CN113088469A - 贝莱斯芽孢杆菌am6、菌剂及其制备方法、应用 - Google Patents

贝莱斯芽孢杆菌am6、菌剂及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

一株贝莱斯芽孢杆菌AM6(Bacillus velezensis)、菌剂及其制备方法、应用，该贝莱斯芽孢杆菌AM6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21320。该菌株生长条件要求不高，具有广泛的环境适应性，能够作为具有抗菌活性的食品、抗菌活性的动物和水产品饲料、以及作为植物及作物用抗菌剂。

Description

贝莱斯芽孢杆菌AM6、菌剂及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种贝莱斯芽孢杆菌AM6、菌剂及其制备方法、应用。
背景技术
上个世纪以来，农业生产以及畜禽养殖等过程中农药和抗生素等化学品的大规模使用，解决了数十亿人的食物来源问题。然而，这些化学品的应用带来的环境影响已凸显。针对这些现状，各国家也制定了系列法规等来摆脱对这类化学品的依赖。例如，欧盟近期制定了包括降低50％的化工制剂和有毒杀虫剂等一系列目标来大幅降低未来十年欧洲农用化学品的使用量。科学家已经着手开发生物技术等生物学解决方案，以改善农业生产以及畜禽养殖等方式。
芽孢杆菌是一类分布广泛的革兰氏阳性细菌，因其可以产生内生芽孢，具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物等抗逆能力。芽孢杆菌属一般能够产生多种抗菌物质，已有报告的抗菌物质有抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、抗真菌素(eumycin)、表面活性素(surfactin)、脂蛋白(lipoprotein)等。鉴于芽孢杆菌的以上特性，该类微生物常被加工成制剂而得到广泛应用。例如，目前用于植物病害防治的商品化芽孢杆菌主要为枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌制剂等。然而现在对于具有更广谱抗菌性能的芽孢杆菌研究尚且较少，筛选出环境适应性强、具有广泛抗菌活性的芽孢杆菌具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌AM6、菌剂及其制备方法、应用，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少一种。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
作为本发明的一个方面，提供了一种贝莱斯芽孢杆菌AM6(Bacillusvelezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21320；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期为2020年12月7日。
作为本发明的另一个方面，提供了一种菌剂，其活性成分为由上述贝莱斯芽孢杆菌AM6经发酵培养得到。
作为本发明的再一个方面，提供了一种上述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌AM6接种LB1培养平板上，于37℃培养12h；将所述LB1培养平板的菌落转移至LB1液体培养基，于37℃培养12h得到种子液；将所述种子液以1％体积比接种LB1液体培养基，于37℃进行发酵培养30h，得到发酵液以作为液体菌剂，所述发酵培养的通风量为500～1000m3/h，罐压为0.04Mpa，转速为80rpm。
作为本发明的又一个方面，提供了一种上述贝莱斯芽孢杆菌AM6和/或菌剂在制备食品抗菌组合物、饲料抗性抗菌组合物和植物及作物用抗菌组合物中的应用。
基于上述技术方案，本发明的贝莱斯芽孢杆菌AM6、菌剂及其制备方法、应用至少包括以下技术效果之一或其中一部分：
(1)本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌AM6其营养要求简单，生长温度范围30～50℃，生长pH范围5.0～9.0，其成孢率高，具有良好的耐盐碱和耐干旱的特性。
(2)该贝莱斯芽孢杆菌AM6的发酵代谢物产量较高，其发酵代谢物的产量约0.3g/L，表面张力29.80mN/m，具备优良的乳化性能。
(3)贝莱斯芽孢杆菌AM6具备广泛的抗菌活性，不仅能抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等病原菌，而且还具有抗病毒、抗支原体、抗原虫等活性，是潜在的抗生素理想替代品之一。
(4)贝莱斯芽孢杆菌AM6及其菌剂可用于食品抗菌组合物以提升食品口感、外观、保质期等品质；也可用于饲料抗性抗菌组合物以辅助和促进动物对饲料的消化吸收，提升饲料的转化利用率；还可用于植物及作物抗菌组合物以预防烂根、植物枯萎病等病害，促进植物及作物的生长。
附图说明
图1为本发明实施例1贝莱斯芽孢杆菌AM6菌落形态；
图2为本发明实施例2贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株发酵液显微镜观察结果；
图3为本发明实施例2贝莱斯芽孢杆菌AM6发酵液产芽孢情况；
图4为本发明实施例4贝莱斯芽孢杆菌AM6在不同pH条件下的生长曲线；
图5为本发明实施例4贝莱斯芽孢杆菌AM6在不同盐度下的生长曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明从土壤中分离到一株芽孢杆菌AM6，被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis。贝莱斯芽孢杆菌AM6的营养要求简单，生长温度范围30～50℃，生长pH范围5.0～9.0。贝莱斯芽孢杆菌AM6高产表面活性素，不仅能抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等病原菌，而且还具有抗病毒、抗支原体、抗原虫等活性，具备广泛的抗菌活性，是潜在的抗生素理想替代品之一。贝莱斯芽孢杆菌AM6芽孢成孢率高，成孢条件易于控制，有利于其实际应用。
具体地，根据本发明的一些实施例，提供了一种贝莱斯芽孢杆菌AM6(Bacillusvelezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21320。
根据本发明的一些实施例，还提供了一种菌剂，其为由上述贝莱斯芽孢杆菌AM6经发酵培养得到。
在一些实施例中，该菌剂为液体菌剂，该液体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌AM6活菌数为70～100亿个/毫升。
在一些实施例中，该菌剂为固体菌剂，固体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌AM6活菌数为10～50亿个/克。
根据本发明的一些实施例，还提供了一种上述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌AM6接种LB1培养平板上，于37℃培养12h；将所述LB1培养平板的菌落转移至LB1液体培养基，于37℃培养12h得到种子液；将种子液以1％体积比接种LB1液体培养基，于37℃进行发酵培养30h，得到发酵液以作为液体菌剂，发酵培养的通风量为500～1000m3/h，罐压为0.04Mpa，转速为80rpm。
在一些实施例中，该制备方法还包括将该发酵液离心得到菌体，在菌体中加入质量浓度为5％的脱脂乳作为保护剂，在进风温度90～100℃条件下进行喷雾干燥，得到固体菌剂。
在一些实施例中，在发酵培养中使贝莱斯芽孢杆菌AM6的成孢率大于80％。
根据本发明的一些实施例，还提供了一种上述贝莱斯芽孢杆菌AM6和/或上述菌剂在制备食品抗菌组合物、饲料抗性抗菌组合物和植物及作物用抗菌组合物中的应用。
以下列举多个具体实施例来对本发明的技术方案作详细说明。需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。下文中的百分比若无特殊说明，一般是指质量百分比。
本发明各实施例所用原料如下：
LB1液体培养基：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g、硫酸镁1.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.3～7.5，121℃高压灭菌30分钟。
LB1培养平板：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g、硫酸镁1.0g，琼脂糖1.5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.3～7.5，121℃高压灭菌30分钟。
实施例1
贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株的筛选、鉴定
1.1分离纯化
(1)将5g采集的盐碱地环境样品接种于灭菌的以原油为唯一碳源的无机盐培养基中，37℃、180rpm摇瓶培养7d；
(2)按10％的接种率转移至新鲜无菌的以原油为唯一碳源的无机盐培养基中，重复3次；
(3)将富集培养物按梯度稀释，并将梯度为105、106、107的稀释液涂布于LB平板上，挑选单菌在LB平板上进行划线纯化；
(4)划线分离的单菌继续进行纯化，直至在平板上形成由单一菌株组成的菌落。
1.2分子生物学鉴定
(1)对贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株进行革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性；形态学特征为菌落乳白色不透明，边缘不规则，且明显凸起，质地粘稠(图1)。
(2)对贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株进行16S rRNA序列鉴定，采用TIANamp BacteriaDNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，China)提取AM6菌株的16S rRNA作为PCR扩增的模板，PCR扩增的引物为27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R(5’-TAC GGCTAC CTT GTT ACG ACT T-3’)；PCR反应体系为15μl 2 X EasyTaq SuperMix，2μl模板DNA，1μl 27F引物，1μl 1492R引物，补充ddH2O至30μl；PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，72℃最后延伸7min，最后保存于4℃。扩增后的基因序列在NCBI数据库中进行同源性比对分析，鉴定该菌株属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。
该贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株已于2020年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21320。
实施例2
贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株菌剂的制备
(1)取一管贝莱斯芽孢杆菌AM6的保藏菌种，接种在LB1培养平板上，置于生化培养箱37℃孵育12h。无菌转移菌落至LB1液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h得到种子液，显微镜观察菌体呈短棒状(图2)。
(2)将步骤(1)得到的贝莱斯芽孢杆菌AM6种子液按1％(体积比)接种于大量LB1液体培养基，37℃进行发酵培养，通风量为500～1000m3/h，罐压0.04Mpa，转速80rpm，培养时间30h。
(3)发酵完成后得到贝莱斯芽孢杆菌AM6发酵液，其中采用平板计数法对发酵液中的活菌数进行测定，结果显示活菌数可1×1010个/mL，一定比例的菌体出现芽孢(图2)。
(4)步骤(3)得到的贝莱斯芽孢杆菌AM6发酵液离心获得菌体，菌体中加入5％(质量比)的脱脂乳，进风温度90～100℃条件下进行喷雾干燥，制备获得贝莱斯芽孢杆菌AM6固体菌剂产品，其中活菌数可达50亿/克。
步骤(3)所得发酵液的成孢率测定方法如下：
对发酵菌液进行稀释，取一滴稀释后的发酵菌液置于25×16的细菌计数板上，通过火焰加热使其固定，利用芽孢染色剂(Solarbio，China)对其进行染色，干后用油镜进行观察。在显微镜下对100个计数方格中被染成红色的芽孢进行计数。成孢率的计算公式如下，结果显示成孢率大于80％：
Figure BDA0003013669440000061
成孢率的计算公式为：
Figure BDA0003013669440000062
代谢产物测定方法如下：
①发酵菌液在4℃下12500×g离心10min，取上清液，将上清液用乙腈/水(8/2)稀释200倍，再将其注射进LC-MS/MS(SHIMADZU LCMS-8050，Japan)，使用Shim-pack GIST C18色谱柱(2.1×100mm，2μm，SHIMADZU，Japan)进行测定分析。流动相选用20％水(含0.1％甲酸)及80％乙腈，流速为0.3mL/min，测定m/z为1016.6、1030.6、1044.6、1058.6、1072.6的离子碎片强度。
②产量计算方法：
取表面活性素标准品以乙腈/水(8/2)配制一系列浓度梯度的标准液，利用LC-MS/MS检测不同浓度标准品中特征离子碎片的峰强度，根据其总峰面积与对应的浓度绘制标准曲线，即可通过目标物的总峰面积得知AM6的产量，结果显示发酵液中发酵代谢物的产量约0.3g/L。
实施例3
贝莱斯芽孢杆菌AM6的抑菌作用
测定方法：采用牛津杯法测定贝莱斯芽孢杆菌AM6发酵液(培养20h)对沙门氏菌、灰霉病菌、软腐病菌的体外抑菌效果。其中利用LB1培养基培养沙门氏菌，培养条件37℃，24小时。利用PDA培养基培养灰霉病菌、软腐病菌，培养条件28℃，48小时。
实验结果如表1所示，从表1可以看出，贝莱斯芽孢杆菌AM6对于沙门氏细菌，灰霉病菌、软腐病菌，真菌都有较强的抑制作用。贝莱斯芽孢杆菌AM6在其生长繁殖过程中能够产生表面活性素，作为一类抗菌脂肽，能够有效抑制各类病原菌。
表1
Figure BDA0003013669440000071
实施例4
贝莱斯芽孢杆菌AM6的耐盐碱测试
(1)按2％的接种量将AM6菌株在pH分别为6、7、8、9的LB培养基中培养，每隔一定时间取菌液，通过紫外分光光度计方法测定菌液在波长为600nm处的吸光度，以表征培养基中的菌体浓度。如图4所示，结果表明AM6在pH＝8、pH＝9的培养基中生长速度较慢，但菌体浓度较高，说明AM6能在碱性环境下生长良好。
(2)按2％的接种量将AM6菌株在盐度分别为100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L的LB培养基中培养，每隔一定时间取菌液，通过紫外分光光度计方法测定菌液在波长为600nm处的吸光度，以表征培养基中的菌体浓度。如图5所示，结果表明AM6在最高盐度为150g/L的培养基中生长速度较慢，但是也能达到较高的OD600值。150g/L盐度远大于海水的盐度，说明AM6具有良好的耐盐性能。
基于上述实施例可知，贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株菌剂可以应用于以下抗菌组合物中：
(1)食品抗菌组合物，食品制品中添加贝莱斯芽孢杆菌AM6菌株过程中的代谢产物作为食品添加剂或者食品成分进而形成食品抗菌组合物。贝莱斯芽孢杆菌AM6所产表面活性素能改善食品成分构相间的关系，提升食品口感、外观等品质；具有很好的抑制乳杆菌、沙门氏菌等生长的效果，提升食品的保质期。
(2)饲料抗性抗菌组合物，贝莱斯芽孢杆菌AM6作为饲料添加剂或者辅助饲料成分。特别的，饲料指畜禽养殖饲料、水产品养殖饲料。贝莱斯芽孢杆菌AM6活性强，通过“生物夺氧”促进动物肠道厌氧益生菌的增殖，其水解酶的产生辅助和促进动物消化吸收，提高饲料的转化利用率。
(3)植物及作物用抗菌组合物，贝莱斯芽孢杆菌AM6对于灰霉病菌、软腐病菌等具有强烈的抑制作用，贝莱斯芽孢杆菌AM6菌剂通过种子拌施、灌根、叶面喷洒等方式使用，具有针对烂根、植物枯萎病等良好的预防效果，同时能促进植物的生长。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003013669530000011

Claims (8)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌AM6(Bacillus velezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21320。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂为由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌AM6经发酵培养得到。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌AM6活菌数为70～100亿个/毫升。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌AM6活菌数为10～50亿个/克。
5.一种权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将贝莱斯芽孢杆菌AM6接种LB1培养平板上，于37℃培养12h；
将所述LB1培养平板的菌落转移至LB1液体培养基，于37℃培养12h得到种子液；
将所述种子液以1％体积比接种LB1液体培养基，于37℃进行发酵培养30h，得到发酵液以作为液体菌剂，所述发酵培养的通风量为500～1000m3/h，罐压为0.04Mpa，转速为80rpm。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述发酵液离心得到菌体，在所述菌体中加入质量浓度为5％的脱脂乳，于进风温度90～100℃条件下进行喷雾干燥，得到固体菌剂。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在发酵培养中，使所述贝莱斯芽孢杆菌AM6的成孢率大于80％。
8.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌AM6和/或权利要求2至4中任一项所述的菌剂在制备食品抗菌组合物、饲料抗性抗菌组合物和植物及作物用抗菌组合物中的应用。
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