CN113189221B - 一种基于石墨化碳spe柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法 - Google Patents

一种基于石墨化碳spe柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于果蔬及其制品质量安全检测领域，具体公开了一种基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，具体步骤如下：(1)以石墨化碳为填料制备展青霉素净化用石墨化碳SPE柱；(2)待测苹果汁直接过柱，用有机溶剂洗脱其吸附的展青霉素，得到净化液；(3)净化液经氮吹、复溶、过膜后用HPLC‑PDA检测得到苹果汁中展青霉素的含量。本发明利用石墨化碳填料对展青霉素的吸附作用设计净化柱，该净化柱的使用仅需上样、洗脱两步，省去了样品预处理、柱活化、淋洗的步骤，且净化效果好，提高了样品前处理效率，降低了检测成本。

Description

一种基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法
技术领域
本发明属于果蔬及其制品质量安全检测领域，特别涉及一种基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法。
背景技术
展青霉素(Patulin，PAT)又名展青霉毒素、棒曲霉素、珊瑚青霉毒素，是青霉属、曲霉属等多种真菌产生的一种次级代谢产物，普遍存在于各种霉变水果中，酸性条件下稳定，碱性条件下易分解，在苹果及其制品中污染率最高。2016年，宁波口岸检出一批进口苹果汁展青霉素超标。2020年，Pick’d Cloudy Apple Juice因检出展青霉素超标而被澳大利亚食品标准局紧急召回。摄入展青霉素污染的食物，轻者可使人肠胃不适、反胃和呕吐，严重的还会导致神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭，对免疫系统造成毒性损害。《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2017)中规定，苹果制品中展青霉素的限量标准为50μg/kg。
固相萃取柱(SPE柱)常用于展青霉素检测的样品前处理过程，已报道的相关净化柱有：MycoSep 228多功能净化柱、分子印迹柱、MAX固相萃取柱、PAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱等，这些净化柱都有一定的净化效果。MycoSep 228多功能净化柱和分子印迹柱成本较高，单只售价在100元左右，其他SPE柱净化步骤繁琐，样品前处理过程耗时较长。
李锋格等报道了一种特丁基二甲基硅烷(TBDMS)衍生气相色谱-质谱(GC-MS)联用法用以快速测定苹果汁中的展青霉素(文献《特丁基二甲基硅烷衍生化气相色谱-质谱联用法快速测定苹果汁中的棒曲霉素》)，操作步骤如下：(1)样品预处理；(2)石墨化碳/C18混合型固相萃取柱净化；(3)TBDMS衍生化；(4)GC-MS测定。本方法需要对待测苹果汁进行预处理及对待测试样进行TBDMS衍生化，操作步骤繁琐，且选用的石墨化碳/C18混合型SPE柱(500mg/500mg)使用前需要活化。C18是十八烷基键合硅胶，属于疏水性填料，通过活化使支链舒展开后对展青霉素具有一定的吸附作用，且整篇文献仅提到石墨化碳能够吸附色素，并未提到其能够吸附展青霉素。
公开号为CN110646524A的中国专利文献中公开了一种黄曲霉毒素M族专用净化柱及应用，该发明以石墨化碳和纳米四氧化三铁的混合物为填料制备净化柱，该净化柱可专用于净化及检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M族，净化柱制作方法简便、成本低廉，简化了操作流程，缩短了检测时间。该发明并未提到石墨化碳能够吸附除黄曲霉毒素M1和M2以外的其他真菌毒素。
发明内容
本发明提供了一种基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，该检测方法前处理时间短，操作流程简便，灵敏度、精密度、准确度均能达到国标法检测的要求。
具体采用的技术方案如下：
一种基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，包括以下步骤：
(1)以石墨化碳(PestiCarb)为填料制备展青霉素净化用石墨化碳SPE柱；
(2)待测苹果汁在重力作用下直接流经该SPE柱，后用有机溶剂洗脱其吸附的展青霉素，得到净化液；
(3)净化液经氮吹、复溶、过膜后用HPLC-PDA检测得到苹果汁中展青霉素的含量。
本发明利用石墨化碳填料对展青霉素的吸附作用，制备了一种展青霉素净化用石墨化碳SPE柱，进而开发了一种苹果汁中展青霉素快速检测方法。不同于C18等疏水性填料需要通过活化使支链舒展开后才对展青霉素具有一定的吸附作用，PestiCarb填料可直接用于吸附苹果汁中的展青霉素，即该石墨化碳SPE柱使用时不需要活化，苹果汁不需要进行预处理直接上样，且上样后不需淋洗，不经过淋洗操作在后续的洗脱步骤后也能够获得无色、澄清的净化液和色谱图上基线分离的目标峰。
步骤(1)中，所述的PestiCarb粒径为120～400目。
步骤(1)中，所述的PestiCarb的填充量为50～150mg，填料填充量对石墨化碳SPE柱的净化功能具有至关重要的作用，50～150mg的PestiCarb可以有效吸附住至少100ng的展青霉素，净化效果理想。
步骤(2)中，所述的待测苹果汁的上样体积为2～4mL，该上样体积可达到80％以上的回收率。
步骤(2)中，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈或甲醇，洗脱体积为4～8mL。
优选地，所述的PestiCarb的填充量为50mg，使用50mg的PestiCarb制备石墨化碳SPE柱，成本相对较低，柱容量能够满足展青霉素高残留(5mg/kg)的苹果汁样品的检测，回收率在80％左右；所述的待测苹果汁的上样体积为4mL，4mL上样能够满足检测灵敏度需求；所述的有机溶剂为二氯甲烷，使用二氯甲烷进行洗脱，得到的净化液无色、透明、澄清，获得的色谱图目标峰附近无杂质干扰，能够准确定量，且氮吹时二氯甲烷容易吹干，大大节省了前处理时间；所述的有机溶剂洗脱体积为6mL，6mL洗脱时展青霉素的平均回收率在80％以上，杂质较少，洗脱时间较短；以上参数协同作用，样品前处理时间短，操作流程简便，检测成本低，检测效果好，方法的灵敏度、精密度、准确度均能达到国标法检测的要求。
步骤(3)中，所述的净化液中加入20μL乙酸，氮吹至近干，再加入1.0mL 1％乙酸水溶液复溶，涡旋振荡，过0.22μm水相滤膜后进行HPLC-PDA检测。
优选地，步骤(2)中，所述的有机溶剂为二氯甲烷，步骤(3)中，氮吹温度为40℃，二氯甲烷的沸点为39℃，在高于且临近其沸点的温度条件下更有利于氮吹，但氮吹温度过高会降低重复性。
步骤(3)中，所述的HPLC-PDA检测条件为：
仪器型号：Waters 2695配PDA检测器(二极管阵列检测器)；
色谱柱：Agilent TC C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
柱温：40℃；
流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0～11min，95％A，11～11.2min，95％A～50％A，11.2～12min，50％A，12～12.2min，50％A～95％A，12.2～17min，95％A；
进样量：50μL；
检测波长：276nm；
流速：1.0mL/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明以石墨化碳SPE柱为净化柱，该净化柱柱容量大、制作方法简单、净化效果好，成本远低于MAX固相萃取柱、PAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱等，便于大规模生产，也可在实验室自行装填制备，具有极强的实际应用价值。
(2)本发明在石墨化碳SPE柱净化过程中既可以有效去除待测苹果汁样品中的色素，又可消除目标色谱峰附近的杂质干扰，不仅有利于目标物的准确定量，同时还利于色谱柱和高效液相色谱仪的使用。
(3)本发明开发的苹果汁中展青霉素快速检测方法，操作步骤简单，待测苹果汁不需进行预处理步骤，直接上样，石墨化碳SPE柱使用前不需要活化，上样后不需要淋洗，整个净化过程只需上样、洗脱两步，洗脱溶剂容易吹干，缩短了前处理时间。
(4)本发明开发的苹果汁中展青霉素快速检测方法，方法的灵敏度、精密度、准确度均能达到国标法检测的要求。
附图说明
图1为16种自制SPE柱对展青霉素的吸附率柱状图。
图2为不同有机溶剂洗脱对展青霉素的回收率柱状图。
图3为不同有机溶剂洗脱对展青霉素的净化效果色谱图，A为展青霉素标准溶液(100μg/L)，B为二氯甲烷洗脱液，C为乙酸乙酯洗脱液，D为乙腈洗脱液，E为甲醇洗脱液。
图4为不同体积二氯甲烷洗脱对展青霉素的回收率柱状图。
图5为待测苹果汁不同上样体积的展青霉素回收率柱状图。
图6为芬特乐(Fontana)苹果汁净化前后的表观图，A为净化前黄色透明的样品；B为净化后的无色澄清的样品。
图7为味全每日C苹果汁净化前后的色谱图比较，A为展青霉素和羟甲基糠醛(HMT)的混合标准溶液(100μg/L)，B为净化前的样品，C为净化前的加标样品(PAT加标浓度为50μg/kg)，D为净化后的样品，E为净化后的加标样品(PAT加标浓度为50μg/kg)。
具体实施方式
实施例1:石墨化碳SPE柱
1.填料筛选
针对16种常见Cleanert吸附剂(C18、Alumina-B、Alumina-N、Florisil、PSA、PestiCarb、NH2、Silica、Alumina-A、COOH、CN、Diol、PRS、SAX、SCX、PS)，各自称取150mg分别倒入底部装有下筛板的SPE柱空管中，在吸附剂上方装入上筛板，压紧，制备成16种SPE柱。
以展青霉素吸附率为指标筛选填料。取2mL展青霉素标准溶液(50μg/L)上样，直通式过柱，收集上述全部16种SPE柱的流出液，过0.22μm滤膜后进行HPLC-PDA检测。图1为16种自制SPE柱对展青霉素的吸附率柱状图。由图1可见，PestiCarb对展青霉素的吸附效果最好，流出液中未检测到展青霉素；Florisil、SCX略有吸附作用；其他吸附剂均无明显吸附效果。
2.填充量确定
为了降低填料成本，比较了PestiCarb不同用量对展青霉素的吸附效果。称取50mg、100mg、150mg的PestiCarb分别倒入底部装有下筛板的SPE柱空管中，在吸附剂上方装入上筛板，压紧，制备成3种不同规格的SPE柱。取2mL PAT标准溶液(50μg/L)上样，收集全部流出液，过0.22μm滤膜后进行HPLC-PDA检测。结果显示，所有流出液中均未检出展青霉素。50mg的PestiCarb就能有效吸附住100ng的展青霉素，可用于残留限量浓度的检测；另外，当20000ng展青霉素上样时，吸附率也能达到80％以上。因此，为节约成本、提高检测效率，本发明优选填料用量为50mg。
3.石墨化碳SPE柱的制备
(1)原料：
柱管：容量为3mL，内径为1cm，长度为5cm；材质为聚丙烯；
筛板：孔径为10μm的聚乙烯筛板；
填料：粒径为120～400目的PestiCarb；
填充量：50mg。
(2)制备：
在柱管出液端安装一片下筛板，将PestiCarb从柱管进液端装填入柱管内，再将上筛板安装入柱管内。其中，上筛板、下筛板与柱管过盈配合安装，压紧即得。
实施例2:净化参数设计
1.有机溶剂选择
准确吸取2mL加标苹果汁(PAT加标浓度为50μg/kg)，重力作用过实施例1制得的石墨化碳SPE柱，吹干。加入4mL不同的洗脱溶剂，重力作用洗脱，吹干，完全收集洗脱液于10mL塑料离心管中。洗脱液中加入20μL乙酸，于40℃氮吹至近干。准确加入1.0mL 1％乙酸水溶液复溶，涡旋振荡30s，过0.22μm滤膜后进行HPLC-PDA检测。
图2为不同有机溶剂洗脱对展青霉素的回收率柱状图。由图2可见，乙酸乙酯的回收率最高，二氯甲烷的回收率最低，但均在80％以上，均能满足HPLC检测需求。
图3为不同有机溶剂洗脱对展青霉素的净化效果色谱图。其中，A为展青霉素标准溶液(100μg/L)，B为二氯甲烷洗脱液，C为乙酸乙酯洗脱液，D为乙腈洗脱液，E为甲醇洗脱液。由图3可见，二氯甲烷对应的色谱图杂质最少，目标峰附近基线平整，无干扰。
观察不同有机溶剂洗脱后的净化液，发现，用二氯甲烷、乙腈洗脱，净化液呈无色；但用乙酸乙酯、甲醇洗脱，净化液呈黄色。说明苹果汁中的黄色色素被石墨化碳SPE柱吸附后，能够随展青霉素一起被乙酸乙酯、甲醇洗脱下来。而二氯甲烷、乙腈只洗脱石墨化碳SPE柱中吸附的展青霉素，不解吸色素，从而达到去除进样液中色素的目的。
比较洗脱溶剂的氮吹速度，二氯甲烷、乙酸乙酯的洗脱液更容易被氮气吹干，氮吹时间大约是乙腈、甲醇的二分之一。
综合考虑回收率、净化效果和样品前处理效率，本发明优选二氯甲烷用于洗脱石墨化碳SPE柱中吸附的展青霉素。
2.洗脱体积选择
准确吸取2mL加标苹果汁(PAT加标浓度为50μg/kg)，重力作用过实施例1制得的石墨化碳SPE柱，吹干。加入不同体积的二氯甲烷，重力作用洗脱，吹干，完全收集洗脱液于10mL塑料离心管中。洗脱液中加入20μL乙酸，40℃氮吹至近干。准确加入1.0mL 1％乙酸水溶液复溶，涡旋振荡30s，过0.22μm滤膜后进行HPLC-PDA检测。
图4为不同体积二氯甲烷洗脱对展青霉素的回收率柱状图。由图4可见，在4～8mL的洗脱体积范围下回收率均在80％以上，当洗脱体积从4mL增加至6mL，展青霉素的回收率有一定增加，但6mL洗脱的回收率几乎与8mL洗脱无差异。可能6mL二氯甲烷能够完全洗脱所有被石墨化碳SPE柱吸附的展青霉素，而回收缺失的展青霉素或许在上样时已随苹果汁中的其他杂质流失。鉴于8mL体积洗脱下来的杂质更多，洗脱时间更长，本发明优选6mL二氯甲烷用于展青霉素的洗脱。
3.上样体积选择
准确吸取不同体积的加标苹果汁(PAT加标浓度为50μg/kg)，重力作用过实施例1制得的石墨化碳SPE柱，吹干。加入6mL二氯甲烷，重力作用洗脱，吹干，完全收集洗脱液于10mL塑料离心管中。洗脱液中加入20μL乙酸，于40℃氮吹至近干。准确加入1.0mL 1％乙酸水溶液，涡旋振荡30s，过0.22μm滤膜后进行HPLC-PDA检测。
图5为不同上样体积的展青霉素回收率柱状图。由图5可见，苹果汁上样体积越大，展青霉素的回收率越低，6mL上样时回收率仅有65％。可能石墨化碳SPE柱对杂质和展青霉素的吸附存在竞争性，当过多的杂质占领了展青霉素的吸附位点，就会导致展青霉素吸附量减少，回收率下降。2～4mL的上样量回收率均能达到80％以上，满足HPLC检测的要求。2mL上样时回收率最高，但当加标浓度较低时，存在无法满足国标法检出限的可能，所以待测苹果汁的上样量优选为4mL。当苹果汁中展青霉素含量高达5mg/kg(远远超过残留限量50μg/kg)时，上样4mL，石墨化碳SPE柱仍能有效吸附住大部分的展青霉素，回收率保持在80％左右。
实施例3
准确吸取4mL苹果汁，重力作用过实施例1制得的石墨化碳SPE柱，吹干。加入6mL二氯甲烷，重力作用洗脱，吹干，完全收集洗脱液于10mL塑料离心管中。洗脱液中加入20μL乙酸，于40℃氮吹至近干。准确加入1.0mL 1％乙酸水溶液，涡旋振荡30s，过0.22μm水相滤膜后进行HPLC-PDA检测。
检测条件如下：
仪器型号：Waters 2695配PDA检测器(二极管阵列检测器)；
色谱柱：Agilent TC C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
柱温：40℃；
流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；
进样量：50μL；
检测波长：276nm；
流速：1.0mL/min。
表1流动相梯度洗脱程序
时间(min) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 1.0 95 5
11 1.0 95 5
11.2 1.0 50 50
12 1.0 50 50
12.2 1.0 95 5
17 1.0 95 5
对超市里常见品牌(瑞普达、芬特乐、味全每日C、意文、汇源、大湖、良食记)苹果汁按上述方法进行检测，均未检出展青霉素。PAT加标浓度为50μg/kg时，7种苹果汁用实施例1制得的石墨化碳SPE柱快速净化，净化时间均在10min左右，展青霉素回收率均在70％以上。
实施例4
采用实施例3中的方法检测芬特乐(Fontana)苹果汁样品。图6为芬特乐(Fontana)苹果汁净化前后的表观图。A为未净化的样品，B为净化后的样品。由图6可见，使用石墨化碳SPE柱净化后，苹果汁中的黄色色素被去除，进样液无色、透明、澄清，净化效果显著。
对比例1
通常，上样后淋洗可以除去一部分杂质。已报道的用于展青霉素SPE柱的淋洗溶剂有：水、1％乙酸水溶液、5mmol/L乙酸铵溶液、1％碳酸氢钠溶液等。用实施例1制得的石墨化碳SPE柱净化时，乙酸铵或碳酸氢钠溶液淋洗，会导致二氯甲烷洗脱液中出现黄色液滴，可能这两种溶剂改变了色素与吸附剂之间的作用力，使色素等杂质随目标物展青霉素被二氯甲烷洗脱下来，给仪器检测造成负担；当用水或1％乙酸水溶液淋洗时，虽然获得的进样液是无色的，但是淋洗过程没有显著去除色谱图上的杂质，而且还使一部分展青霉素流失而影响回收率；不采用淋洗步骤时，回收率相对较高，得到的进样液无色、澄清，且色谱图上的目标峰基线分离，可实现展青霉素的准确定量。
对比例2
MAX固相萃取柱、PAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱也是基于吸附、解吸原理制备的SPE柱。它们的价格远低于MycoSep 228多功能净化柱和分子印迹柱，在苹果汁展青霉素检测中使用更广泛。现将这3种净化柱与实施例1制得的石墨化碳SPE柱进行比较，见表2。使用实施例1制得的石墨化碳SPE柱净化，每支成本约为其他SPE柱的六分之一；操作相对简单，无需活化，无需淋洗；样品净化只需10min，前处理时间可缩短至少30min以上，节省时间成本，可达到快速检测的目的。
表2实施例1制得的石墨化碳SPE柱与3种市售SPE柱的使用比较
Figure BDA0003035519720000091
对比例3
采用实施例3中的方法检测味全每日C苹果汁样品。净化前后的色谱图如图7所示，其中，A为展青霉素和羟甲基糠醛(HMT)的混合标准溶液(100μg/L)，B为未净化的样品，C为未净化的加标样品(PAT加标浓度为50μg/kg)，D为净化后的样品，E为净化后的加标样品(PAT加标浓度为50μg/kg)。由图7可见，该样品未净化直接过膜后检测，展青霉素色谱峰被包裹在杂质中，无法定量。样品经石墨化碳SPE柱净化后，展青霉素目标峰位置及其附近的杂质被去除，而且在优化的仪器条件下，展青霉素与苹果汁中常见杂质羟甲基糠醛的色谱峰呈基线分离，分离度较高，基线平整，能够实现苹果汁中展青霉素的准确定量。

Claims (5)

1.一种基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以石墨化碳为填料制备展青霉素净化用石墨化碳SPE柱；
(2)待测苹果汁在重力作用下直接流经该SPE柱，后用有机溶剂洗脱其吸附的展青霉素，得到净化液；
(3)净化液经氮吹、复溶、过膜后用HPLC-PDA检测得到苹果汁中展青霉素的含量；
步骤(1)中，所述的石墨化碳的填充量为50～150mg；
步骤(2)中，所述的待测苹果汁的上样体积为2～4mL；所述的有机溶剂为二氯甲烷，洗脱体积为4～8mL；
步骤(3)中，所述的HPLC-PDA检测条件为：
色谱柱：Agilent TC C18柱；
流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0～11min，95％A，11～11.2min，95％A～50％A，11.2～12min，50％A，12～12.2min，50％A～95％A，12.2～17min，95％A。
2.根据权利要求1所述的基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的石墨化碳粒径为120～400目。
3.根据权利要求1所述的基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，其特征在于，所述的石墨化碳的填充量为50mg；所述的待测苹果汁的上样体积为4mL；所述的有机溶剂的洗脱体积为6mL。
4.根据权利要求1所述的基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的净化液中加入20μL乙酸，氮吹至近干，再加入1.0mL 1％乙酸水溶液复溶，涡旋振荡，过滤膜后进行HPLC-PDA检测。
5.根据权利要求1或4所述的基于石墨化碳SPE柱的苹果汁中展青霉素快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的有机溶剂为二氯甲烷，步骤(3)中，所述的氮吹温度为40℃。
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