CN111000974B - 一种兔奶活性小肽溶液及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兔奶活性小肽溶液及其提取方法和应用，所述兔奶活性小肽相对分子量范围为300~1000Da，总小肽含量不低于1.2mg/mL，本发明兔奶活性小肽具有生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，能促进皮肤及神经增长，利于上皮细胞的增生修复，可以明显改善创面肉芽组织情况，加快创面愈合速度，缩短愈合时间；并且分子量低，皮肤对其具有很好的吸收作用，能够快速合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损的皮肤得到填充和修复，减少疤痕的形成，因此，兔奶活性小肽溶液适用于各种难愈性创面的治疗。本发明采用低温提取，所制备的兔奶活性小肽溶液质量稳定，活性高，杂质少，临床应用安全、有效，具有良好的应用前景。

Description

一种兔奶活性小肽溶液及其提取方法和应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，尤其涉及一种兔奶活性小肽溶液及其提取方法和应用。
背景技术
难愈性创口主要是指由于严重创伤造成皮肤及软组织大面积缺损或慢性创口，具有创面面积大、深度深、慢性伤口细胞外基质重构、再上皮化受抑制以及长时间炎症反应等特征，伤口破溃感染，造成愈合困难，属于外科和骨外科治疗中经常遇到的问题。现有临床治疗外科感染的药物主要包括抗生素药物和中药。服用抗生素对剂量和疗程均有一定要求，服用时间不宜过长，副作用大。生肌膏是中医外科常用药，出自张山雷《疡科纲要》，具有生肌、敛疮功效，用于治疗创伤合并感染、压迫性溃疡、糖尿病、下肢静脉溃疡、烧烫伤等所致慢性创面疗效显著。但现有生肌膏大多组成复杂，药效物质基础不明确，质量不稳定，疗效不显著，且仅能针对某一类或相近的几类皮肤性病灶进行治疗，治疗范围较窄。
二十世纪末，科学家在破解基因秘密的同时，也对存在于生物体内的另一类奇妙物质产生极大的兴趣。这类物质就是生物活性多肽，或称功能肽。科学家已在人体中发现了100多种生物活性多肽，这些多肽具有传递生理信息，调节生理功能的作用。它们对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要。所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与多肽有关系（参考文献：李子军等，小牛血清去蛋白注射液治疗脑卒中的临床疗效观察[J].医学理论与实践，2007，20(5):504-505）。小肽药物不仅在抗肿瘤、抗病毒、抗菌和治疗心血管疾病等已取得较大进展，在其它很多领域也取得一些进展。比如发明专利201610020149.5公开了一种土鳖虫生物活性小肽组合物，可用于治疗色素斑，美白皮肤，减少色素生成。发明专利201510743772.9公开了一种增强免疫力的蚕蛹小肽有效部位组合物，可用于增强免疫力，抗疲劳，抗衰老。发明专利200810226320.3公开了一种水蛭活性小肽及其制备方法和用途，在治疗心脑血管疾病方面具有良好效果，在治疗缺血性脑中风疾病方面效果尤佳。发明专利201910891527.0公开了一种兔奶中活性成分免疫球蛋白A的提取方法，以期能抑制微生物在呼吸道上皮附着，减缓病毒繁殖的免疫屏障作用。一种合成肽 (TP508)肽能促进伤口血管的再生，加速皮肽深度伤口的愈合。但目前天然活性小肽用于难愈性创口鲜有报道。
近年来，国内外主要以动物奶为原料提取生产营养功能性食品较多，主要集中在母乳、山羊奶、绵羊奶、牛奶等奶源上，兔奶的研究资料极少。动物源不同，其奶液的成分不尽相同，临床功能目标将必有不同。国内外也有部分聚焦于兔奶中可提取免疫球蛋白、丁酰胆碱酯酶和药用活性蛋白，可用于人类特殊群体的免疫增强功能的医用健康食品、强力解毒药、免疫球蛋白制品的生产等。但至今关于兔奶中活性小肽的功能还未报道过。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的第一目的在于提供一种有效的、安全的兔奶活性小肽溶液；本发明的第二目的是提供该活性小肽溶液的提取方法及其用于治疗难愈性创面药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种兔奶活性小肽溶液，所述活性小肽的相对分子量范围为300~1000Da，总小肽含量不低于1.2mg/mL。
进一步，所述溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。
本发明的目的还在于提供了一种兔奶活性小肽溶液的制备方法，包括以下步骤：
（1）取新鲜兔奶依次经过盐沉、冷冻、融化、离心，收集离心后的上清液，备用；
（2）将步骤 (1) 所收集的上清液用超滤器截留分子量小于1KDa的组分，超滤的工作压力不高于0.1~0.2Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用；
（3）将步骤 (2) 所制备的浓缩液中加入抗氧化剂，即得到兔奶活性小肽溶液。
进一步，所述盐沉是向新鲜兔奶中加入等体积浓度为2~5％氯化钠水溶液搅拌混合均匀。
进一步，所述冷冻温度为-80~-20℃，冷冻时间为1.0-5.0h。
进一步，所述融化是在不超过 40℃的温度条件下缓缓融化。
进一步，所述离心速度为10000~15000rpm。
进一步，所述抗氧化剂为维生素C、植酸、乙二胺四乙酸二钠、异抗坏血酸或异抗坏血酸钠。所述抗氧化剂的加入量为浓缩液质量的1~2%。这样，能增强提取物的稳定性，使氨基酸和小分子肽不易聚合成高分子肽。
本发明的目的还在于提供上述兔奶活性小肽溶液在用于治疗难愈性创面药物中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供的兔奶活性小肽溶液中活性小肽的分子量较小，易吸收，具有稳定性良好、活性高、杂质少和临床应用安全有效性。同时还包括人体所需的生理物质（有机物质和无机物质），为伤口愈合提供了能量和营养物质。
2、本发明在兔奶活性小肽溶液的制备过程中，通过盐沉、冷冻、融化、离心、超滤、反渗透浓缩和添加抗氧化剂，实现兔奶中大分子蛋白和其它杂质的去除，尤其在浓缩过程中采用常温的反渗透浓缩技术，能很好的保留产品的生物活性，避免了生物活性成分受热破坏和不良杂质的产生，从而保证了产品的临床用药的安全性及疗效。制备方法简单，易操作，易工业化生产。
3、本发明提取的兔奶活性小肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，能促进皮肤及神经增长，利于上皮细胞的增生修复，可以明显改善创面肉芽组织情况，加快创面愈合速度，缩短愈合时间；兔奶活性小肽分子量低，皮肤对兔奶活性小肽具有很好的吸收作用，能够快速合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损的皮肤得到填充和修复，减少疤痕的形成。并且该活性小肽无药物不良反应，安全、有效的。因此，兔奶活性小肽溶液适用于各种难愈性创面的治疗，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一、一种兔奶活性小肽溶液及其提取方法
实施例 1
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含5％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-80℃以下条件下冻结1h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为15000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.1Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量2％的维生素C，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
实施例 2
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含2％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-20℃以下条件下冻结5h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为10000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.2Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量2％的维生素C，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
实施例 3
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含2.5％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-40℃以下条件下冻结3h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为13000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.15Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量3％的维生素C，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
实施例 4
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含4％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-50℃以下条件下冻结2.5h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为15000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.1Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量1.5％的植酸，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
实施例 5
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含5％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-80℃以下条件下冻结5h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为15000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.2Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量2％的乙二胺四乙酸二钠，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
实施例 6
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含5％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-50℃以下条件下冻结5h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为10000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.1Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量1％的异抗坏血酸，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
实施例 7
1）取新鲜兔奶，不断搅拌下加入等体积含5％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀；
2）盐沉反应结束后，将上述溶液置于-20℃以下条件下冻结5h，然后在不超过40℃的温度下缓缓融化；再将融化后的溶液在转速为15000转/分的高速离心机上离心，收集上层清液。
3）将所收集的上清液用中空纤维柱超滤器截流分子量小于为 1KDa的组分，工作压力不高于0.2Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用。
5）将得到的浓缩液中添加浓缩液质量1％的异抗坏血酸钠，即得兔奶活性小肽溶液。
经测定本实施例制备的兔奶小肽溶液包括30％有机物质以及余量为无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。其中，小肽的相对分子量为300~1000Da。
将实施例1~7制备的兔奶小肽采用 Folin-酚法（Folin-酚法是国家药品监督局国家药品标准中规定的测定小肽含量方法）测定小肽含量，具体包括以下步骤：
(1)碱性铜试液的制备
取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400mL使之溶解，作为甲液；
取酒石酸钾0.5g，加水50mL使其溶解；另取硫酸铜0.25g，加水30mL使其溶解，将两液混合作为乙液；
临用前，合并甲、乙两液，并加水至500mL。
(2)对照品溶液的制备
取牛血清白蛋白对照品（19.2mg/支装），称取15mg，加水50mL，制成每lmL含0.3mg牛血清白蛋白的溶液。
(3)标准曲线的制备及供试品的测定
精密量取对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL，分别置具塞试管中，各加水至1.0mL，再分别加入碱性铜试液1.0mL，摇匀，各加入福林酚试剂（取一定量福林试液中的贮备液，将其稀释至16倍，从而得到福林酚试剂）4.0mL，立即混匀。然后置于55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴10分钟，按照药典中分光光度法（中国药典2015年版二部附录）)的要求，在650nln波长处测定吸收度。以0号管作为空白，以对照品溶液浓度与相应的吸光度值计算回归方程。
精密量取一定量的供试品溶液，按照上述方法，自“加入碱性铜试液”起依法测定。通过回归方程计算小分子肽的含量，然后乘以稀释倍数，即得各样品的小肽含量。
(4)测定结果
Fulin-酚法测定小分子肽含量结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
* 为6次测定平均值
二、兔奶活性小肽的应用
兔奶活性小肽溶液治疗难愈性创面的临床情况
选用2019年5月~2019年11月某住院治疗的资料完整的患者10例，年龄在1岁-54岁，平均年龄27. 4岁。其中男性6名，女性4名。创面位于四肢（6例）、躯干（4例），为散在或密集的片状分布。
预处理：给予静脉应用抗生素预防感染；加强营养；纠正低蛋白血症和贫血，餐前血糖控制在8mmol / L左右。每个患者选定创面情况及面积相似的两处创面作为实验组和对照组，测量两处创面的面积大小。两处创面均用1: 1000新洁尔灭溶液及0.9%外用NaCl溶液冲洗、消毒创面，剪除已分离的表皮，清除表面渗出及坏死物质。如肉芽水肿明显，则用3%高渗盐水湿敷；如创面肉芽较老或明显高出皮面，则用手术刀片刮除肉芽至基质的纤维板。再次用1: 1000新洁尔灭溶液及外用生理盐水冲洗创面，然后用无菌纱布拭干。
实验组应用兔奶活性小肽溶液（实施例1）换药，对照组应用无菌凡士林油纱换药。常规清创消毒创面后，用兔奶活性小肽溶液注射液浸泡的无菌纱布覆盖实验组创面，占总体表面积（TBSA） 1%面积创面，使用200mg兔奶活性小肽溶液，其上再用无菌凡士林油纱覆盖（属于药物辅料，避免药物流失），无菌敷料包扎固定，每2日换药1次，直至创面愈合。对照组创面常规清创消毒后，用无菌凡士林油纱覆盖创面，外层用无菌敷料包扎固定，每2日换药1次，直至创面愈合。
实验组及对照组分别于第一次换药后4天、10天、16天、22天测量并记录创面愈合情况。于第一次换药后10天观察创面肉芽组织改善情况。
观察指标：a.—般资料：性别、年龄、试验部位、试验幵始时间：b.症状：疼痛感、疼痛持续时间；C.体征：创面颜色、渗出、肉芽及上皮生长情况；d.创面愈合程度记录：于每个观察日换药前测量创面大小；可采用透明小方格测量尺测量创面大小计算愈合率。按公式计算愈合率：创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。
①创面愈合时间（x±s)
对于同体性质、部位相似的难愈性创面，外用兔奶活性小肽溶液的实验组的创面愈合时间要早于无菌凡士林油纱的对照组。（见表1)
表1.实验组与对照组创面愈合时间比较
Figure DEST_PATH_IMAGE004
②创面回缩率（x±s)
两组各16例创面用药后不同时间(5天、10天、17天、24天）的创面回缩率[创面回缩率（％）=（用药前创面面积一用药后创面面积）/用药前创面面积×100%]。比较用药后5天，10天，17天，24天实验组与对照组创面回缩率有统计学差异(见表2)。
表2给药后不同时间实验组与对照组创面回缩率的比较
5天 10天 17天 24天
实验组 84.26±4.11 98.18±1.04 100 100
对照组 15.65±4.57 39.58±8.87 72.48±6.47 97.12
t数值 3.02 4.24 2.1 1.5
P数值 <0.01 <0.01 <0.05 <0.05
③肉芽改善情况
用药后10天的难愈创面肉芽情况与用药前的对比，判断是否有改善。改善：肉芽组织新鲜、有光泽，表面无明显分泌物，触之易出血；无改善：肉芽老化、水肿，分泌物较多，触之不易出血。结果显示：实验组用药后创面肉芽情况较对照组有明显改善，差异有显著性意义。
综上，本研究表明：(1)兔奶活性小肽溶液作为外用药应用于难愈性创面的治疗是安全、有效的，无药物不良反应。(2)兔奶活性小肽溶液外用于难愈性创面可以明显改善创面肉芽组织情况，加快创面愈合速度，缩短愈合时间。(3)兔奶活性小肽溶液适用于各种难愈性创面的治疗。说明本发明提取的兔奶活性小肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，能促进皮肤及神经增长，利于上皮细胞的增生修复，可以明显改善创面肉芽组织情况，加快创面愈合速度，缩短愈合时间；兔奶活性小肽分子量低，皮肤对兔奶活性小肽具有很好的吸收作用，能够快速合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损的皮肤得到填充和修复，减少疤痕的形成。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述活性小肽的相对分子量范围为300~1000Da，总小肽含量不低于1.2mg/mL；
所述兔奶活性小肽溶液采用以下方法制备：
（1）取新鲜兔奶依次经过盐沉、冷冻、融化、离心，收集离心后的上清液，备用；
（2）将步骤 (1) 所收集的上清液用超滤器截留分子量小于1KDa的组分，超滤的工作压力不高于0.1~0.2Mpa，然后将得到的超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液，备用；
（3）将步骤 (2) 所制备的浓缩液中加入抗氧化剂，即得到兔奶活性小肽溶液。
2.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述溶液包括30％有机物质以及余量的无机物质；所述有机物质中除有效成分活性小肽外，还包括寡糖、核酸衍生物、氨基酸、糖脂类、糖和类脂代谢的中间产物等，所述无机物质为电解质、微量的必需元素和水。
3.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述盐沉是向新鲜兔奶中加入等体积浓度为2~5％氯化钠水溶液搅拌混合均匀。
4.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述冷冻温度为-80~-20℃，冷冻时间为1.0~5.0h。
5.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述融化是在不超过40℃的温度条件下缓缓融化。
6.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述离心速度为10000~15000rpm。
7.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述抗氧化剂为维生素C、植酸、乙二胺四乙酸二钠、异抗坏血酸或异抗坏血酸钠。
8.根据权利要求1所述兔奶活性小肽溶液，其特征在于，所述抗氧化剂的加入量为浓缩液质量的1~2%。
9.如权利要求1或2所述兔奶活性小肽溶液在制备难愈性创面药物中的应用。
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