％酮康唑和10％酮康唑各100μl分别加入到牛津杯中，通过观察测定抑菌圈大小。
实验结果见图4，从图4可以看出枯草芽孢杆菌Bsbc01发酵液和5％酮康唑抑菌效果相当，具有很好地抑制真菌效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌在生产抑制真菌物质中的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌Bsbc01经活化培养，制得活化菌种；
所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌Bsbc01来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.17239；
(2)将步骤(1)制得的活化菌种经扩大培养，制得发酵种子；
(3)将步骤(2)制得的发酵种子接种于诱导发酵培养基中，经诱导发酵，诱导发酵条件为：在通气量4.5～5.5L/h、温度32～38℃的条件下培养20～30h，制得发酵液；
所述诱导发酵培养基，每升组份如下:
蛋白胨5～15g，豆粕粉15～25g，玉米粉40～60g，氯化钠4～6g，磷酸氢二钾2～3g，中性蛋白酶80～120U，胰蛋白酶8～12U，高温淀粉酶45～55U，糖化酶45～55U，余量水，pH6.8～7.2。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，活化培养条件为28～32℃、120rpm培养45～50h。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，活化培养的培养基，每升组份如下：
胰蛋白胨1.5～1.9g，大豆蛋白胨0.2～0.4g，氯化钠0.8～1.2g，磷酸氢二钾0.4～0.6g，葡萄糖0.4～0.6g，pH6.8～7.2。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，扩大培养活化培养条件为28～32℃、120rpm培养45～50h。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，扩大培养的培养基，每升组份如下：
胰蛋白胨1.5～1.9g，大豆蛋白胨0.2～0.4g，氯化钠0.8～1.2g，磷酸氢二钾0.4～0.6g，葡萄糖0.4～0.6g，pH6.8～7.2。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，发酵种子按体积百分比5％～10％的比例接种于诱导发酵培养基中。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，诱导发酵培养基采用如下方法制备：
将诱导发酵培养基原料按比例混合后，在35～39℃酶解0.5～3h，然后升温至95℃以上，保温1～3h，自然冷却，即得。
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