CN110779993B

CN110779993B - 小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法

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Publication number: CN110779993B
Application number: CN201910909112.1A
Authority: CN
Inventors: 刘潇潇; 罗卓雅; 计周正; 李华; 张万青; 陈馥
Original assignee: Guangdong Institute For Drug Control (guangdong Institute For Drug Quality
Current assignee: Guangdong Institute For Drug Control (guangdong Institute For Drug Quality
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110779993A

Abstract

本发明提供一种小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法，首先取Nepasaikosaponin k配制成对照品溶液，注入液相色谱‑质谱仪，记录对照品提取离子流色谱图；然后取待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料制成供试品溶液，注入液相色谱‑质谱仪，记录供试品提取离子流色谱图；最后比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图，判断小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中藏柴胡掺伪状况。通过采集对照品和供试品的提取离子流色谱图，对二者中特定离子对的保留时间和色谱峰峰面积进行比较，可鉴别待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中是否有藏柴胡掺伪投料，并可对藏柴胡掺量进行定量，检测过程快捷有效，方法稳定可靠。

Description

小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术及药品质量控制领域，涉及中成药及其原料药材质量鉴定的检测方法，尤其涉及一种小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法。

背景技术

小柴胡颗粒为感冒常用OTC药物。根据国家药品监督管理局数据查询系统显示目前有生产厂家101家，销售量和使用量均较大。其质量标准收载于2015年版《中国药典》一部，处方为柴胡150g、黄芩56g、姜半夏56g、党参56g、生姜56g、甘草56g、大枣56g。七味药材均收载于2015年版《中国药典》一部。

2015年版《中国药典》一部收载柴胡Bupleuremchinense DC.和狭叶柴胡BupleuremscorzonerifoliumWilld的干燥根为药用，习称“北柴胡”和“南柴胡”。然而，我国柴胡属植物分布广，种类多，据《中国植物志》记载有36种、17变种、7变型。市场上柴胡药材种类纷繁复杂，多数种类在产地有作柴胡药用的习惯，一定程度造成柴胡药材的品种混乱。近年来随着过度采挖，野生柴胡资源急剧短缺，目前药用柴胡以栽培种植为主。由于柴胡属植物的性状特征较为接近，在采集和使用时难以鉴别，加之正品柴胡药材资源长期短缺等原因，以致长期以来多种混伪品与正品柴胡混淆用药的现象极为普遍。柴胡药源的混乱给含柴胡中成药的质量带来隐患，也给含柴胡中成药的市场监管带来挑战。

藏柴胡(窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum var.stenophyllum)中柴胡皂苷含量高，在甘肃、宁夏、青海、山西等西北省市大面积种植，常掺入或混充北柴胡使用。部分不法企业为降低成本使用藏柴胡代替北柴胡投料、部分企业由于缺乏中药材鉴别经验错用藏柴胡投料生产小柴胡颗粒，均改变了小柴胡颗粒的药效物质基础，影响质量和疗效。为保障公众用药安全有效，维护药品市场公平公正以及保护消费者利益，对于故意不按规定处方投料正品柴胡生产的小柴胡颗粒，亟需建立相应的检查方法。小柴胡颗粒中的柴胡经过水煎煮，无法通过性状进行鉴别。藏柴胡和北柴胡为同科同属植物，化学成分基本一致，无法通过常见的指标性成分进行区别。因此，需要找到一种新的特征性成分对藏柴胡进行检查。

发明内容

本发明的目的在于通过检测小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中的柴胡皂苷化合物Nepasaikosaponin k，提供一种小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法，可有效鉴定出小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中是否掺伪藏柴胡并检测出藏柴胡的掺量。

本发明所述小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法包括以下步骤：

1)取Nepasaikosaponin k配制成对照品溶液，注入液相色谱-质谱仪，记录对照品提取离子流色谱图；

2)取待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料制成供试品溶液，注入液相色谱-质谱仪，记录供试品提取离子流色谱图；

3)比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图，判断小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中藏柴胡掺伪状况。

进一步，步骤3)包括：比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图的保留时间及对应色谱峰的峰面积，若供试品提取离子流色谱图出现与对照品提取离子流色谱图保留时间相同的色谱峰，且供试品提取离子流色谱图中的色谱峰面积超过对照品提取离子流色谱图中相应的色谱峰面积，则判定待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中有藏柴胡掺伪；否则判定无藏柴胡掺伪。

进一步，所述对照品提取离子流色谱图和供试品提取离子流色谱图的检测离子对以m/z 989.5或m/z979.5或m/z943.5为母离子。

进一步，所述检测离子对以m/z 943.5为母离子，包括m/z 943.5→635.4、m/z943.5→797.5和m/z 943.5→781.5。

进一步，若判定待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中有藏柴胡掺伪，步骤3)后还包括步骤：计算待测小柴胡颗粒制剂的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积，将该色谱峰峰面积代入线性方程y＝85.80x+444.2中得到该待测小柴胡颗粒制剂中藏柴胡掺量；或，

计算待测中草药原料的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积，将该色谱峰峰面积代入方程y＝82.56x+487.8中得到该待测中草药原料中藏柴胡掺量；

其中y表示色谱峰峰面积，x表示藏柴胡掺量。

进一步，步骤1)和2)中的色谱条件为：

流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0～3min，25→30％B；3～30min，30→50％B；30～31min，50→90％B；31～35min，90％B；35～36min，90→25％B；36～45min，25％B；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流速：0.3mL/min；

柱温：25～40℃；

进样量：2～5μl。

进一步，步骤1)和2)中的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；检测模式：负离子多反应监测模式；毛细管电压：3000～4000V；雾化气压力：40psi；干燥气温度：300～500℃；干燥气流量：7～9L/min；碎裂电压155～185V，碰撞能量：40～60eV。

进一步，所述对照品溶液为Nepasaikosaponin k的甲醇溶液。

进一步，所述待测小柴胡颗粒制剂的供试品溶液的配制方法为：取待测小柴胡颗粒制剂，加入含浓氨的甲醇溶液，超声处理后冷却、摇匀、过滤即得。

进一步，所述中草药原料的供试品溶液的制备方法为：取中草药原料，对其进行煎煮、离心、合并上清液、浓缩，加入含浓氨的甲醇溶液，超声处理后冷却、摇匀、过滤即得。

本发明通过采集Nepasaikosaponin k对照品和待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料供试品的提取离子流色谱图，对二者中特定离子对的保留时间和色谱峰峰面积进行比较，可鉴别待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中是否有藏柴胡掺伪投料，并可对藏柴胡掺量进行定量，检测过程快捷有效，方法稳定可靠。

附图说明

图1是Nepasaikosaponin k的HPLC-TOF/MS一级质谱图；

图2是Nepasaikosaponin k的HPLC-TOF/MS二级质谱图；

图3是Nepasaikosaponin k的¹H-NMR图；

图4是Nepasaikosaponin k的¹³C-NMR图；

图5表示Nepasaikosaponin k化学结构式的各组成单元及分子量；

图6是Nepasaikosaponin k的HPLC-UV图谱；

图7是藏柴胡投料生产的小柴胡颗粒制剂的HPLC-TOF/MS提取离子流图(EIC m/z989.5)，图中右上方为峰1的放大图；

图8是藏柴胡投料生产的小柴胡颗粒制剂的HPLC-QQQ/MS多反应监测总离子流图；

图9是Nepasaikosaponin k对照品的HPLC-QQQ/MS多反应监测提取离子流图(m/z943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5)；

图10是藏柴胡投料生产的小柴胡颗粒制剂的HPLC-QQQ/MS多反应监测提取离子流图(m/z 943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5)；

图11是正品柴胡(北柴胡)投料生产的小柴胡颗粒制剂的HPLC-QQQ/MS多反应监测提取离子流图(m/z 943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5)；

图12是缺柴胡的小柴胡颗粒阴性样品的HPLC-QQQ/MS多反应监测提取离子流图(m/z 943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5)。

具体实施方式

发明人首次发现柴胡皂苷化合物Nepasaikosaponin k在不同种柴胡中的含量差异极大，且在藏柴胡中的含量显著高于其他种柴胡，可用于区别藏柴胡和其他种柴胡，并将其应用于中成药小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检查。

以下通过对Nepasaikosaponin k制备和鉴定、本发明具体的检测方法及检测条件筛选、对该检测方法的方法学考察和验证等方面进行详细说明以进一步解释本发明的技术方案。

一、Nepasaikosaponin k制备和鉴定

本发明提供的小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法所依据的化合物Nepasaikosaponin k可以从藏柴胡中提取得到。具体地，以藏柴胡为原料，通过提取、萃取、柱层析、制备液相分离等天然药物化学相关的分离分析方法处理，得到白色粉末20mg。经HPLC-TOF/MS一级质谱(见图1)分析，确定其分子离子峰[M-H]^-为943.53；经二级质谱(见图2)分析，其含有2个葡萄糖(Glu)和1个鼠李糖(Rha)，苷元[M-H]^-为473.38。经¹H-NMR(见图3)、¹³C-NMR(见图4)分析，确定其分子式为C₄₈H₈₀O₁₈，分子量为944.53，与文献数据对比，鉴定该化合物为柴胡皂苷Nepasaikosaponin k，其具体的化学结构式如式I所示：

另外在图5中更清楚地标识出Nepasaikosaponin k化学结构式中各组成单元及相关分子量，图5中虚线表示单元划分方式，数字表示虚线右侧或上侧的单元的总分子量。例如图5中数字781表示Nepasaikosaponin k化学结构式中除了数字781相邻的虚线左侧的Glu单元外，右侧组成单元的总分子量为781。

使用Waters H-Class UPLC色谱仪对制备的Nepasaikosaponin k进行纯度分析，条件为：

色谱柱：Agilent SB C18，2.1*100mm 1.8μm；流动相：0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～1min，5％B；1～3min，5→30％B；3～9min，30％B；9～10min，30→40％B；10～14min，40％B；14～19min，40→95％B；19～21min，95％B；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；检测器：UV-210nm；进样量：1μl；配制浓度：1.0mg/ml。

经高效液相色谱法测定(见图6)，上述制备的Nepasaikosaponin k的纯度达到了95％以上。

二、小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法

本发明提供的小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法包括以下步骤：

1)取Nepasaikosaponin k配制成对照品溶液，注入液相色谱-质谱仪，记录对照品提取离子流色谱图。

具体地，精密称取适量上述从藏柴胡所提取得到的Nepasaikosaponin k，加甲醇制成每1ml含0.5μg的溶液(即浓度为0.5μg/ml)，即得对照品溶液。将对照品溶液注入液相色谱-质谱仪，记录对照品提取离子流色谱图。

其中色谱条件为：

流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，随着时间的变化流动相B的百分比随梯度洗脱程序发生变化：0～3min，25→30％B；3～30min，30→50％B；30～31min，50→90％B；31～35min，90％B；35～36min，90→25％B；36～45min，25％B；即，在0～3min内，按照体积比计的乙腈的百分比从25％变化至30％；在3～30min内，按照体积比计的乙腈的百分比从30％变化至50％；在30～31min内，按照体积比计的乙腈的百分比从50％变化至90％；在31～35min内，按照体积比计的乙腈的百分比保持在90％；在35～36min内，按照体积比计的乙腈的百分比从90％变化至25％；在36～45min内，按照体积比计的乙腈的百分比保持在25％；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱粒径1.8μm)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μl。

质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源(ESI-)；检测模式：负离子多反应监测模式(MRM)；毛细管电压(Capillary)：3500V；雾化气压力(Nebulizer)：40psi；干燥气温度(Gas Temp)：300℃；干燥气流量(Gas Flow)：9L/min；碎裂电压(Fragmentor)175V，碰撞能量(CollisionEnergy)：50eV。

2)取待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料制成供试品溶液，注入液相色谱-质谱仪，记录供试品提取离子流色谱图。

具体地，取待测小柴胡颗粒制剂，经混匀、研细，按处方(柴胡150g、黄芩56g、姜半夏56g、党参56g、生姜56g、甘草56g、大枣56g)折算，取约相当于柴胡0.5g的样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率350W，频率37kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5％浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得待测小柴胡颗粒制剂的溶液作为供试品溶液。

或者，精密称取用于制成小柴胡颗粒制剂的中草药原料(尤其是柴胡原料)适量，置烧杯中，加水煎煮2次，离心，上清液合并，浓缩至适量得浓缩液，称重，取约相当于柴胡0.5g的样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率350W，频率37kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5％浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

将供试品溶液注入液相色谱-质谱仪，在与上述步骤1)相同的色谱条件和质谱条件下记录供试品提取离子流色谱图。

具体地，比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图的保留时间及对应色谱峰的峰面积，尤其是比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图中以m/z 989.5或m/z979.5或m/z943.5为母离子的检测离子对的色谱峰，优选以m/z943.5为母离子的离子对m/z 943.5→635.4、m/z 943.5→797.5和m/z 943.5→781.5，若供试品提取离子流色谱图出现与对照品提取离子流色谱图保留时间相同的上述色谱峰，且供试品提取离子流色谱图中的色谱峰面积超过对照品提取离子流色谱图中相应的色谱峰面积，则判定有藏柴胡掺伪；否则判定无藏柴胡掺伪。

若小柴胡颗粒制剂或柴胡药材中有藏柴胡掺伪，则可计算待测小柴胡颗粒制剂的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积，将该色谱峰峰面积代入线性方程y＝85.80x+444.2中得到该待测小柴胡颗粒制剂中藏柴胡掺量；或，计算待测中草药原料的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积，将该色谱峰峰面积代入方程y＝82.56x+487.8中得到该待测中草药原料中藏柴胡掺量；其中y表示色谱峰峰面积，x表示藏柴胡掺量。

三、检测条件筛选

3.1.供试品溶液制备条件选择

以不同的溶剂体积、不同超声处理时间、不同浓氨浓度下所配制的待测小柴胡颗粒制剂的溶液作为供试品溶液，其所得供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积结果如表1～3所示：

表1.不同溶剂体积下的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积

表2.不同超声处理时间下的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积

表3.不同浓氨浓度下的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积

表1反映，三种提取溶剂用量的提取效率相当，考虑节约溶剂和环保，优选25ml为提取溶剂体积；表2反映，不同超声时间的提取效率相当，考虑节约时间，优选超声时间30分钟；表3反映，不同浓度浓氨试液的甲醇溶液提取效率相当，优选5％浓氨试液的甲醇溶液作为提取溶剂。

3.2.色谱、质谱检测条件筛选

(1)检测器的选择

使用高效液相色谱-飞行时间质谱检测器(HPLC-TOF/MS)或高效液相色谱-三重四级杆质谱检测器(HPLC-QQQ/MS)，分别采用提取离子流(EIC)(见图7)或多反应检测(MRM)(见图8)模式均可较好地实现样品中Nepasaikosaponin k的检测。其中HPLC-QQQ/MS可用于定量检测。

(2)质谱检测模式的选择

分别采用电喷雾正离子模式和负离子模式检测对照品溶液和供试品溶液，结果正离子模式未检测出Nepasaikosaponin k色谱峰。采用负离子模式检测，可检出Nepasaikosaponin k的分子离子峰[M-H]^-943.5，氯离子加合峰[M+Cl]^-979.5和羧基加合峰[M+HCOO]^-989.5(见图1)。

(3)定量检测离子对的选择

高效液相色谱-质谱负离子模式下检测化合物Nepasaikosaponin k，可检测到其分子离子峰[M-H]^-943.5，氯离子加合峰[M+Cl]^-979.5、羧基加合峰[M+HCOO]^-989.5，以及碎片离子[M-H-Glu]^-781.5、[M-H-Rha]^-797.5、[M-H-Glu-Rha]^-635.4(见图2)。分别检测供试品溶液中以m/z 989.5、979.5、943.5为母离子的不同离子对的色谱峰，以m/z 943.5为母离子的m/z 943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5离子对的色谱峰峰面积最大，信噪比高，分离度好(见表4)，故优选m/z 943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5为Nepasaikosaponin k的检测离子对，其中m/z 943.5→635.4优选为定量离子对。

表4.检测离子对的优选

(4)柱温的选择

分别考察柱温25℃、30℃、35℃、40℃下HPLC-QQQ/MS(MRM)对供试品溶液的检测结果，如表5所示，柱温越高，供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流图中Nepasaikosaponin k的色谱峰分离度越好，故柱温选择40℃。

表5.柱温的考察

(5)碎裂电压(Fragmentor)和碰撞能量(Collision Energy)的选择

分别考察碎裂电压155V、165V、175V、185V和碰撞能量40eV、50eV、60eV下HPLC-QQQ/MS(MRM)对供试品溶液的检测结果，如表6反映，采用碎裂电压175V和碰撞能量50eV，供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流图中Nepasaikosaponin k的色谱峰峰面积最大，故优选碎裂电压175V和碰撞能量50eV。

表6.碎裂电压和碰撞能量的考察

四、小柴胡颗粒及其原料中藏柴胡掺伪的检测方法的方法学考察

为证实上述小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法的可靠性，以下从Nepasaikosaponin k在不同柴胡药材中分布情况、小柴胡颗粒制剂专属性、Nepasaikosaponin k与藏柴胡掺伪线性关系、检测限、重复性、稳定性和耐用性等方面对该方法进行考察评估。

4.1专属性考察

(1)Nepasaikosaponin k在不同柴胡药材中分布情况

分别取各柴胡药材(藏柴胡9批、北柴胡7批、竹叶柴胡2批，南柴胡、银州柴胡、锥叶柴胡各1批)5g，加水(约150ml)煎煮2次，每次1.5h，离心，上清液合并，浓缩至适量，称重；取约相当于柴胡0.5g的浓缩液，精密加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率350W，频率37kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5％浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，按上述小柴胡颗粒及其原料中藏柴胡掺伪的检测方法中所述的色谱、质谱条件进行检测，结果(见表7)发现不同种柴胡中均含有Nepasaikosaponin k，但是藏柴胡中Nepasaikosaponin k含量极高，约为其他几种柴胡药材含量的10-40倍(以供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流中Nepasaikosaponin k色谱峰峰面积计)，说明通过检测Nepasaikosaponin k含量来区分藏柴胡与其他种柴胡是可行的，且可以Nepasaikosaponin k的m/z 943.5→635.4、m/z 943.5→797.5和m/z 943.5→781.5离子对的色谱峰峰面积作为参考指标。

表7.各柴胡药材中Nepasaikosaponin k特征离子对的峰面积

(2)制剂的专属性考察

小柴胡颗粒标准制剂样品溶液制备：按小柴胡颗粒处方和制法，分别取北柴胡50g、甘草、黄芩、党参、大枣各18.5g，加水(约150ml)煎煮2次，每次1.5h，煎液合并，滤过，滤液浓缩至适量，备用。另取姜半夏、生姜各18.5g，粉粹，用70％乙醇浸渍24h后进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，与上述水提浓缩液混合，浓缩至适量，称重，制得小柴胡标准汤剂流浸膏3批。精密称取相当于柴胡0.5g的小柴胡标准汤剂流浸膏，置具塞锥形瓶中，精密加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率350W，频率37kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5％浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

柴胡阴性样品溶液制备：按小柴胡颗粒处方和制法，取甘草、黄芩、党参、大枣药材各28g，加水煎煮2次，每次1.5h，煎液合并，滤过，滤液浓缩至适量，备用。另取姜半夏、生姜各28g，粉粹，用70％乙醇浸渍24h后进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，与上述水提浓缩液混合，浓缩至适量，称重，制成柴胡阴性样品流浸膏。精密称取相当于柴胡0.5g的阴性样品流浸膏，置具塞锥形瓶中，精密加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率350W，频率37kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5％浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

藏柴胡阳性制剂样品溶液制备：按小柴胡颗粒处方和制法，分别取藏柴胡50g，甘草、黄芩、党参、大枣药材各18.5g，加水煎煮2次，每次1.5h，煎液合并，滤过，滤液浓缩至适量，备用。另取姜半夏、生姜各18.5g，粉粹，用70％乙醇浸渍24h后进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，与上述水提浓缩液混合，浓缩至适量，称重，制得藏柴胡阳性制剂流浸膏2批。精密称取相当于柴胡0.5g的阳性样品流浸膏，置具塞锥形瓶中，精密加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率350W，频率37kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5％浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

将小柴胡颗粒标准制剂样品溶液、柴胡阴性样品溶液、藏柴胡阳性制剂样品溶液按前述检测方法中的色谱、质谱条件进行检测，结果如表8所示。从表8可以看出，藏柴胡阳性样品中Nepasaikosaponin k的含量约为小柴胡颗粒标准制剂样品中的100倍(以供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流中Nepasaikosaponin k色谱峰峰面积计)，缺柴胡的小柴胡颗粒阴性样品中特征离子对均未检出(见图12)，说明阴性无干扰。该结果说明，本发明检测方法确实可用于检测小柴胡颗粒制剂中藏柴胡掺伪。

表8.小柴胡颗粒标准制剂样品溶液、柴胡阴性样品溶液、藏柴胡阳性制剂样品溶液中Nepasaikosaponin k特征离子对的峰面积

/：未检出

4.2线性考察

(1)Nepasaikosaponin k的线性关系考察

取对照品Nepasaikosaponin k 0.01g，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg/ml的溶液，作为储备液，将Nepasaikosaponin k储备液逐级稀释，配制Nepasaikosaponin k工作用对照品溶液(0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml)，按前述检测方法中的色谱、质谱条件进行检测，以Nepasaikosaponin k的m/z 943.5→635.4的色谱峰峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：y＝1.826x+187.3，r＝0.9995，说明Nepasaikosaponin k在0.1μg/ml～5μg/ml范围内与m/z 943.5→635.4的色谱峰峰面积线性关系良好。

(2)藏柴胡掺伪北柴胡药材的线性关系考察

分别取藏柴胡和北柴胡适量，制备相当于藏柴胡掺入北柴胡中比例分别为3％、5％、10％、25％、50％、100％的样品共6份，精密称定，置烧杯中，加水约150ml，煎煮2次，离心，上清液合并，浓缩至适量，称重；取约相当于柴胡总量0.5g(藏柴胡和北柴胡之和)的浓缩液，精密称定，按前述检测方法中供试品溶液制备方法进行处理，并在相同色谱、质谱条件进行检测，以供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流中Nepasaikosaponin k的色谱峰峰面积为纵坐标，藏柴胡掺伪北柴胡的比例为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：y＝82.56x+487.8，r＝0.999，说明在藏柴胡掺伪北柴胡比例3％～100％范围内，藏柴胡掺入量与供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流中Nepasaikosaponin k色谱峰峰面积的线性关系良好，可用于对柴胡药材中藏柴胡掺伪进行定量检测。

(3)藏柴胡掺伪小柴胡颗粒制剂的线性关系考察

根据小柴胡颗粒的处方和制法，分别取藏柴胡和相应量的北柴胡，再各取甘草、黄芩、党参、大枣药材适量，制备相当于藏柴胡掺入小柴胡颗粒制剂中比例分别为3％、5％、10％、25％、50％、100％的样品共6份，精密称定，置烧杯中，加水约150ml，煎煮2次，离心，上清液合并，浓缩至适量，称重；取约相当于柴胡总量0.5g(藏柴胡和北柴胡之和)的浓缩液，精密称定，按前述检测方法中供试品溶液制备方法进行处理，并在相同色谱、质谱条件进行检测，以供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流中Nepasaikosaponin k的色谱峰峰面积为纵坐标，藏柴胡掺伪小柴胡颗粒的比例为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：y＝85.80x+444.2，r＝0.993，说明在藏柴胡掺伪小柴胡颗粒比例3％～100％范围内，藏柴胡掺入量与供试品溶液m/z 943.5→635.4的提取离子流中Nepasaikosaponin k色谱峰峰面积的线性关系良好，可用于对小柴胡颗粒制剂中藏柴胡掺伪进行定量检测。

4.3检测限考察

配制藏柴胡掺伪1％的小柴胡颗粒供试品溶液，按前述检测方法中供试品溶液制备方法进行处理，并在相同色谱、质谱条件进行检测，结果(见表9)显示供试品溶液m/z943.5→635.4、m/z 943.5→797.5、m/z 943.5→781.5的提取离子流色谱中Nepasaikosaponin k色谱峰的S/N均大于10，且分离度均大于1.3。因此，该方法检测限为：小柴胡颗粒中藏柴胡掺伪1％，即每袋掺15mg，即可检出。

表9.小柴胡颗粒中掺1％藏柴胡的检测结果

4.4重复性考察

平行取约相当于柴胡0.5g的同一批小柴胡颗粒样品6份，精密称定，按前述检测方法中供试品溶液制备方法进行处理，并在相同色谱、质谱条件进行检测，结果见表10。

平行制备6份北柴胡中掺10％藏柴胡的样品溶液，分别取约相当于柴胡总量0.5g(藏柴胡和北柴胡之和)的浓缩液，精密称定，按前述检测方法中供试品溶液制备方法进行处理，并在相同色谱、质谱条件进行检测，结果见表10。表10反映，本发明的检测方法具有良好的重复性。

表10.重复性考察结果

4.5稳定性考察

取上述4.4中所制备的同一供试品溶液，按前述检测方法的色谱、质谱条件分别于0、2、4、8、12、24、48小时测定。结果(见表11)表明，供试品溶液在48小时内稳定，本发明的检测方法具有较高的稳定性。

表11.稳定性考察结果

4.6耐用性考察

使用4根色谱柱考察本发明检测方法的重现性，检测同一样品的m/z 943.5→635.4、943.5→781.5、943.5→797.5提取离子流色谱中Nepasaikosaponin k色谱峰。结果(见表12)表明，色谱柱的长度和内径对检测无影响，采用粒径1.8μm的色谱柱，分离度和信噪比等均能满足耐用性要求。使用粒径3.0μm或2.5μm的色谱柱，分离度较低。故本发明检查方法优选色谱柱粒径为1.8μm。

表12.耐用性考察结果

4.7对照品溶液浓度考察

按照《中国药典》四部0212药材和饮片检定通则，杂质通常不得过3％。考虑柴胡药材性状鉴别较难，且有交叉种植的可能，故放宽限度，拟定北柴胡中掺伪藏柴胡的限度为10％。按照藏柴胡掺伪10％的比例制备小柴胡颗粒样品13份，按前述检测方法中供试品溶液制备和色谱、质谱条件进行检测，检测13份供试品溶液的m/z 943.5→635.4提取离子流色谱中Nepasaikosaponin k的色谱峰峰面积(见表13)。结果显示，Nepasaikosaponin k在不同批次藏柴胡中含量有一定差异，以其峰面积的平均值1195作为限度。根据Nepasaikosaponin k的m/z 943.5→635.4的色谱峰峰面积和浓度的线性关系，计算藏柴胡掺伪10％小柴胡颗粒供试品溶液中Nepasaikosaponin k的浓度为0.553μg/ml，故优选Nepasaikosaponin k对照品溶液的限度为0.5μg/ml。

表13.不同批次藏柴胡制备的掺伪10％藏柴胡的小柴胡颗粒样品溶液的检测结果

五、本发明检查方法的检查结果

0.5μg/mlNepasaikosaponin k对照品溶液的HPLC-QQQ/MS图谱如图9所示，选取10份以藏柴胡掺伪的小柴胡颗粒样品所制备的供试品溶液的HPLC-QQQ/MS图谱见图10。藏柴胡掺伪小柴胡颗粒样品的供试品溶液的m/z 943.5→635.4、m/z 943.5→797.5和m/z943.5→781.5提取离子流色谱图中，同时出现与Nepasaikosaponin k对照品色谱保留时间相同的色谱峰，且供试品溶液中m/z 943.5→635.4提取离子流图中色谱峰面积超过对照品溶液m/z 943.5→635.4提取离子流图中的色谱峰面积。以小柴胡颗粒掺不同比例藏柴胡的线性曲线y＝85.80x+444.2进行计算，结果(见表14)表明，10批样品中藏柴胡掺伪均超过10％。

表14. 10份不同程度藏柴胡掺伪的小柴胡颗粒检查结果

而以正品柴胡投料生产的小柴胡颗粒样品制备的供试品溶液的HPLC-QQQ/MS图谱如图11所示。该供试品溶液的m/z 943.5→635.4、m/z 943.5→797.5和m/z 943.5→781.5的提取离子流色谱图中，部分同时出现与Nepasaikosaponin k对照品色谱保留时间相同的色谱峰，这些样品中m/z 943.5→635.4提取离子流图中色谱峰面积均小于对照品溶液m/z943.5→635.4提取离子流图中的色谱峰面积。上述检测结果进一步验证了本发明方法的可行性和准确性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种小柴胡颗粒制剂及其中草药原料中藏柴胡掺伪的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

3)比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图，判断小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中藏柴胡掺伪状况；

步骤1)和2)中的色谱条件为：

流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0～3min，25→30％B；3～30min，30→50％B；30～31min，50→90％B；31～35min，90％B；35～36min，90→25％B；

36～45min，25％B；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流速：0.3mL/min；

柱温：25～40℃；

进样量：2～5μL。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于：步骤3)包括：比较供试品提取离子流色谱图与对照品提取离子流色谱图的保留时间及对应色谱峰的峰面积，若供试品提取离子流色谱图出现与对照品提取离子流色谱图保留时间相同的色谱峰，且供试品提取离子流色谱图中的色谱峰面积超过对照品提取离子流色谱图中相应的色谱峰面积，则判定待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中有藏柴胡掺伪；否则判定无藏柴胡掺伪。

3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于：所述对照品提取离子流色谱图和供试品提取离子流色谱图的检测离子对以m/z 989.5或m/z 979.5或m/z 943.5为母离子。

4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于：所述检测离子对以m/z 943.5为母离子，包括m/z 943.5→635.4、m/z 943.5→797.5和m/z 943.5→781.5。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：若判定待测小柴胡颗粒制剂或其中草药原料中有藏柴胡掺伪，步骤3)后还包括步骤：计算待测小柴胡颗粒制剂的供试品提取离子流色谱图中m/z 943.5→635.4色谱峰峰面积，将该色谱峰峰面积代入线性方程y＝85.80x+444.2中得到该待测小柴胡颗粒制剂中藏柴胡掺量；或，

其中y表示色谱峰峰面积，x表示藏柴胡掺量。

6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于：步骤1)和2)中的质谱条件为：

7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于：所述对照品溶液为Nepasaikosaponin k的甲醇溶液。

8.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于：所述待测小柴胡颗粒制剂的供试品溶液的配制方法为：取待测小柴胡颗粒制剂，加入含浓氨的甲醇溶液，超声处理后冷却、摇匀、过滤即得。

9.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于：所述中草药原料的供试品溶液的制备方法为：取中草药原料，对其进行煎煮、离心、合并上清液、浓缩，加入含浓氨的甲醇溶液，超声处理后冷却、摇匀、过滤即得。