CN110724767A

CN110724767A - 用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量pcr引物和探针及试剂盒

Info

Publication number: CN110724767A
Application number: CN201911106725.8A
Authority: CN
Inventors: 李阿茜; 梁米芳; 李建东; 李德新; 刘洋; 芜为; 李川
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-01-24
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110724767B

Abstract

本发明提供用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针及试剂盒。所述试剂盒中包含基于实时荧光定量PCR技术检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的引物及探针，它们的序列分别如SEQ ID NO:1‑9所示。本发明采用三重实时荧光定量PCR技术建立快速检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的方法，该方法与单重实时荧光定量PCR相比，灵敏度上无明显差异，20次独立重复实验结果显示本方法具有良好的稳定性。本方法简化了实验步骤，减少样本用量，节约实验成本，为快速排查疑似感染人群提供参考信息，为相关疾病的鉴别诊断提供技术支持，为控制疫情争取宝贵时间。

Description

用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量 PCR引物和探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针及试剂盒。

背景技术

由虫媒病毒引起的疾病在全球范围内构成了严重的公共卫生负担，尤其是近年来发生的寨卡疫情引起了全世界的关注。寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(Denguevirus,DENV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)均属于蚊媒传播病毒，在流行区域上存在一定交叉，且病人在感染后初期具有相似的临床特征，因此将此三种病毒进行组合检测对于传染病毒控制具有重要意义。

实时荧光定量RT-PCR以其反应迅速、特异性强、灵敏性高等优点在病毒感染早期的检测中具有巨大优势，而基于Taqman探针技术的RT-PCR成熟稳定，已广泛应用于多种病原体检测。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针及试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量PCR引物，

用于检测登革病毒(登革热病毒)的引物为(SEQ ID NO:4-5)：

DENV-F：5′-GGAAGTAGAGCAATATGGTACATGTG-3′

DENV-R：5′-CCGGCTGTGTCATCAGCATAYAT-3′；

用于检测基孔肯雅病毒的引物为(SEQ ID NO:7-8)：

CHIKV-F：5′-AAGCTYCGCGTCCTTTACCAA-3′

CHIKV-R：5′-CCAAATTGTCCYGGTCTTCCT-3′；

用于检测寨卡病毒的引物为(SEQ ID NO:1-2)：

ZIKV-F：5′-ATCCTGACTCCCCCCGYAGATT-3′

ZIKV-R：5′-ACYGTCAGTTGRACTCCATTCTC-3′。

第二方面，本发明提供与所述三重实时荧光定量PCR引物配套使用的探针，用于检测登革病毒的探针为：5′-TGTGCAGTCCTTCTCCTTCCACTCCACT-3′(SEQ ID NO:6)；

用于检测基孔肯雅病毒的探针为：5′-CCAATGTCYTCMGCCTGGACACCTTT-3′(SEQ IDNO:9)；

用于检测寨卡病毒的探针为：5′-TCRAGAATGGAAAACATCATGTG-3′(SEQ ID NO:3)；

本发明中，Y表示碱基C或T，R表示碱基A或G，M表示碱基A/C。

本发明根据GenBank数据库中收录的病毒全长基因序列寻找保守区，进而设计检测引物和探针。分别选取寨卡病毒NS1基因、基孔肯雅病毒E1基因以及登革病毒NS5基因(序列分别如SEQ ID NO:10-12所示)作为引物和探针的靶序列。

第三方面，本发明提供含有所述引物和/或探针的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供登革热、基孔肯雅及寨卡病毒三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物和探针，还含有逆转录酶、DNA聚合酶、标准阳性模板、反应缓冲液等中的至少一种。

第五方面，本发明提供所述引物和探针、含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒在登革热、基孔肯雅及寨卡病毒检测中的应用。

第六方面，本发明提供一种非诊断目的三重实时荧光定量PCR检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总RNA；

2)配制含有所述引物和探针的PCR反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和PCR扩增反应；

3)分析扩增产物。

步骤2)包括：向反应管中加入缓冲液12.5μl，酶2μl(采用AgPath-ID One StepRT-PCR Kit，每个PCR反应体系中加入酶混合液2μl)，寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，另加入dNTP至终浓度0.1mM，MgCl₂至终浓度1mM，然后加入RNA模板5μl，最后用DEPC水补齐至25μl体系；混匀后将反应管置于扩增仪中，反应条件为：50℃，30min；95℃10min；95℃15s，57～61℃(优选60℃)45s，45个循环。

优选地，本发明使用AgPath-ID One Step RT-PCR Kit(Ambion)试剂盒进行三重实时荧光定量PCR反应。

步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有相应的病毒核酸；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有相应病毒核酸，表现为阳性结果；不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到相应病毒核酸，表现为阴性结果。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明建立的检测方法与单重实时荧光定量PCR相比，灵敏度上无明显差异，20次独立重复实验结果显示本方法具有良好的稳定性。

(二)本发明的引物和探针组合是根据靶标序列设计多对引物、探针，并经大量实验筛选、反复优化获得的，特异性好，与其他病毒无交叉反应，能将寨卡病毒、登革病毒(I～IV型)、基孔肯雅病毒与乙型脑炎病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、塞姆利基森林病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、诺如病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒等其它毒种有效鉴别开来。

(三)将针对寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三种病毒的引物、探针混合于单个PCR体系中，既通过一个PCR反应便可对一份样本中的三种病原体同时进行检测，节约成本且省时省力。

(四)本方法简化了实验步骤，减少样本用量，节约实验成本，为快速排查疑似感染人群提供参考信息，为相关疾病的鉴别诊断提供技术支持，为控制疫情争取宝贵时间。

附图说明

图1为本发明实施例1中病毒核酸对三重实时定量荧光RT-PCR的特异性评价。

图2A～图2D为本发明实施例1中登革病毒体外转录RNA对三重荧光定量RT-PCR的灵敏性评价。图2A：登革病毒Ⅰ型；图2B：登革病毒Ⅱ型；图2C：登革病毒Ⅲ型；图2D：登革病毒Ⅳ型。

图3A为本发明实施例1中寨卡病毒体外转录RNA对三重荧光定量RT-PCR的灵敏性评价。

图3B为本发明实施例1中基孔肯雅病毒体外转录RNA对三重荧光定量RT-PCR的灵敏性评价。

图4A～图4D为本发明实施例1中登革病毒核酸对三重荧光定量RT-PCR的灵敏性评价。图4A：登革病毒Ⅰ型；图4B：登革病毒Ⅱ型；图4C：登革病毒Ⅲ型；图4D：登革病毒Ⅳ型。

图5A为本发明实施例1中寨卡病毒核酸对三重荧光定量RT-PCR的灵敏性评价。

图5B为本发明实施例1中基孔肯雅病毒核酸对三重荧光定量RT-PCR的灵敏性评价。

具体实施方式

本发明根据GenBank数据库中收录的病毒全长基因寻找保守区，进而设计引物探针序列。用病毒RNA验证引物探针可行后，对三种病毒进行体外转录合成带有靶基因的RNA，10倍梯度稀释拟合标准曲线来计算最低检出限，作为检测方法灵敏度的指标。用乙型脑炎病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、塞姆利基森林病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、诺如病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒所提取的核酸对三重方法进行特异性评价。

(1)引物探针设计：本发明选用截止至2018年6月GenBank收录的所有全长病毒序列，通过比对分析寻找保守区，分别选取寨卡病毒基因NS1蛋白序列、基孔肯雅病毒的E1蛋白序列以及登革病毒的NS5区域为引物探针的靶序列。序列见表1：

表1引物及探针信息

引物/名称及其在靶基因上的起止位置	引物及探针序列(5′-3′)
		ZIKV-F(2593-2614bp)	ATCCTGACTCCCCCCGYAGATT
ZIKV-R(2730-2752bp)	ACYGTCAGTTGRACTCCATTCTC
		ZIKV-P(2670-2692bp)	TCRAGAATGGAAAACATCATGTG
DENV-F(8977-9002bp)	GGAAGTAGAGCAATATGGTACATGTG
		DENV-R(9157-9179bp)	CCGGCTGTGTCATCAGCATAYAT
DENV-P(9082-9109bp)	TGTGCAGTCCTTCTCCTTCCACTCCACT
		CHIKV-F(18387-18407bp)	AAGCTYCGCGTCCTTTACCAA
CHIKV-R(10575-10595bp)	CCAAATTGTCCYGGTCTTCCT
		CHIKV-P(10486-10511bp)	CCAATGTCYTCMGCCTGGACACCTTT

注：上述起止位置参考NCBI Accession:ZIKV NC035889；DENV NC001474；CHIKVNC004162。

采用AgPath-ID One Step RT-PCR Kit(Ambion)试剂盒进行三重实时荧光定量PCR反应，三重体系组成如下：缓冲液12.5μl，酶2μl，寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，另加入dNTP至终浓度0.1mM，MgCl₂至终浓度1mM，然后加入RNA模板5μl，最后用DEPC水补齐至25μl，混匀，即为三重体系。本实验采用BIO-RADCFX96荧光定量PCR仪，反应条件为：50℃，30min；95℃10min；95℃15s，60℃45s，45个循环。

本发明所用试剂盒和仪器均可替换为其他公司或生产商具有同样作用的产品。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1三重实时荧光定量PCR检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒方法的建立

1、体外转录RNA的制备

利用PCR的方法将T7启动子引入正链病毒阅读框的上游、负链病毒阅读框的下游，以达到经过体外转录后，获得与病毒基因组序列一致的RNA。以病毒RNA逆转录合成的cDNA或含有人工合成靶基因的质粒为模板，使用FastStart High Fidelity PCR system，配制如下体系：

正、反向引物的序列如下：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		ZIKV-F	TAATACGACTCACTATAGGGTGCTCAGTGGACTTCTCA
ZIKV-R	CGCTGTCACCATTGACCTCACTAA
		DENV-F	AATTAATACGACTCACTATAGGGACACGACTCCATTTGGACAACAG
DENV-R	CACAACACAATCATCTCCACTGATG
		CHIKV-F	TAATACGACTCACTATAGGGTACGAACACGTAACAGTGATCCCGA
CHIKV-R	GTGCCTGCTAAACGACACGC

反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，57℃1分钟，72℃2分钟，40个循环；72℃10分钟。

2、PCR产物回收

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，使用

ⅡGel Extraction Kit进行切胶回收，操作步骤如下：

1)从琼脂糖凝胶中切下目的条带，称重；

2)加入5倍于胶体积的QG缓冲液；

3)置于50℃水浴中10分钟融化凝胶，每隔2-3分钟轻柔振摇；

4)将样品移入QIAquick柱，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

5)加入750μL PE缓冲液，室温静置5分钟，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

6)加入750μL PE缓冲液，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

7)10,000rpm，离心2分钟；

8)将QIAquick柱置于新的1.5mL EP管中，向柱的中心加入40μL不含RNase的水，室温静置2分钟，10,000rpm，离心1分钟，收集洗脱液。

3、体外转录

使用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems—SP6和T7进行体外转录，获得靶基因的RNA模板，配制如下体系：

30℃反应2～4小时后，加入DNA酶消化线性DNA模板(用量为每1μg模板加入1个单位的DNA酶)，37℃反应15分钟。

4、体外转录RNA产物的回收与定量

使用RNeasy Mini Kit对体外转录的RNA产物进行纯化，操作步骤如下：

1)用DEPC水将上述体外转录反应产物的体积调整至100μL，加入350μL RLT缓冲液，混匀，再加入250μL无水乙醇，混匀；

2)将上述混合液加入到RNeasy Mini Spin柱中，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

3)加入700μL RW1缓冲液，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

4)加入500μL RPE缓冲液，10,000rpm，离心15秒，弃滤液，重复该步骤一次；

5)将RNeasy Mini Spin柱置于新的2mL收集管中，13,000rpm，离心1分钟；

6)将RNeasy Mini Spin柱置于新的1.5mL EP管中，向柱中心加入100μL不含RNase的水，室温静置2分钟，13,000rpm，离心1分钟，收集洗脱液。

琼脂糖凝胶电泳分析体外转录获得的RNA模板的纯度后，使用DEPC水进行稀释后，采用Nanodrop分光光度计进行3次测量，保证测量的值在100-300ng/μL之间，取测量的平均值计算各纯化后RNA产物的质量浓度后，采用下列公式，计算各自的拷贝数浓度：

Y(拷贝/μL)＝[X(g/μL)/体外转录RNA的核苷酸长度(nt)×340]×6.02×10²³

5、引物、探针设计

从GenBank数据库中下载已有的寨卡病毒、登革病毒(I～IV型)、基孔肯雅病毒毒株全序列，各病毒序列打包下载后保存为.fasta格式文件，采用Bioedit SequenceAlignment Editor软件ClustalW multiple alignment程序进行序列比对后，分析并获得各种病毒的保守区序列，利用Primer Express软件设计荧光定量RT-PCR引物及TaqMan探针。探针的两端分别采用FAM、HEX、Texas Red荧光基团和相应的BHQ1/BHQ2淬灭基团标记。

5.1TaqMan探针设计原则：

1)先设计探针，后设计引物；

2)要绝对的保守，如有必要，可采用兼并碱基；

3)长度在25-32bp之间，Tm值在68℃-72℃之间，要比引物的Tm值高出10℃；

4)GC含量在30％-80％之间，避免多个重复的碱基出现；

5)5’端碱基不能为G；

6)应尽量靠近与其在同一条链上的引物，两者之间的距离越小越好。

5.2引物设计原则

1)要尽量保守，3’端的5个碱基最好是完全保守；

2)长度一般为18-25bp，Tm值在58℃-60℃之间；

3)扩增产物长度在80-150bp；

4)GC含量在30％-80％之间，避免多个重复的碱基出现；

5)3’端碱基不宜为G或C。

5.3引物和TaqMan探针的评价

1)使用NCBI的Blast功能对各引物和TaqMan探针序列一一进行在线比对，以验证与其他基因有无交叉反应的可能；

2)多重荧光定量RT-PCR同一组合中的各个引物和TaqMan探针之间的相互干扰分析。使用DNAstar软件中的Primer select程序对引物和探针进行评价。选中某一序列，下拉“Report”菜单，分别点击“Primer hairpins”和“Primer self dimers”，分析序列自身的发卡和二聚体结构；选中两条序列，选择“Report”，运行“Primer pair dimmers”，分析序列之间形成的二聚体结构。

6、灵敏性评价

6.1体外转录RNA对PCR反应灵敏性评价

(1)通过体外转录分别获得三种病毒片段的体外转录RNA，分别并将其10倍梯度稀释，共设9个梯度，获得1×10¹⁰拷贝/μL至1×10¹拷贝/μL的病毒体外转录模板。

(2)以1×10⁷拷贝/μL至1×10¹拷贝/μL的体外转录RNA进行实时荧光定量PCR反应，并设置1个空白对照，进行梯度实验，独立重复10次。

(3)计算出三种病毒体外转录RNA的最低检出限，以评价本检测方法的灵敏性。

利用体外转录RNA评价灵敏性：

以浓度为4×10⁸拷贝/μL至4×10⁰拷贝/μL的三种病毒体外转录RNA为模板进行扩增，重复三次，经BIO-RAD CFX96软件分析以体外转录RNA拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值的平均值为纵坐标建立标准曲线，结果显示扩增效率均在90％以上，相关系数均高于0.998。以100％可检出的最低浓度水平作为估计最低检测限，对登革病毒II、登革病毒IV型、寨卡病毒及基孔肯雅病毒均可100％检出20拷贝/反应，对登革病毒I、III型可100％检出200拷贝/反应(图2A～图2D，图3A和图3B)。

6.2病毒核酸对RT-PCR灵敏性评价

(1)通过空斑实验测得寨卡病毒细胞培养物滴度为7.1×10⁸PFU/ml，、登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型滴度分别为2.3×10⁶PFU/ml、1.2×10⁷PFU/ml、6.6×10⁶PFU/ml、3×10⁶PFU/ml，基孔肯雅病毒滴度为4×10⁸PFU/ml。并对三种病毒细胞培养物提取核酸。

(2)将病毒核酸进行10倍稀释，共设7个梯度和1个空白对照。

(3)以稀释所得核酸为模板进行RT-PCR扩增。

利用病毒核酸评价灵敏性：

将已知滴度的三种病毒细胞培养上清进行10倍梯度稀释，共设8个梯度，以核酸稀释倍数对数值为横坐标，以Ct值的平均值为纵坐标建立标准曲线，通过CFX96分析扩增效率均在90％以上，相关系数均高于0.995，线性关系较好。DENVⅠ型病毒核酸建立的标准曲线为Y＝-3.485x+16.630(R²＝0.998)，最低检测限为2PFU/mL；DENV II型的标准曲线为Y＝-3.498x+16.579(R²＝0.998)，最低检测限为9PFU/mL；DENV III型的标准曲线为Y＝-3.518x+12.590(R²＝0.998)，最低检测限为1PFU/mL；DENV IV型建立的标准曲线Y＝-3.559x+16.968(R²＝0.998)，最低检测限为4PFU/mL(图4A～图4D)。ZIKV标准曲线为Y＝-3.407x+10.381(R²＝1.000)，最低检测限为6PFU/mL。CHIKV病毒核酸建立的标准曲线为Y＝-3.509x+8.782(R²＝0.999)，最低检测限为2PFU/mL(图5A和图5B)。

7、特异性评价

(1)核酸提取：用乙型脑炎病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、塞姆利基森林病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、诺如病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒所提取核酸对三重方法进行评价。取以上12种病毒细胞培养物上清进行核酸提取。

(2)PCR扩增：12种病毒核酸各取5μL作为模板加入到PCR反应体系中进行扩增，以寨卡病毒、登革Ⅱ型病毒、基孔肯雅病毒核酸为模板设置阳性对照。

(3)通过Bio-Rad CFX96 PCR仪收集荧光信号判断其他病毒是否有扩增。

使用用乙型脑炎病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、塞姆利基森林病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、诺如病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒核酸对实时荧光RT-PCR技术特异性进行评价，图1结果显示，病毒核酸均无扩增，RT-PCR技术特异性良好。

8、稳定性评价

将DENV四个型别的病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒的细胞培养物上清进行核酸提取，分别以其高、中、低三种浓度梯度为模板，独立重复20次实验，对其稳定性进行评价。结果显示，三种病毒的标准差均控制在0.5以内，变异系数在2％以下，具有较好的稳定性(表2和表3)。

表2登革病毒四个型别对三重实时定量荧光PCR稳定性评价

表3 ZIKV和CHIKV对三重实时定量荧光PCR稳定性评价

9、临床及模拟样本验证

分别采用单重和三重实时荧光定量RT-PCR对来自云南的19份DENV NS1抗原检测阳性的急性期病人血清进行检测。由表4可知，19份样本均为阳性，Ct值介于14.22～37.79之间，其中16号病人血清同时检测出DENV和ZIKV病毒共同发生感染的情况；ZIKV临床模拟标本20份阳性，Ct值介于20.56～35.89之间；对CHIKV模拟标本进行检测，其中19份阳性，Ct值介于18.71～37.98之间，1份阴性；对50份正常人血清进行检测，结果阴性。与单重检测方法比较，检测结果无明显差异(表5)。

表4 2013年云南登革热病人样本验证

表5 ZIKV和CHIKV病人模拟样本验证

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针及试剂盒

<130> KHP191114840.9

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcctgactc cccccgyaga tt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acygtcagtt gractccatt ctc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcragaatgg aaaacatcat gtg 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaagtagag caatatggta catgtg 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggctgtgt catcagcata yat 23

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgcagtcc ttctccttcc actccact 28

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagctycgcg tcctttacca a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaaattgtc cyggtcttcc t 21

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaatgtcyt cmgcctggac accttt 26

<210> 10

<211> 1056

<212> DNA

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 10

gatgtggggt gctcggtgga cttctcaaag aaggagacga gatgcggtac aggggtgttc 60

gtctataacg acgttgaagc ctggagggac aggtacaagt accatcctga ctccccccgt 120

agattggcag cagcagtcaa gcaagcctgg gaagatggta tctgcgggat ctcctctgtt 180

tcaagaatgg aaaacatcat gtggagatca gtagaagggg agctcaatgc aatcctggaa 240

gagaatggag ttcaactgac ggtcgttgtg ggatctgtaa aaaaccccat gtggagaggt 300

ccacagagat tgcccgtgcc tgtgaacgag ctgccccacg gctggaaggc ttgggggaaa 360

tcgtacttcg tcagagcagc aaagacaaat aacagctttg tcgtggatgg tgacacactg 420

aaggaatgcc cactcaaaca tagagcatgg aacagctttc ttgtggagga tcatgggttc 480

ggggtatttc acactagtgt ctggctcaag gttagagaag attattcatt agagtgtgat 540

ccagccgtta ttggaacagc tgttaaggga aaggaggctg tacacagtga tctaggctac 600

tggattgaga gtgagaagaa tgacacatgg aggctgaaga gggcccatct gatcgagatg 660

aaaacatgtg aatggccaaa gtcccacaca ttgtggacag atggaataga agagagtgat 720

ctgatcatac ccaagtcttt agctgggcca ctcagccatc acaataccag agagggctac 780

aggacccaaa tgaaagggcc atggcacagt gaagagcttg aaattcggtt tgaggaatgc 840

ccaggcacta aggtccacgt ggaggaaaca tgtggaacaa gaggaccatc tctgagatca 900

accactgcaa gcggaagggt gatcgaggaa tggtgctgca gagagtgcac aatgccccca 960

ctgtcgttcc gggctaaaga tggctgttgg tatggaatgg agataaggcc caggaaagaa 1020

ccagaaagca acttagtaag gtcagtggtg actgca 1056

<210> 11

<211> 1317

<212> DNA

<213> 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)

<400> 11

tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tctagtcaat 60

agacctggct acagccccat ggtattggag atggaactac tgtcagtcac tttggagcca 120

acactatcgc ttgattacat cacgtgcgag tacaaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg 180

aagtgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac aaaaacctac ctgactacag ctgtaaggtc 240

ttcaccggcg tctacccatt tatgtggggc ggcgcctact gcttctgcga cgctgaaaat 300

acgcagttga gcgaagcaca tgtggagaag tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca 360

gcgtacaggg ctcataccgc atctgcatca gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat 420

aacatcactg taactgccta tgcaaacggc gaccatgccg tcacagttaa ggacgccaaa 480

ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg acacctttcg acaacaaaat tgtggtgtac 540

aaaggtgacg tctataacat ggactacccg ccctttggcg caggaagacc aggacaattt 600

ggcgatatcc aaagtcgcac acctgagagt aaagacgtct atgctaatac acaactggta 660

ctgcagagac cggctgtggg tacagtacac gtgccatact ctcacgcacc atctggcttt 720

aagtattggc taaaagaacg cggggcgcca ctgcagcaca cagcaccatt tggctgccaa 780

atagcaacaa acccggtaag agcggtgaac tgcgccgtag ggaacatgcc catctccatc 840

gacataccgg aagcggcctt cactagggtc gtcgacgcgc cctctttaac ggacatgtcg 900

tgcgaggtac cagcctgcac ccattcctca gactttggtg gcgtcgccat tattaaatat 960

gcagccagca agaaaggcaa gtgtgcggtg cattcgatga ctaacgccgt cactattcgg 1020

gaagctgaga tagaagttga agggaattct cagctgcaaa tctctttctc gacggcctta 1080

gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt tctacacaag tacactgtgc agctgagtgc 1140

caccccccga aggaccacat agtcaactac ccggcgtcac ataccaccct cggggtccag 1200

gacatctccg ctacggcgat gtcatgggtg cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt 1260

gttgctgttg ccgcactgat tctaatcgtg gtgctatgcg tgtcgttcag caggcac 1317

<210> 12

<211> 963

<212> DNA

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 12

acacgactcc atttggacaa cagcgtgttt ttaaagaaaa agtggacacg agaacccaag 60

aaccgaaaga aggcacgaag aaactaatga aaatcacagc agagtggctg tggaaagaac 120

tagggaagaa aaagacacct aggatgtgca ccagagaaga atttacaaga aaggtgagaa 180

gcaatgcagc cttgggggcc atattcactg atgagaacaa gtggaagtcg gcacgtgagg 240

ctgttgaaga tggtaggttt tgggagctgg ttgacaagga aaggaatctc catcttgaag 300

gaaagtgtga gacatgtgtg tacaacatga tgggaaaaag agaaaagaag ctaggggaat 360

ttggcaaggc aaaaggcagc agagccatat ggtacatgtg gcttggagct cgcttcctgg 420

agtttgaagc cctaggattc ctaaatgaag atcactggtt ctctagagag aactccctga 480

gtggagtgga aggagaaggg ctgcacaagc taggttacat tctaagagac gtgagcaaga 540

aagagggagg agccatgtac gccgacgaca cagcaggatg ggacacaaga atcacactag 600

aagacctaaa aaatgaagaa atggtaacaa accacatgga aggagaacac aagaaattgg 660

ccgaggctat tttcaaacta acgtatcaaa acaaggtggt gcgtgtgcaa agaccaacac 720

caagaggcac agtaatggac atcatatcga gaagagacca aagaggtagt gggcaagttg 780

gtacctatgg actcaatact ttcaccaata tggaagctca actaatcaga cagatggagg 840

gagaaggagt ctttaaaaac atccagcacc tgacagttac agaagaagtt gccgtgcaaa 900

actggttggc aagagtgggg cgcgaaaggt tgtcaagaat ggccatcagt ggagatgatt 960

gtg 963

Claims

1.用于检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的三重实时荧光定量PCR引物，其特征在于，

用于检测登革热病毒的引物为：

DENV-F：5′-GGAAGTAGAGCAATATGGTACATGTG-3′

DENV-R：5′-CCGGCTGTGTCATCAGCATAYAT-3′；

用于检测基孔肯雅病毒的引物为：

CHIKV-F：5′-AAGCTYCGCGTCCTTTACCAA-3′

CHIKV-R：5′-CCAAATTGTCCYGGTCTTCCT-3′；

用于检测寨卡病毒的引物为：

ZIKV-F：5′-ATCCTGACTCCCCCCGYAGATT-3′

ZIKV-R：5′-ACYGTCAGTTGRACTCCATTCTC-3′；

其中，Y表示碱基C或T，R表示碱基A或G。

2.与权利要求1所述三重实时荧光定量PCR引物配套使用的探针，其特征在于，

用于检测登革热病毒的探针为：5′-TGTGCAGTCCTTCTCCTTCCACTCCACT-3′；

用于检测基孔肯雅病毒的探针为：5′-CCAATGTCYTCMGCCTGGACACCTTT-3′；

用于检测寨卡病毒的探针为：5′-TCRAGAATGGAAAACATCATGTG-3′；

其中，Y表示碱基C或T，R表示碱基A或G，M表示碱基A或C。

3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。

4.登革热、基孔肯雅及寨卡病毒三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和权利要求2所述探针，还含有逆转录酶、DNA聚合酶、标准阳性模板、反应缓冲液中的至少一种。

5.非诊断目的三重实时荧光定量PCR检测登革热、基孔肯雅及寨卡病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总RNA；

2)配制含有权利要求1所述引物和权利要求2所述探针的PCR反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和PCR扩增反应；

3)分析扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：向反应管中加入缓冲液12.5μl，酶2μl，寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，另加入dNTP至终浓度0.1mM，MgCl₂至终浓度1mM，然后加入RNA模板5μl，最后用DEPC水补齐至25μl体系；混匀后将反应管置于扩增仪中，反应条件为：50℃，30min；95℃ 10min；95℃15s，57～61℃ 45s，45个循环。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有相应的病毒核酸；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有相应病毒核酸，表现为阳性结果；不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到相应病毒核酸，表现为阴性结果。