CN110951816A - 一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法 - Google Patents

一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法 Download PDF

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CN110951816A CN201911201587.1A CN201911201587A CN110951816A CN 110951816 A CN110951816 A CN 110951816A CN 201911201587 A CN201911201587 A CN 201911201587A CN 110951816 A CN110951816 A CN 110951816A
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钱春香
陈燕强
张旋
芮雅峰
张耀明
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Abstract

本发明提供一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，该方法包括以下步骤：1)分别将胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液；2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为20‑60nm的方解石。本发明采用的微生物方法，具有高效、环保等特点，并且能够根据需要调节方解石晶粒尺寸，形成的方解石矿物性质稳定，过程中可有效捕获利用二氧化碳，减缓温室效应。

Description

一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法
技术领域
本发明涉及一种调控基材性能的方法，尤其涉及一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法。
背景技术
生物矿化是指由生物体通过生物大分子的调控生成无机矿物的过程，与一般矿化最大区别在于有生物体细胞、代谢产物或有机基质的参与。微生物作为地球上数量最多、分布最广泛的生命形式，具有可诱导碳酸盐、磷酸盐、硫酸盐等矿物沉积的能力，因此微生物在生物矿化过程中扮演着重要的角色。生物矿化的过程与普通矿化最重要的不同在于通过有机大分子和无机物离子的界面作用，生成具有特殊的多级结构和组装方式的生物矿物。生物矿化过程与普通化学结晶过程的区别在于，普通化学结晶过程只经历晶体的成核、长大、晶面的外延生长，但生物矿化过程不仅要经历以上过程，而且在有机质的调控作用下，生物矿化的过程中有着其特殊的物理化学规律。在迄今发现的生物矿物中钙矿化体占据了近三分之二，其中碳酸钙作为分布最为广泛生物矿物，因其晶体容易表征且结构可在生物矿化过程中加以控制，常被作为典型的研究对象。目前，沉积碳酸钙的方法主要是化学法，包括碳化法、氯化钙法和苛性碱法等，这些方法合成出的碳酸钙颗粒尺寸较为单一，且工艺复杂，成本较高。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种成本低、效果显著、环境友好，不会产生二次污染，生态相容性好的微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法。
技术方案：本发明提供一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，该方法包括以下步骤：
1)分别将胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为20-60nm的方解石。
优选地，制得步骤(4)所述晶粒尺寸大小为40-60nm的方解石，所述步骤为：
1)为将光合细菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到光合细菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的光合细菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为40-60nm的方解石。
进一步地，制得步骤(4)所述晶粒尺寸大小为30-40nm的方解石，所述步骤为：
1)分别将胶质芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到胶质芽孢杆菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的胶质芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为30-40nm的方解石。
进一步地，制得步骤(4)所述晶粒尺寸大小为20-30nm的方解石，所述步骤为：
1)分别将巴氏芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为20-30nm的方解石。
优选地，步骤(1)所述的浓缩菌液的菌体浓度均为106～107个/mL。
优选地，所述胶质芽孢杆菌的培养基溶液为每升培养基含有蔗糖8～12g、Na2HPO4·12H2O 2～3g、MgSO4 0.4～0.6g、CaCO3 0.5～1.5g、KCl 0.1～0.2g、 (NH4)2SO40.4～0.6g；所述光合细菌的培养基溶液为每升培养基含有NH4Cl 1.0～1.5g、CH3COONa 3.0～4.0g、MgCl2 0.1～0.2g、CaCl2 0.1～0.2g、KH2PO4 0.5～0.6g、 K2HPO4 0.4～0.5g、酵母膏0.1～0.2g；所述巴氏芽孢杆菌的培养基溶液为每升培养基含有葡萄糖10～15g、酵母提取物0.1～0.2g、KH2PO4 0.5～0.6g、K2HPO4 0.4～0.5g、MgSO4 0.1～0.2g、CaCO3 2.0～2.5g、NaCl 0.1～0.2g、MnSO4 0.1～0.2g。
进一步地，所述胶质芽孢杆菌、光合细菌和巴氏芽孢杆菌分别接种于各自的培养基溶液后，控制pH为7～8，于30～35℃下振荡培养24h，分别得到胶质芽孢杆菌、光合细菌、巴氏芽孢杆菌的菌液。
优选地，步骤(2)所述的钙源、尿素、菌液的质量比为(1～2):(0.6～1.2): (96.8～98.4)。其中，所用的钙源与尿素均为分析纯的固体物质，即钙源与尿素均溶解在了菌液中。
进一步地，上述步骤(3)中所述钙源为氯化钙。
优选地，上述步骤(2)中所述静置为置于恒温恒湿的环境，温度为30～35℃，静置时间120～150小时。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：采用微生物诱导沉积矿化产物的方法，开创性的通过光合细菌、胶质芽孢杆菌捕获空气中的二氧化碳、转化为吐酸根离子，并以此作为碳源，与外加钙源反应生成具有胶凝特性的矿化产物方解石。巴氏芽孢杆菌通过酶化作用分解尿素作为碳源沉积矿化具有胶凝特性的产物方解石，同时通过巴氏芽孢杆菌酶化作用分解尿素作为碳源沉积矿化产物方解石，从而获得特征不同的矿化产物。本发明采用的微生物方法，具有高效、环保等特点，并且能够根据需要调节方解石晶粒尺寸，形成的方解石矿物性质稳定，过程中可有效捕获利用二氧化碳，减缓温室效应。
附图说明
图1不同微生物菌种条件下得到的沉淀物的XRD图谱。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
本发明所采用的菌有光合细菌、胶质芽孢杆菌和巴氏芽孢杆菌，胶质芽孢杆菌，购自于上海沪峥生物科技有限公司，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M2012406；光合细菌为光合细菌photosynthetic bacterium,购自于上海沪峥生物科技有限公司，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为 CCTCC No：M 2012224，保藏地址为中国武汉大学，保藏日期为2012年6月 12日；巴氏芽孢杆菌购自于上海沪峥生物科技有限公司，编号为ATCC11859。
本发明中所采用的钙源购自于上海源叶生物科技有限公司，纯度为AR，规格为500g/瓶；尿素购自于国药集团化学试剂有限公司，纯度为AR，规格为500g/ 瓶；对于其他试剂，NH4Cl及KH2PO4购自于上海凌峰化学试剂有限公司， CH3COONa购自于上海凛恩科技发展有限公司，CaCl2购自于国药集团化学试剂有限公司，MgCl2购自于上海麦克林生化科技有限公司，K2HPO4购自于上海源叶生物科技有限公司，酵母膏购自于萨恩化学技术(上海)有限公司。
实施例1
(1)将光合细菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有NH4Cl 1.0 g、CH3COONa 3.0g、MgCl2 0.1g、CaCl2 0.1g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.4g、酵母膏0.1g，并控制pH为7，于30℃下振荡培养24h，得到含有光合细菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为106个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为30℃，静置时间120小时，其中钙源、尿素、菌液的质量比为1:0.6:96.8；
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，获得光合细菌沉积矿化产物特征；测量并计算得到晶体尺寸。
关于晶体尺寸的计算方法如下：
首先样品需要做一下XRD测试，以获得样品XRD图谱和相应参数；其次根据X射线衍射理论，当样品晶粒尺寸小于100nm，随着晶粒尺寸的变小衍射峰宽化变得显著，样品晶粒尺寸可采用谢乐(Scherrer)公式进行计算：
Figure RE-GDA0002376918290000041
其中：
D：晶粒平均尺寸，
Figure RE-GDA0002376918290000042
k：系数，取0.89；
λ：实验所用衍射线波长，
Figure RE-GDA0002376918290000043
β1/2：选取衍射峰的半高宽，rad；
θ：选取衍射峰所对应的衍射角。
本实施例中，得到的碳酸钙晶粒尺寸约为40.1nm。
实施例2
(1)将光合细菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有NH4Cl 1.5g、CH3COONa 4.0g、MgCl2 0.2g、CaCl2 0.2g、KH2PO4 0.6g、K2HPO4 0.5g、酵母膏0.2g，并控制pH为8，于35℃下振荡培养24h，得到含有光合细菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为107个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为35℃，静置时间150小时；其中钙源、尿素、菌液的质量比为2:1.2:98.4
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，获得光合细菌沉积矿化产物特征，按照实施例1所述的方法测量并计算，得到的碳酸钙晶粒尺寸约为60.2nm。
实施例3
(1)将光合细菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有NH4Cl 1.3g、CH3COONa 3.5g、MgCl2 0.15g、CaCl2 0.15g、KH2PO4 0.55g、K2HPO4 0.45g、酵母膏0.15g，并控制pH为7.5，于32℃下振荡培养24h，得到含有光合细菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为106个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为32℃，静置时间130小时；其中钙源、尿素、菌液的质量比为1.5:0.8:97.7
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸约为52.3nm。
实施例4
(1)将胶质芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有蔗糖 8g、Na2HPO4·12H2O 2g、MgSO4 0.4g、CaCO3 0.5g、KCl 0.1g、(NH4)2SO4 0.4g，并控制pH为7，于30℃下振荡培养24h，得到含有胶质芽孢杆菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为106个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为30℃，静置时间120小时，其中钙源、尿素、菌液的质量比为1:0.6:96.8；
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，获得光合细菌沉积矿化产物特征，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸约为29.9nm。
实施例5
(1)将胶质芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有蔗糖 12g、Na2HPO4·12H2O 3g、MgSO4 0.6g、CaCO3 1.5g、KCl 0.2g、(NH4)2SO4 0.6g，并控制pH为8，于35℃下振荡培养24h，得到含有胶质芽孢杆菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为107个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为35℃，静置时间150小时；其中钙源、尿素、菌液的质量比为2:1.2:98.4
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，获得光合细菌沉积矿化产物特征，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸为40.3nm。
实施例6
(1)将胶质芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有蔗糖12g、Na2HPO4·12H2O 3g、MgSO4 0.6g、CaCO3 1.5g、KCl 0.2g、(NH4)2SO4 0.6g，并控制pH为7.5，于32℃下振荡培养24h，得到含有胶质芽孢杆菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为106个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为32℃，静置时间130小时；其中钙源、尿素、菌液的质量比为1.5:0.8:97.7
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸为35.1nm。
实施例7
(1)将巴氏芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有葡萄糖10g、酵母提取物0.1g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.4g、MgSO4 0.1g、CaCO3 2.0 g、NaCl 0.1g、MnSO40.1g，并控制pH为7，于30℃下振荡培养24h，得到含有巴氏芽孢杆菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为106个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为30℃，静置时间120小时，其中钙源、尿素、菌液的质量比为1:0.6:96.8；
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，获得光合细菌沉积矿化产物特征，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸约为19.8nm。
实施例8
(1)将巴氏芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有葡萄糖15g、酵母提取物0.2g、KH2PO4 0.6g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.2g、CaCO3 2.5g、 NaCl 0.2g、MnSO40.2g，并控制pH为8，于35℃下振荡培养24h，得到含有巴氏芽孢杆菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为107个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为35℃，静置时间150小时；其中钙源、尿素、菌液的质量比为2:1.2:98.4
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，获得光合细菌沉积矿化产物特征，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸约为29.8nm。
实施例9
(1)将巴氏芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基溶液，每升培养基含有葡萄糖 13g、酵母提取物0.15g、KH2PO4 0.55g、K2HPO4 0.45g、MgSO4 0.15g、CaCO3 2.0g、 NaCl 0.15g、MnSO4 0.15g，并控制pH为7.5，于32℃下振荡培养24h，得到含有巴氏芽孢杆菌的菌液，菌液中所含菌体浓度为106个/mL。
(2)将钙源、尿素分别加入上述微生物菌液中，置于恒温恒湿的环境，温度为32℃，静置时间130小时；其中钙源、尿素、菌液的质量比为1.5:0.8:97.7
(3)产生沉淀后，对沉淀物进行充分洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，按照实施例1所述的方法测量并计算，其得到的碳酸钙晶粒尺寸约为26.1nm。
实施例10
对实施例1～9中得到的数据进行分析统计，并对不同微生物菌种条件下得到的沉淀物绘制如图1所示的XRD图谱；图1表明，微生物合成的碳酸钙均为方解石。表1为对实施例1～9中的不同微生物诱导形成的方解石的点阵常数。
表1不同微生物诱导形成的方解石的点阵常数
Figure RE-GDA0002376918290000081
晶体尺寸描述的是多个晶胞堆在一起的尺寸，而晶格常数是对晶胞尺寸的描述，表中所反映的点阵常数以
Figure RE-GDA0002376918290000082
的尺度为标准计量晶胞尺寸的大小，从更为微观的角度反映出光合细菌、胶质芽孢杆菌和巴氏芽孢杆菌三种微生物诱导下，碳酸钙结晶过程不同，进而导致晶体尺寸不同。

Claims (10)

1.一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)分别将胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的胶质芽孢杆菌、光合细菌或巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为20-60nm的方解石。
2.根据权利要求1所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于，制得步骤(4)所述晶粒尺寸大小为40-60nm的方解石，所述步骤为：
1)为将光合细菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到光合细菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的光合细菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为40-60nm的方解石。
3.根据权利要求1所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于，制得步骤(4)所述晶粒尺寸大小为30-40nm的方解石，所述步骤为：
1)分别将胶质芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到胶质芽孢杆菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的胶质芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为30-40nm的方解石。
4.根据权利要求1所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于，制得步骤(4)所述晶粒尺寸大小为20-30nm的方解石，所述步骤为：
1)分别将巴氏芽孢杆菌的芽孢接种至相应的培养基中培养，分别得到巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液；
2)将钙源和尿素加入步骤(1)所述的巴氏芽孢杆菌的浓缩菌液中静置；
3)产生沉淀后，对沉淀物进行洗涤、过滤、烘干，烘干至恒重后进行晶粒尺寸分析，制得晶粒尺寸大小为20-30nm的方解石。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于：步骤(1)所述的浓缩菌液的菌体浓度均为106～107个/mL。
6.根据权利要求1所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于：所述胶质芽孢杆菌的培养基溶液为每升培养基含有蔗糖8～12g、Na2HPO4·12H2O 2～3g、MgSO4 0.4～0.6g、CaCO3 0.5～1.5g、KCl 0.1～0.2g、(NH4)2SO4 0.4～0.6g；所述光合细菌的培养基溶液为每升培养基含有NH4Cl1.0～1.5g、CH3COONa 3.0～4.0g、MgCl2 0.1～0.2g、CaCl2 0.1～0.2g、KH2PO4 0.5～0.6g、K2HPO4 0.4～0.5g、酵母膏0.1～0.2g；所述巴氏芽孢杆菌的培养基溶液为每升培养基含有葡萄糖10～15g、酵母提取物0.1～0.2g、KH2PO40.5～0.6g、K2HPO40.4～0.5g、MgSO4 0.1～0.2g、CaCO3 2.0～2.5g、NaCl 0.1～0.2g、MnSO40.1～0.2g。
7.根据权利要求6所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于：所述胶质芽孢杆菌、光合细菌和巴氏芽孢杆菌分别接种于各自的培养基溶液后，控制pH为7～8，于30～35℃下振荡培养24h，分别得到胶质芽孢杆菌、光合细菌、巴氏芽孢杆菌的菌液。
8.根据权利要求1～4任一所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于：步骤(2)所述的钙源、尿素、菌液的质量比为(1～2):(0.6～1.2):(96.8～98.4)。
9.根据权利要求1～4任一所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于：步骤(3)中所述钙源为氯化钙。
10.根据权利要求1～4任一所述的一种微生物诱导沉积方解石晶粒尺寸的调控方法，其特征在于：步骤(2)中所述静置为置于恒温恒湿的环境，温度为30～35℃，静置时间120～150小时。
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