CN110951810A - 一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，在对蛋白质进行提取之前先通过定向酶解的方式解构蛋白质外包裹的纤维素，而后选用适当的蛋白酶和酶解条件对蛋白质进行酶解，使得到的肽段中84.14％均为分子量不高于1000的易于被人体吸收的低聚肽，而且提取过程中产品清除自由基的性能、活性成分总黄酮和Γ氨基丁酸的含量也得到了最大程度的保留。

Description

一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺
技术领域
本发明属于医药和生物化工领域，特别涉及桑叶肽的提取工艺。
背景技术
桑叶是桑科植物桑的叶，性寒、味甘苦，含1％～3％黄酮化合物、丰富的γ-氨基丁酸、桑叶多糖、以及其它动、植物中所没有的生物碱DNJ(1-脱氧野尻霉素，其主要作用是抑制蔗糖酶、麦芽糖酶、a-葡萄糖苷糖、a-淀粉酶的分解，从而达到防治糖尿病的作用)。多喝桑叶茶有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，浙江大学临床药理研究所通过4年实验，证实桑叶具有类似人参的补益和抗衰老作用。人参属于热补，而桑叶属于清补，老幼均可使用，四季皆宜。其生物制剂亦有清除体内自由基、抗氧化、抗衰老、改善糖尿病、降血压、降血糖、预防心肌梗塞、美白祛斑等作用。且近年来，高活性生物蛋白正慢慢进入美容护肤领域，而目前市面上与桑叶有关的相关产品却不多，人们主要还是靠饮桑叶茶来获取其药用价值，但由于桑叶药性甘、苦、寒，因而寒性体质的人以及经期女性、妊娠期妇女不能喝桑叶茶，服用可能产生晦气反作用。
为了使其营养成分更利于人体消化吸收，产品形式也更多元化，可以用做固体饮料或口服液，以及功能性食品、化妆品面膜等添加剂，服用或使用更方便快捷，提高食用安全性，则需要改变桑叶的分子结构和产品形态。
而桑叶中的蛋白有纤维素等的包裹，提取困难，虽然通常预处理的过程中用粉碎等方式进行了一定程度的破除，仍较难将蛋白质提取出来。
此外，蛋白质分解后的肽段若分子量过大则依然不易吸收。
发明内容
为了破除纤维素对桑叶中蛋白质提取的障碍，并且将蛋白质分解成易吸收的低聚肽，本发明提供了一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原料选择：筛选无霉变腐败的新鲜桑叶或干桑叶；
S2.预处理：对原料粉碎，过60目筛，加入去离子水，高温80～100℃加热搅拌4～24h，使原料变性；
S3.一次酶解：用食品级酸调节pH，添加糖基水解酶，酶解时间为1～8h，而后进行灭酶操作；
S4.二次酶解：用食品级碱调节pH，添加蛋白酶，酶解时间为1～8h，结束后调节PH在5～7，而后进行灭酶操作；
S5.除杂：酶解结束后去除未酶解的颗粒以及不溶杂物，得到均一无沉淀的酶解液；
S6.浓缩：采用真空浓缩的方式，浓缩控制温度＜70℃，浓缩到原体积的0.7～0.2倍；
S7.除菌；
S8.干燥：喷雾干燥或冷冻干燥；
S9.包装及保存：用PE袋和铝箔袋，密封遮光保存，贮存于干燥、阴凉、通风良好的地方。
本发明所提供的提取工艺具有如下优势：
(1)在对桑叶原料进行预处理后首先用糖基酶对包裹蛋白质的纤维素等成分进行定向酶解，在不影响内部蛋白质的前提下破除了对蛋白质酶解提取的阻碍，大大提高了有效成分的提取率。
(2)本工艺改变了桑叶的分子结构和产品形态，经本工艺生产得到的桑叶低聚肽具有较好的稳定性，能完全溶解于水，经分子量检测，分子量主要分布在1000D以下，归属于寡肽，在人体内不需消化即可直接吸收。
(3)本工艺尽可能完整地保存产品的生物活性成分，极大程度上保留了产品的功效性(抗氧化能力)。
(4)经本工艺生产的产品形式也更多元化，可以用做固体饮料或口服液，以及功能性食品、化妆品面膜等添加，增加了桑叶的使用范围。
(5)本工艺生产的产品服用方便快捷，大大提高了食用安全性，尤其是二次酶解之后，过滤浓缩前，将pH调节至5～7，使产品符合食品的适当pH，且可以降低产品灰分。
附图说明
图1为肽段相对分子质量分布图。
图2为不同浓度桑叶肽溶液对应的DPPH自由基清除率柱状图。
具体实施方式
以下是本发明的非限定实施例，将有利于本领域的普通技术人员进一步理解本发明。
按照以下操作步骤提取高活性桑叶低聚肽粉：
S1.原料选择：筛选无霉变腐败的新鲜桑叶或干桑叶；
S2.预处理：对原料粉碎，过60目筛，按1:10～1:40的料液比加去离子水，高温80～100℃加热搅拌4～24h，使原料变性；
S3.一次酶解：用食品级盐酸或磷酸调节PH到4～7，升温到45～60℃，添加纤维素酶和/或多聚半乳糖醛酸酶，添加比例为桑叶干重的0.1％～5％，过程中维持PH及酶解温度，酶解时间为1～8h；结束后升温到90～95℃灭酶15min；
S4.二次酶解：用食品级氢氧化钠或氢氧化钙或氨水调PH到7～10，升温到45～70℃，添加枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的一种或多种的组合，添加比例为桑叶干重的0.1％～5％，过程中维持PH及酶解温度，酶解时间为1～8h，结束后调节PH至5～7，升温到90～95℃灭酶15min；
S5.除杂：酶解结束后用过滤或离心的方式，去除未酶解的颗粒以及不溶杂物，得到均一无沉淀的酶解液；离心则以2000～10000r/min的速度离心1～30min；若过滤可选用4～8层纱布或棉饼或100～200目的筛网或300～400目的滤纸或滤布，得到澄清溶液。
S6.浓缩：采用真空浓缩的方式，维持负压-0.07～-0.1MPa，控制温度＜70℃，浓缩到原体积的0.7～0.2倍；
S7.除菌：升温到100℃30min，或105℃20min杀菌，或0.22μm除菌滤芯过滤；
S8.干燥：喷雾干燥或冷冻干燥，喷雾干燥进风温度150～220℃，出风温度75～100℃，以﹣10℃～﹣50℃冷冻干燥时间为24～48h。
S9.包装：用PE袋和铝箔袋包装，密封遮光，贮存于干燥、阴凉、通风良好的地方。
下面是对制得的桑叶低聚肽样品各特性的测定方法及所得到的数据：
实验1.用液相色谱仪对桑叶肽进行分子量的测定
参考《GBT 22729海洋鱼低聚肽粉》中附录A“相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物所占比例(高效凝胶过滤色谱法)”对桑叶肽进行分子量测定。
测定方法概述：相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物(包括低聚肽和少量游离氨基酸)所占比例，采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子提及大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到蛋白质水解物的相对分子质量大小及分布范围，进而得到相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物(包括低聚肽和少量游离氨基酸)所占比例。
使用的仪器和设备有：高效液相色谱仪(配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪)、流动相真空抽滤脱气装置、超声波振荡器、分析天平(感量0.0001g)。
色谱条件如下：
色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱。
流动相：乙腈：水：三氟乙酸为45:55:0.1(体积比)
检测波长：UV220nm
流速：0.5mL/min
柱温：30℃
进样体积：10μL
为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰计算不低于5000，低聚肽的分配系数(Kd)应在0～1之间。
相对分子质量矫正曲线制作：
分别用流动相配置成0.1％(质量浓度)的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2μm～0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMr)对保留时间作图或作线形回归得到相对分子质量矫正曲线及其方程。
称取样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声震荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2μm～0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。
将样品溶液在上述色谱条件下分析，用GPC数据处理软件，即可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围(如图1)。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在1000u以下的蛋白质水解物的峰面积相对百分比之和。
计算得到各分子量范围占比如下表所示：
Figure BDA0002340464330000051
从上表中可知，分子量小于等于1000的肽段在提取到的所有肽段中占比高达84.14％。实验2.用DPPH法对桑叶肽进行清除自由基活性的测定数据，。
将1.5mL样品加入1.5mL 0.1mmol/L DPPH(95％乙醇)中，混匀并在25℃保温30min。在517nm处测量吸光度。VC溶液用作对照。DPPH·清除能力w(％)计算如下：
Figure BDA0002340464330000052
其中A0是1.5mL蒸馏水和1.5mL含0.1mmol/L DPPH的95％乙醇的吸光度值，A1是含有0.1mmol/L DPPH·的1.5mL水解产物的吸光度值，A2是1.5mL水解产物和1.5mL95％乙醇的吸光度值。
不同浓度样品的DPPH清除率如下表所示：
Figure BDA0002340464330000053
测定结果柱状对比图如图2，其中IC50(即清除50％的自由基所需要的桑叶肽用量)为0.019mg/mL，0.5120mg/mL的样品浓度就已经达到了79.48％的自由基清除率，证明该工艺生产的桑叶肽产品具有较高的抗氧化能力。
实验3.总黄酮含量检测
黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花青素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。总黄酮是产品中起到抗氧化和消除自由基功能的主要有效成分。总黄酮含量的检测方法参考《保健食品功效成分及卫生指标检验规范》附录中保健食品中总黄酮的测定。
绘制芦丁标准曲线：称取5.0mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得50μg/mL芦丁标准溶液。吸取芦丁标准溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。
试样处理：称取一定量的试样，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱，先用20mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL。此液于波长360nm测定吸收值。同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。
Figure BDA0002340464330000061
式中：
X—试样中总黄酮的含量，mg/100g；
A—由标准曲线算得被测液中黄酮量，μg；
M—试样质量，g；
V1—测定用试样体积，mL；
V2—试样定容总体积，mL。
经计算，总黄酮含量为1600ppm，远高于其它植物肽类产品含量。
实验4，用高效液相色谱测定Γ氨基丁酸(GABA)的含量
1.提取GABA：
0.5g桑叶粉+2mL甲醇，震荡10min，5000r/min离心15min，弃上清液；再加入少量甲醇，震荡10min，5000r/min离心15min，弃上清；待沉淀完全干燥后加5mL水，50℃水浴2h，5000r/min离心15min，取上清定容至20mL，得GABA提取液。
2.GABA含量的测定：
取1mLGABA提取液，加入50μL2mol/L的AlCl3溶液，震荡15min，12000r/min离心5min，取上清0.5mL加入300μL1mol/L的KOH溶液，震荡15min，12000r/min离心5min。分别取上清液300μL，加入0.1mol/L pH10.0的四硼酸钠缓冲液500μL、6％的重蒸酚400μL，混匀后加入600μL5％的NaClO溶液，充分混匀。沸水浴10min，立即冰浴5min，待溶液出现蓝绿色，加入2.0mL60％乙醇，于645nm波长处测定吸光值。
3.GABA含量计算：
Figure BDA0002340464330000071
其中y为645nm波长处测定吸光值；V为样品提取液的总体积；m为样品质量。
检测及计算结果为918ppm，在同类植物肽产品中含量相对较高。
本发明公开的一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，在对蛋白质进行提取之前先通过定向酶解的方式解构蛋白质外包裹的纤维素，而后选用适当的蛋白酶和酶解条件对蛋白质进行酶解，使得到的肽段中84.14％均为分子量不高于1000的易于被人体吸收的低聚肽，而且提取过程中产品清除自由基的性能、活性成分总黄酮和Γ氨基丁酸的含量也得到了最大程度的保留。

Claims (10)

1.一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原料选择：筛选无霉变腐败的新鲜桑叶或干桑叶；
S2.预处理：对原料粉碎，过60目筛，加入去离子水，高温80～100℃加热搅拌4～24h，使原料变性；
S3.一次酶解：用食品级酸调节pH，添加糖基水解酶，酶解时间为1～8h，而后进行灭酶操作；
S4.二次酶解：用食品级碱调节pH，添加蛋白酶，酶解时间为1～8h，结束后调节PH在5～7，而后进行灭酶操作；
S5.除杂：酶解结束后去除未酶解的颗粒以及不溶杂物，得到均一无沉淀的酶解液；
S6.浓缩：采用真空浓缩的方式，负压-0.07～-0.1MPa，浓缩控制温度＜70℃，浓缩到原体积的0.7～0.2倍；
S7.除菌；
S8.干燥：喷雾干燥或冷冻干燥；
S9.包装及保存：用PE袋和铝箔袋，密封遮光保存，贮存于干燥、阴凉、通风良好的地方。
2.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S3中所述食品级酸为食品级盐酸或磷酸；S4中所述食品级碱为食品级氢氧化钠、氢氧化钙、氨水中的一种。
3.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S2步骤中按料液比1:10～1:40加入去离子水。
4.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S3糖基水解酶为纤维素酶和/或多聚半乳糖醛酸酶，酶解前将pH调至4～7，酶解温度保持45～60℃，糖基水解酶添加比例为桑叶干重的0.1％～5％。
5.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S4蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的一种或几种的组合，酶解前将pH调至7～10，酶解温度保持45～70℃，蛋白酶添加比例为桑叶干重的0.1％～5％。
6.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S3及S4步骤中灭酶过程为将料液升温到90～95℃，维持15min。
7.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S3及S4酶解过程中不断添加食品级酸或食品级碱维持pH。
8.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S5中去除未酶解的颗粒及不容杂物时，用4～8层纱布或棉饼或其他100～200目的筛网过滤，或2000～10000r/min的离心机离心1～30min，或用300～400目的滤纸或滤布过滤，得到澄清溶液。
9.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S7除菌步骤采用升温到100℃30min，或105℃20min杀菌，或0.22μm除菌滤芯过滤。
10.根据权利要求1所述的高活性桑叶低聚肽粉提取工艺，其特征在于：S8步骤中，如为喷雾干燥则进风温度150～220℃，出风温度75～100℃；若冷冻干燥则温度维持在-10℃～-50℃，维持时间延续24～48h。
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