CN111171087A

CN111171087A - 一种高纯度西红花苷i的提纯方法和应用

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Publication number: CN111171087A
Application number: CN202010095365.2A
Authority: CN
Inventors: 雷英杰; 冯雨萱; 孙永跃
Original assignee: Tianjin University of Technology
Current assignee: Tianjin University of Technology
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-02-17
Also published as: CN111171087B

Abstract

本发明涉及一种高纯度西红花苷I的提纯方法，步骤如下：⑴西红花苷I的提取；⑵化学接枝改性；⑶洗脱液的配制；⑷装柱与上样：称取硅胶，湿法装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱；采用干法上样，于旋转蒸发仪中将硅胶与西红花苷I浸膏充分融合、干燥、混合均匀；硅胶：西红花原料的质量比为200～300：5～10；⑸洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液梯度洗脱，收集洗脱液，由胶束毛细管电色谱法检测目标产物；⑹将收集到的目标产物旋蒸浓缩，冷冻干燥至粉末状，即得高纯度西红花苷I。本方法工艺步骤较为简单易行，时间短，所得产品纯度较高，比较适宜投入到工业化生产中。

Description

一种高纯度西红花苷I的提纯方法和应用

技术领域

本发明属于提取技术领域，尤其是一种高纯度西红花苷I的提纯方法和应用。

背景技术

西红花，又名藏红花、番红花，为鸢尾科(Iridaceae)番红花属(crocus)植物番红花的干燥柱头。目前从西红花中分离得到的化合物至少已达到54种，主要可分为四萜类、二萜类(以西红花苷类化合物为代表)、单萜类(以西红花苦苷和藏花醛为代表)、异佛尔酮类、黄酮类(以山奈酚苷类化合物为代表)以及少量的其他类化合物。西红花苷是一种食用黄色素、香料、着色剂，具有耐热、耐光等特点，是一种天然色素。西红花苷易溶于热水，成为橙色溶液，微溶于无水乙醇、乙醚及其他有机溶剂，不溶于油脂。西红花苷包括西红花苷I、西红花苷II、西红花苷III、西红花苷IV等，其中以西红花苷I和西红花苷II的含量最高。

工业生产西红花苷I主要以制备液相的工艺为主。此工艺虽然纯度高，但是过程繁琐，且制备量少，难以满足现在的市场需求，西红花资源并不能得到很好的利用。目前关于西红花苷I的硅胶柱层析工艺大多是以等度洗脱，且洗脱液中均加入了不易干的水相，增加了过柱子的难度。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种高纯度西红花苷I的提纯方法和应用，该方法工艺步骤较为简单易行，时间短，所得产品纯度较高，比较适宜投入到工业化生产中。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高纯度西红花苷I的提纯方法，步骤如下：

⑴西红花苷I的提取：

精密称取研磨至粉末状的西红花原料，加入50％甲醇溶液，西红花原料：50％甲醇溶液的比例g：L为5～10：1～2，40℃超声提取30min，超声功率为33kHz，滤液采用0.22μm微孔滤膜过滤，得西红花苷I粗液，于4℃冰箱中保存备用；

⑵化学接枝改性：用亲电取代法制备带有氯甲基的大孔树脂DDM-1，大孔树脂DDM-1在40℃真空下干燥，用甲醇溶胀24小时，并在装有机械搅拌器、回流冷凝器和温度计的三颈圆底烧瓶中与过量的三亚乙基四胺混合，将混合物在40℃下保持9小时，通过胺化反应合成具有氨基的树脂；然后滤出树脂并用蒸馏水洗涤，直到没有白色沉淀，同时向滤液中加入硝酸银水溶液；在合成过程中，通过改变反应时间和DDM-1相对于胺化剂三亚乙基四胺的比例，可以得到不同氨基数的大孔树脂DDM-2；再由大孔树脂DDM-2对步骤⑴制得的西红花苷I粗液进行动态吸附，吸附平衡后由60％乙醇洗脱，收集洗脱液，由胶束毛细管电色谱法检测；将收集到的产品浓缩至浸膏状，得西红花苷I浸膏，于4℃冰箱中保存备用；

⑶洗脱液的配制：配置洗脱液A：纯氯仿，洗脱液B：体积比为1：9的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液C：体积比为2：8的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液D：体积比为3：7的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液E：体积比为4：6的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液F：体积比为5：5的甲醇和氯仿的混合液；

⑷装柱与上样：称取硅胶，湿法装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱；采用干法上样，于旋转蒸发仪中将硅胶与西红花苷I浸膏充分融合、干燥、混合均匀；硅胶：西红花原料的质量比为200～300：5～10；

⑸洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液梯度洗脱，收集洗脱液，由胶束毛细管电色谱法检测目标产物；

⑹将收集到的目标产物旋蒸浓缩，冷冻干燥至粉末状，即得高纯度西红花苷I。

而且，所述步骤⑴中西红花苷I粗液中西红花苷I的浓度为10～20mg/mL。

而且，所述步骤⑵中大孔吸附树脂使用前于95％乙醇中浸泡24h。

而且，所述步骤⑵中，当引入N-甲基咪唑修饰大孔吸附树脂，即接枝大环结构氨基聚合物后，改性后树脂对黄酮类的吸附性能是其他吸附剂的3倍以上，吸附容量达0.68mmol/g。

而且，所述步骤⑷中硅胶目数为200～300目，过大或过小均可影响结果。

而且，所述步骤⑸中胶束毛细管电色谱法中电解质溶液为20mmM磷酸二钠，5mM硼砂，100mMSDS，调节pH为9.5。

而且，所述步骤⑸中由胶束毛细管电色谱法得到的目标产物还经过如下处理：

由HPLC再次确认目标峰，HPLC的液相条件为：色谱柱Diamonsil·C₁₈ 4.6mm×250mm5μm；流动相：甲醇：水＝50:50；流速：1mL/min；检测波长：440mn。

如上所述的高纯度西红花苷I的提纯方法在西红花苷I制备方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明旨在解决市面上高纯度西红花苷I稀缺且价格昂贵的问题。本发明方法建立了从现有的西红花原料粉碎后制备成供试品溶液，经过大孔吸附树脂的化学接枝改性，大孔吸附树脂初步纯化、硅胶柱层析等技术，由胶束毛细管电色谱法与液相色谱共同监测，最后冷冻干燥得到纯度为98.51％的高纯度西红花苷I。本发明方法工艺步骤较为简单易行，时间短，所得产品纯度较高，比较适宜投入到工业化生产中。

2、本发明方法首先建立了一种联合大孔吸附树脂硅胶柱层析方法将西红花原料提纯到较高98.5％以上的纯度，并且得到较高的收率。并在最优的条件下实现工艺放大研究，可用于大批量西红花苷I的制备。

附图说明

图1为本发明中西红花粗提液的TLC点板图，因西红花苷I的紫外检测波长为440nm，所以可在光下检视；层析液为甲醇：氯仿＝1:1，由点板图可以观察到，西红花苷主要分成了两部分，跑在前端的为西红花苷II，后面的为西红花苷I，且Rf值在0.3-0.5之间，所以可以用硅胶柱层析梯度洗脱，且梯度洗脱下可以得到更高纯度的西红花苷I；

图2为本发明中西红花苷I的标准曲线，检视方法为高效液相色谱测定溶液中西红花苷I浓度，拟合的回归曲线方程为y＝8.94×10⁷x-3.42×10⁶,R²＝0.9917，由此标准曲线结合液相色谱图及峰面积可以计算西红花苷I的纯度及收率；

图3为本发明中西红花苷I分离纯化后的液相色谱图，高效液相色谱检视条件为：色谱柱Diamonsil·C₁₈(4.6nm×250mm,5μm)；流动相甲醇-水(50:50)；流速为1.0ml/min；柱温35℃；进样量15μL；

图4为本发明中西红花粗品分离纯化前的高效液相色谱图，高效液相色谱检视条件为：色谱柱Diamonsil·C₁₈(4.6nm×250mm,5μm)；流动相甲醇-水(50:50)；流速为1.0ml/min；柱温35℃；进样量15μL；

二者比较可以看出本发明方法确实可以很大程度上实现西红花苷I和西红花苷II的分离，且分离后的西红花苷I纯度较高可达98.51％，实现了西红花苷I的纯化；

图5为本发明中利用MALDI-TOF对纯化的西红花苷I的分子量进行检测，提示分子量为976，由元素分析确定分子式为C₄₄H₆₄O₂₄(C：54.07％,H：6.51％)，质谱分析可以确定纯化得到的产品为西红花苷I。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种高纯度西红花苷I的提纯方法，包括以下步骤：

(1)西红花苷I的提取结合检测灵敏的胶束毛细管电色谱法，采用甲醇-水体系，超声提取西红花苷。通过回归正交设计优化超声提取工艺，最终确定以50％甲醇40℃超声提取西红花苷I 30min，超声功率为33kHz。

供试品溶液的制备：精密称取研磨至粉末状的西红花原料6g，加入50％甲醇溶液1.2L，40℃超声提取30min，滤液采用0.22μm微孔滤膜过滤，于4℃冰箱中保存备用。

(2)化学接枝改性：用亲电取代法制备带有氯甲基的大孔树脂(DDM-1)，DDM-1大孔树脂在40℃真空下干燥，用甲醇溶胀24小时，并在装有机械搅拌器、回流冷凝器和温度计的500mL三颈圆底烧瓶中与过量的三亚乙基四胺混合。将混合物在40℃下保持9小时，通过胺化反应合成具有氨基的树脂。然后滤出树脂并用蒸馏水洗涤，直到没有白色沉淀，同时向滤液中加入硝酸银水溶液。再由此型号树脂对供试品溶液进行动态吸附，吸附平衡后由300mL60％乙醇洗脱，收集洗脱液，由胶束毛细管电色谱法检测。此种方式可吸附西红花粗提液中的部分杂质，如黄酮类、生物碱类、糖类、酚类等。将收集到的产品浓缩至浸膏状，于4℃冰箱中保存备用。

(3)洗脱液的配制：配置2L洗脱液A：(氯仿)，0.5L洗脱液B：(甲醇：氯仿＝1：9)，0.5L洗脱液C：(甲醇：氯仿＝2：8)，0.5L洗脱液D：(甲醇：氯仿＝3：7)，0.5L洗脱液E：(甲醇：氯仿＝4：6)，1L洗脱液F：(甲醇：氯仿＝5：5)。

(4)装柱与上样：称取硅胶200g，湿法装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱。采用干法上样，于旋转蒸发仪中将硅胶与样品充分融合、干燥、混合均匀。

(5)洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液梯度洗脱，收集洗脱液，由胶束毛细管电色谱法检测目标产物。

(6)将收集到的目标产物旋蒸浓缩，冷冻干燥至粉末状。

实施实例2

一种高纯度西红花苷I的提纯方法，包括以下步骤：

(1)西红花苷I的提取：结合检测灵敏的胶束毛细管电色谱法，采用甲醇-水体系，超声提取西红花苷。通过回归正交设计优化超声提取工艺，最终确定以50％甲醇40℃超声提取西红花苷I 30min，超声功率为33kHz。

供试品溶液的制备：精密称取研磨至粉末状的西红花原料8g，加入50％甲醇溶液1.5L，40℃超声提取30min，滤液采用0.22μm微孔滤膜过滤，于4℃冰箱中保存备用。

(2)化学接枝改性：用亲电取代法制备带有氯甲基的大孔树脂(DDM-1)，DDM-1大孔树脂在40℃真空下干燥，用甲醇溶胀24小时，并在装有机械搅拌器、回流冷凝器和温度计的500mL三颈圆底烧瓶中与过量的三亚乙基四胺混合。将混合物在40℃下保持9小时，通过胺化反应合成具有氨基的树脂。然后滤出树脂并用蒸馏水洗涤，直到没有白色沉淀，同时向滤液中加入硝酸银水溶液。再由此型号树脂对供试品溶液进行动态吸附，吸附平衡后由500mL60％乙醇洗脱，收集洗脱液，由胶束毛细管电色谱法检测。此种方式可吸附西红花粗提液中的部分杂质，如黄酮类、生物碱类、糖类、酚类等。将收集到的产品浓缩至浸膏状，于4℃冰箱中保存备用。

(4)装柱与上样：称取硅胶250g，湿法装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱。采用干法上样，于旋转蒸发仪中将硅胶与样品充分融合、干燥、混合均匀。

(6)将收集到的目标产物旋蒸浓缩，冷冻干燥至粉末状。

本发明方法所制得的西红花苷I标准物质原料的主要性能指标如下：

①外观橙黄色固体；复溶后为橙色澄明液体，无浑浊现象。

②目标产物西红花苷I的液相纯度在98％以上，总工艺收率在60％以上。

表1本发明方法收集到的目标产物西红花苷I与杂质的纯度对比表(产品为两个平行)

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一种高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：步骤如下：

⑴西红花苷I的提取：

2.根据权利要求1所述的高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：所述步骤⑴中西红花苷I粗液中西红花苷I的浓度为10～20mg/mL。

3.根据权利要求1所述的高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：所述步骤⑵中大孔吸附树脂使用前于95％乙醇中浸泡24h。

4.根据权利要求1所述的高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：所述步骤⑵中，当引入N-甲基咪唑修饰大孔吸附树脂，即接枝大环结构氨基聚合物后，改性后树脂对黄酮类的吸附性能是其他吸附剂的3倍以上，吸附容量达0.68mmol/g。

5.根据权利要求1所述的高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：所述步骤⑷中硅胶目数为200～300目。

6.根据权利要求1所述的高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：所述步骤⑸中胶束毛细管电色谱法中电解质溶液为20mmM磷酸二钠，5mM硼砂，100mMSDS，调节pH为9.5。

7.根据权利要求1至6任一项所述的高纯度西红花苷I的提纯方法，其特征在于：所述步骤⑸中由胶束毛细管电色谱法得到的目标产物还经过如下处理：

由HPLC再次确认目标峰，HPLC的液相条件为：色谱柱Diamonsil·C₁₈ 4.6mm×250mm 5μm；流动相：甲醇：水＝50:50；流速：1mL/min；检测波长：440mn。

8.如权利要求1至7任一项所述的高纯度西红花苷I的提纯方法在西红花苷I制备方面中的应用。