CN110612347A - 分离基材、细胞分离过滤器及血小板的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种巨核细胞的排斥率高并且血小板的透过率高的分离基材以及使用了该分离基材的细胞分离过滤器及血小板的制造方法。本发明的分离基材由用于从包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液分离血小板的多孔膜构成,其中,分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,分离基材由选自包括聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂的群组中的至少一种树脂构成。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离基材、细胞分离过滤器及血小板的制造方法。
背景技术
血小板为在血栓的形成中发挥中心作用,且在生体内显现止血功能的细胞,因此若出血时或使用抗癌剂时血小板减少,则严重的情况下有时导致死亡。
而且,对血小板的减少的唯一的确定的治疗法为输血血小板制剂。目前的血小板制剂取决于来自志愿者的献血,尽管保存有效期间为4天的极短的天数,随着因少子化而能够献血的年龄层的人口减少及献血需要高的高龄人的人口增加,预测医疗现场中的需要与供给的平衡难以保持。
因此,代替献血的血小板来源的开发备受关注。
近年来,已报导了通过将多能性干细胞、造血祖细胞、间充质细胞等作为来源培养巨核细胞来在体外大量生产血小板的技术。
在该技术中,血小板通过巨核细胞的细胞质被切割而产生,因此在血小板生产后的培养液中含有多个巨核细胞。
因此,从抑制免疫原性的观点考虑,需要分离巨核细胞及从巨核细胞生产的血小板的技术开发。
作为这种分离技术,例如在专利文献1中记载了“一种血小板分离基材,其由用于从包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液分离血小板的多孔体构成,其中,多孔体的流入侧的平均孔径为10μm以上且20μm以下,从流入侧朝向流出侧,平均孔径连续或阶段性地较少,并且流出侧的平均孔径为3μm以上且8μm以下。”([权利要求1])。
以往技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2016-192960号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明人等对专利文献1中所记载的血小板分离基材进行了研究,其结果可知巨核细胞的排斥率(除去率)高,但是明确了血小板的透过率(回收率)低而对巨核细胞与血小板的分离性能存在改善的空间。
因此,本发明的课题在于提供一种巨核细胞的排斥率高并且血小板的透过率高的分离基材以及使用了该分离基材的细胞分离过滤器及血小板的制造方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了实现上述课题而进行了深入研究的结果,发现如下从而完成了本发明,即,关于由多孔膜构成的分离基材,若平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,原材料由聚砜树脂和/或聚偏二氟乙烯树脂构成,则巨核细胞的排斥率高并且血小板的透过率变高。
即,发现了通过以下的结构能够实现上述课题。
[1]一种分离基材,其包含用于从包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液分离血小板的多孔膜,其中
分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,
分离基材由选自包括聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂的群组中的至少一种树脂构成。
[2]如[1]所述的分离基材,其中,分离基材具有孔径从表面朝向厚度的中心方向连续或不连续地变小的孔径分布。
[3]如[1]所述的分离基材,其中,分离基材的表面被亲水性高分子或亲水性基修饰。
[4]一种细胞分离过滤器,其具备:
容器,配置有第1通液口及第2通液口;及
过滤材料,填充于第1通液口及第2通液口之间,该细胞分离过滤器中,
过滤材料为[1]至[3]中任一项所述的分离基材。
[5]一种血小板的制造方法,其具有:
接触步骤,使至少包含巨核细胞的培养液与[1]至[3]中任一项所述的分离基材接触;
培养步骤,在接触步骤之前及之后的至少一者中,培养巨核细胞而产生血小板;及
回收步骤,在接触步骤及培养步骤之后,回收含有所产生的血小板的培养液。
发明效果
通过本发明,能够提供一种巨核细胞的排斥率高并且血小板的透过率高的分离基材以及使用了该分离基材的细胞分离过滤器及血小板的制造方法。
具体实施方式
以下,对本发明进行了详细的说明。
以下所记载的构成要件的说明为根据本发明的代表性的实施方式而完成的,但是本发明并不限定于这种实施方式。
另外,在本说明书中,用“~”来表示的数值范围是指将记载于“~”前后的数值作为下限值及上限值而包括的范围。
通常,分离基材是指在多个内部具有较小的孔隙的结构体,例如可举出由纤维结构体、多孔膜、滚珠填充管柱及这些积层体构成。
其中,纤维结构体是指缠结纤维而成为一个结构,例如可举出织物(网状物(mesh))、编物、辫子、不织布及将纤维填充到管柱中等,其中,从宽的孔径分布、复杂的流路、制作容易性的方面考虑,尤其优选不织布。并且,作为不织布的制法,例如可举出干式法、湿式法、纺粘法、熔喷法、静电纺丝法、针刺法等,其中,从生产性及通用性的方面考虑,优选为湿式法及熔喷法、静电纺丝法。
多孔膜是指在整个塑胶体具有多个连通孔,作为制法可举出相分离法、发泡法、照射放射线或激光等的蚀刻法、成孔法、冷冻干燥法、塑胶焼结法等,但是从宽的孔径分布、复杂的流路、制作容易性的方面考虑,尤其优选使用了相分离法的多孔膜。
滚珠填充管柱是指通过在管柱内填充滚珠而在滚珠之间形成孔隙。滚珠的粒径期望为均匀,通过滚珠的粒径将滚珠之间的孔隙设为孔径而容易控制。
[分离基材]
本发明的分离基材为由用于从包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液分离血小板的多孔膜构成的分离基材。
并且,本发明的分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,优选为2.0μm以上且9.0μm以下。
并且,本发明的分离基材由选自包括聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂的群组中的至少一种树脂构成,优选至少由聚砜树脂构成。
其中,本说明书中,“平均孔径”是指在使用了perm-porometer(SeikaCorporation制CFE-1200AEX)的细孔径分布测量试验中,相对于在GALWICK(PorousMaterials,Inc制)中完全润湿的样品的空气压以2cc/min增大而进行了评价的值。
具体而言,相对于在GALWICK中完全润湿的膜状样品,在膜的一侧以2cc/min规定量送入空气,一边测量其压力,一边测量向与膜的相反的一侧透过的空气的流量。
在该方法中,首先关于在GALWICK中润湿的膜状样品,得到了压力与透气流量的资料(以下,也称为“湿曲线”。)。接着,对与未润湿的干燥状态的膜状样品相同的资料(以下,也称为“干曲线”。)进行了测量,并求出相当于干曲线的流量的一半的曲线(半干曲线)与湿曲线的交点的压力。之后,将GALWICK的表面张力(γ)、与基材的接触角(θ)及空气压(P)导入到下述式(I),能够计算平均孔径。
平均孔径=4γcosθ/P……(I)
本发明的分离基材如上所述,平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,且由聚砜树脂和/或聚偏二氟乙烯树脂构成,因此巨核细胞的排斥率高、并且血小板的透过率变高。
发挥这种效果的理由的详细虽不明确,但是本发明人等如以下那样推测。
即,从后述的实施例1~3与比较例1~4的对比,认为通过分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,阻止巨核细胞的透过,并能够使血小板透过。
并且,从后述的比较例5~9的结果,认为即使分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,也由不符合聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂的树脂材料构成,则评价较差,因此本发明中,构成分离基材的聚砜树脂和/或聚偏二氟乙烯树脂容易吸附巨核细胞,并且具有血小板难以吸附的性质。
本发明的分离基材的厚度优选为10.0μm以上且500.0μm以下,更优选为50.0μm以上且500.0μm以下,更优选为100.0μm以上且300.0μm以下。
其中,本说明书中,“厚度”是指使用测微仪(Mitutoyo Corporation制)在10处测量离基材的膜厚,并将各测量值进行平均的值。
本发明中,从巨核细胞与血小板的分离性能更加提高的理由,优选分离基材具有孔径从表面朝向厚度的中心方向连续或不连续地变小的孔径分布。
其中,本说明书中,“孔径分布”是指如以下那样测量的分布。
首先,使甲醇浸渍于分离基材,在液状氮中使其冷冻。
接着,通过超薄切片机(Leica公司制EM UC6)从经冷冻的分离基材切出作为截面观察用切片,使用扫描型电子显微镜(Scanning Electron Microscope:SEM)〔HitachiHigh-Technologies Corporation制SU8030型FE-SEM〕进行拍摄。另外,SEM撮影的倍率以3000倍进行。
其中,通过超薄切片机进行切出,从分离基材的其中一者的表面侧沿厚度方向切割成10份,用数字仪追踪所得到的各切片的孔,求出各切片的50个孔的平均孔径。但是,关于孔较大而无法测量50个的切片,仅对该切片中取得的数量进行测量。
接着,从其中一者的表面至另一表面为止依序绘出求出的各切片的平均孔径,求出膜的厚度方向的平均孔径的分布。
并且,本发明中,聚砜树脂和/或聚偏二氟乙烯树脂的数平均分子量(Mn)并无特别限定,优选为1,000~10,000,000,更优选为5,000~1,000,000。
另外,本说明书中,“数平均分子量”为通过凝胶渗透色谱(GPC)法在以下的条件下进行测量。
·装置名:HLC-8220GPC(Tosoh Corporation)
·管柱的种类:TSK gel Super HZ4000及HZ2000(Tosoh Corporation)
·洗脱液:二甲基甲酰胺(DMF)
·流量:1ml/分钟
·检测器:RI
·试样浓度:0.5%
·标准曲线基础树脂:TSK标准聚苯乙烯(分子量1050、5970、18100、37900、190000、706000)
本发明中,从抑制血小板在分离基材上的吸附,且血小板的回收率更加提高的理由,优选分离基材通过使与包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液接触的部分的全部或一部分修饰亲水性高分子或亲水性基而被亲水化。
其中,本说明书中,“亲水性高分子”及“亲水性基”分别是指能够将使用其修饰的表面的水的静态接触角设为80°以下的高分子及官能基。并且,“修饰”是指不仅包含亲水性高分子或亲水性基与分离基材的表面化学键结的情况,也包含基于疏水性相互作用等的物理性吸附等的概念。作为亲水性高分子,优选在侧链具有亲水性基的聚合物,例如可举出2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、乙二醇、甲基丙烯酸甲酯、羟基乙基甲基丙烯酸酯、乙烯醇、N-乙烯-2-吡咯烷酮、磺基甜菜碱单体的聚合物等。
并且,作为亲水性基,具体而言,例如可举出羟基、醚基、硝基、亚胺基、羰基、磷酸基、甲氧基二乙二醇基、甲氧基三乙二醇基、乙氧基二乙二醇基、乙氧基三乙二醇基、胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、羧基、磷酰基、磷酸胆碱基、硫酸基或这些的盐等。
基于亲水性高分子或亲水性基的修饰方法并无特别限定,可举出电浆处理、电晕处理、UV(紫外线)臭氧处理、火焰处理等亲水化处理,通过这些处理,在分离基材的表面导入羟基等亲水基,并能够将分离基材的表面进行亲水化。
并且,亲水性高分子、亲水性基及其修饰方法,能够利用WO87/005812、日本特开平4-152952、日本特开平5-194243、WO2010/113632等中所记载的材料及方法。
本发明的分离基材除了包含聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂以外,还包含其他成分作为添加剂。
作为上述添加剂,具体而言,例如能够举出食盐、氯化锂、硝酸钠、硝酸钾、硫酸钠、氯化锌等无机酸的金属盐;乙酸钠、甲酸钠等有机酸的金属盐;聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等高分子;聚苯乙烯磺酸钠、聚乙烯二苯乙二酮三甲基氯化铵等高分子电解质;二辛基琥珀酸钠、烷基甲基牛磺酸钠等离子系界面活性剂;等。
并且,本发明的分离基材可以是由多个层构成的多孔质膜,优选为一层的多孔质膜。
〔制造方法〕
本发明的分离基材(多孔膜)的制造方法并无特别限定,能够利用通常的聚合物膜形成方法。
作为聚合物膜形成方法,可举出延伸法及流延法等。例如,能够通过流延法中调节用于制膜原液的溶剂的种类及量或流延后的干燥方法来制作具有上述的平均孔径的多孔膜。
基于流延法的多孔膜的制造例如能够由依次包含以下(1)~(4)的方法进行。
(1)将包含聚砜树脂和/或聚偏二氟乙烯树脂(以下,在多孔膜的制造方法的说明中也简称为“聚合物”。)、也可以根据需要添加上述的添加剂、以及也可以根据需要使用的任意的溶剂的制膜原液以溶解状态流延于支撑体上。
(2)在流延的液膜的表面施加调温湿风。
(3)将施加调温湿风之后得到的膜浸渍于凝固液中。
(4)根据需要剥离支撑体。
调温湿风的温度优选为4℃~60℃,更优选为10℃~40℃。
调温湿风的相对湿度优选为30%~70%,更优选为40%~50%。
调温湿风的绝对湿度优选为1.2~605g/kg空气,更优选为2.4~30.0g/kg空气。
调温湿风优选以0.1m/秒钟~10m/秒钟的风速施加0.1秒钟~30秒钟,更优选施加1秒钟~10秒钟。
致密部位的平均孔径及位置能够通过包含于调温湿风中的水分浓度、施加调温湿风的时间来控制。另外,致密部位的平均孔径也能够通过制膜原液中的水分含量来控制。
如上述,通过在液膜的表面施加调温湿风,进行溶剂的蒸发的控制,能够从液膜的表面朝向内部引起凝聚。
在该状态下,对用于制膜原液的溶剂具有相溶性,并且浸渍于容纳相对于聚合物的溶解性低的溶剂的凝固液,由此使上述凝聚相固定而设为微细孔,也能够形成除了微细孔以外的细孔。
在浸渍于上述凝固液的过程中,凝固液的温度优选为-10℃~80℃。通过该期间内使温度变化,调节从更靠致密部位的支撑体面侧中的凝聚相的形成至到达凝固为止的时间,并能够控制到达支撑体面侧为止的孔径的大小。
另外,若提高凝固液的温度,则凝聚相的形成提前,到达凝固为止的时间变长,因此朝向支撑体面侧的孔径容易变大。另一方面,若降低凝固液的温度,则凝聚相的形成推迟而到达凝固为止的时间变短,因此朝向支撑体面侧的孔径难以变大。
作为支撑体,使用塑胶薄膜或玻璃板即可。作为塑胶薄膜的材料的例,可举出聚对酞酸乙二酯(PET)等聚酯;聚碳酸酯;丙烯酸树脂;环氧树脂;聚胺酯;聚酰胺;聚烯烃;纤维素衍生物;聚硅氧;等。
作为支撑体,优选PET或玻璃板,更优选PET。
制膜原液也可以含有溶剂。溶剂根据所使用的聚合物,利用所使用的聚合物的溶解性高的溶剂(以下,也简称为“良溶剂”。)即可。
良溶剂优选为溶剂浸渍于凝固液的情况下迅速地与凝固液进行取代。
作为溶剂的例,聚合物为聚砜的情况下,可举出N-甲基-2-吡咯烷酮、二氧杂环乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或这些混合溶剂,聚合物为聚偏二氟乙烯树脂的情况下,可举出N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四甲基尿素、二甲基亚砜、磷酸三甲基或这些混合溶剂。
制膜原液除了使用良溶剂以外,还优选使用聚合物的溶解性虽低但是对聚合物的溶剂具有相溶性的溶剂(以下,也简称为“非溶剂”。)。
作为非溶剂,可举出水、溶纤剂类、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃、聚乙二醇、丙三醇等。这些中,优选使用水。
作为制膜原液的聚合物浓度优选为5质量%以上且35质量%以下,更优选为10质量%以上且30质量%以下。
通过聚合物浓度为35质量%以下,能够对得到的多孔膜赋予充分的透过性,通过设为5质量%以上,能够担保选择性地透过物质的多孔膜的形成。
并且,上述的任意添加剂的添加量只要通过添加不损害制膜原液的均匀性,就无特别限定,但是通常相对于溶剂为0.5容量%以上且10容量%以下。
并且,制膜原液含有非溶剂及良溶剂的情况下,若非溶剂相对于良溶剂的比例在混合液保持均匀状态的范围,则并无特别限制,但优选为1.0质量%~50质量%,更优选为2.0质量%~30质量%,进一步优选为3.0质量%~10质量%。
作为凝固液,优选利用所使用的聚合物的溶解度低的溶剂。
作为这种溶剂的例,可举出水、甲醇、乙醇、丁醇等醇类;乙二醇、二乙二醇等二醇类;醚、正己烷、正庚烷等脂肪族烃类;丙三醇等丙三醇类等。
作为优选的凝固液的例,可举出水、醇类或这些两种以上的混合物。这些中,优选使用水。
还优选浸渍于凝固液上之后,通过与所使用的凝固液不同的溶剂进行清洗。
清洗能够通过浸渍于溶剂来进行。
作为清洗溶剂,优选为二乙二醇。作为清洗溶剂,能够通过使用二乙二醇,调节浸渍薄膜的二乙二醇的温度及浸渍时间中的任一个或这两者来调整多孔质膜中的N元素的分布。尤其,在多孔膜的制膜原液中使用聚乙烯吡咯烷酮作为添加剂的情况下,能够控制在聚乙烯吡咯烷酮的膜上的残量。二乙二醇之后,还可以通过水进行清洗。
作为多孔膜的制膜原液,优选将聚砜及聚乙烯吡咯烷酮溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮并添加水而成的制膜原液。
关于多孔膜的制造方法,能够参考日本特开平4-349927号公报、日本特公平4-068966号公报、日本特开平04-351645号公报、日本特开2010-235808号公报等。
〔细胞悬浊液〕
使用本发明的分离基材供于血小板的分离的细胞悬浊液为包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液。
其中,巨核细胞及血小板并无特别限定,例如可举出从成体组织采取的巨核细胞及血小板;从具有多能性干细胞、造血祖细胞及间充质细胞等分化能的细胞分化的巨核细胞及血小板;在通常的方法中在不具有巨核细胞上的分化能的细胞通过使用直接重新编程技术制作的巨核细胞及血小板;组合这些的巨核细胞及血小板;等。
作为多能性干细胞,例如可举出胚性干细胞〔ES(embryonic stem)细胞〕、核移植胚性干细胞〔nt(nuclear transfer)ES细胞〕及人工多能性干细胞〔iPS(inducedpluripotent stem)细胞〕等,其中,优选人工多能性干细胞(iPS细胞)。
作为造血祖细胞,例如可举出来自于骨髄、来自于脐帯血、动员〔G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor,颗粒性白血球群落刺激因子)〕末梢血、来自于ES细胞的中肺叶系细胞及来自于末梢血的细胞等,但是并不限定于这些。作为这些造血祖细胞,例如可举出分化抗原群(cluster of differentiation:CD)34阳性(例如,CD34+细胞、CD133+细胞、SP细胞、CD34+CD38-细胞、c-kit+细胞或者CD3-、CD4-、CD8-及CD34+细胞)(国际公开WO2004/110139)。
作为间充质细胞,例如可举出间充质干细胞、脂肪祖细胞、骨髄细胞、脂肪细胞及滑膜细胞等,其中,优选脂肪祖细胞。
在通常的方法中,作为不具有在巨核细胞上的分化能的细胞,例如可举出纤维芽细胞等,但是并不限定于这些。
[细胞分离过滤器]
本发明的细胞分离过滤器具备:容器,配置有第1通液口及第2通液口;及过滤材料,填充于第1通液口及第2通液口之间,其中在过滤材料中使用了上述的本发明的分离基材。
细胞分离过滤器中所使用的容器的形态、大小、材质并无特别限定。
作为容器的形态,例如可以为球、容器、盒状、袋状、管状、管柱状等、任意的形态。
作为容器的型(类型),也能够使用横向类型及管柱状类型中的任一个类型。
[血小板的制造方法]
本发明的血小板的制造方法具有:
接触步骤,使至少包含巨核细胞的培养液与上述的本发明的分离基材接触;
培养步骤,在接触步骤之前和/或之后,培养巨核细胞而产生血小板;及
回收步骤,在接触步骤及培养步骤之后,回收包含所产生的血小板的培养液。
其中,接触步骤中的接触机构能够根据培养液的量及巨核细胞的浓度等来适当选择,但是例如可举出在填充有本发明的分离基材的塔或管柱等供给细胞悬浊液的方法等。
并且,培养步骤中的产生血小板的方法,例如可举出通过流体加载剪切应力的方法,具体而言可举出搅拌包含巨核细胞的培养液的方法等。另外,培养步骤中培养的巨核细胞可以为在接触步骤之后具有培养步骤的情况下通过本发明的分离基材中补充的巨核细胞。并且,认为接触步骤之后具有培养步骤的情况下如后述的实施例那样使包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液与分离基材接触时在初期阶段补充的巨核细胞,通过基于之后接触的细胞悬浊液(即流体)的负荷,也产生血小板。
并且,作为回收步骤中的回收方法,例如可举出在填充有本发明的分离基材的塔或管柱状等使包含所产生的血小板的培养液通液的方法等。
实施例
以下,根据实施例对本发明进行进一步详细的说明。以下的实施例中所示的材料、使用量、比例、处理内容、处理步骤等只要不脱离本发明的宗旨,则能够适当变更。然而,本发明的范围并非为被以下所示的实施例限定地解释。
〔实施例1〕
<多孔膜>
将聚砜(P3500、Amoco公司制)15质量份、聚乙烯吡咯烷酮15质量份、氯化锂2质量份及水1.2质量份溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮66.8质量份,从而得到了制膜用混合物。
在PET薄膜表面以厚度200μm流延该混合物。
接着,在上述流延的液膜表面以2m/sec施加5秒钟的调节成25℃、绝对湿度7.8g/kgAir的空气。
之后,直接浸渍于装满水的温度40℃的凝固液槽。
接着,剥离PET之后,以2m/sec,置于25℃的二乙二醇浴中120秒钟,之后通过纯水充分清洗,从而制作了多孔膜。
<巨核细胞及血小板>
培养基:向RPMI1640(Life Technologies公司)450ml添加牛血清(LifeTechnologies公司)50ml而使用。
巨核细胞:将MEG-01(ATCC公司)用作巨核细胞。将其与培养基混合,由此制备了巨核细胞液(6×105细胞/ml)。
血小板悬浊液:将从鼠末梢血单离的用作血小板。具体而言,在装入有柠檬酸-葡萄糖溶液(ACD)(sigma-aldrich公司)的15ml离心分离用锥形管状(Falcon公司)回收了从鼠采血的全血10ml。在300×g、室温下进行7分钟离心,回收了离心后的Plasma层及Bufffycoat层。相同地对回收液进行离心分离,仅回收了Plasma层之后,在1800×g、室温下进行5分钟离心,回收上清液,由此测到了血小板。将其与培养基进行混合,由此制备了血小板悬浊液(6×107细胞/ml)。
等量混合巨核细胞液及血小板悬浊液,由此制备了细胞悬浊液。
<细胞分离试验>
使用过滤模组(ADVANTEC公司,KS-47)的供给侧的其中一者的流通口与包含细胞悬浊液的50ml注射器(TERUMO CORPORATION)管连接的过滤模组进行了膜分离处理。将注射器设置于注射器泵(HARVARD APPARATUS公司、PHD ULTRA 4400)运行注射器泵,以3ml/min.的流量,细胞悬浊液30ml以相对于设置于过滤模组内的分离基材直行的固定端方式供给。回收了从过滤模组的透过侧的排出口排出的滤液。
<回收细胞数的计数>
向从过滤模组的透过侧采取的滤液100μl添加加入了核染色剂即Hoechst33342(DOJINDO LABORATORIES制)的Dulbecco的磷酸缓冲食盐水(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline:DPBS)〔Thermo Fisher Scientific公司制〕10μl,在遮光环境下反应了15分钟。加入300μl的DPBS,使用BD Trucount tubes(Becton,Dickinson and Company制),通过流式细胞术(FACS Aria)进行了测量。
从前方散射光(Forward scatter:FSC)及侧方散射光(Side scatter:SSC)栅极确定了巨核细胞成分及血小板成分。将血小板成分中的核染色阴性细胞作为血小板,将巨核细胞成分中的核染色阳性细胞作为巨核细胞,由此计算了回收液中的血小板数及巨核细胞数。
将从以下式得到的血小板透过率及巨核细胞排斥率示于表1中。
血小板透过率(%)=(滤液中的血小板数/元液中的血小板数)×100
巨核细胞排斥率(%)=100-(滤液中的巨核细胞数/元液中的巨核细胞数)×100
<评价(分离的判定)>
作为分离的总合判定,由以下基准进行了评价。将结果示于下述表1中。
A:血小板透过率为80%以上并且巨核细胞排斥率95%以上
B:血小板透过率为80%以上并且巨核细胞排斥率90%以上
或、血小板透过率为70%以上并且巨核细胞排斥率95%以上
C:血小板透过率小于70%或巨核细胞排斥率小于90%
〔实施例2及比较例1~3〕
制作多孔膜时,变更包含于调温湿风中的水分浓度、施加调温湿风的时间,制作了表示下述表1所示的平均孔径及厚度的多孔膜,除此以外,通过与实施例1相同的方法制作分离基材并进行了评价。将结果示于表1。
〔实施例3〕
使用亲水性聚偏二氟乙烯制多孔膜(SVLP04700、Merck KGaA,Darmstadt,Germany制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
〔比较例4〕
使用亲水性聚偏二氟乙烯制多孔膜(DVPP04700、Merck KGaA,Darmstadt,Germany制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
〔比较例5〕
使用亲水性聚四氟乙烯制多孔膜(Merck KGaA,Darmstadt,Germany制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
〔比较例6〕
使用聚碳酸酯制多孔膜(Merck KGaA,Darmstadt,Germany制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
〔比较例7〕
使用乙酸纤维素制多孔膜(ADVANTEC制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
〔比较例8〕
使用乙酸纤维素/亚硝基纤维素制多孔膜(A300A047A、ADVANTEC制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
〔比较例9〕
使用乙酸纤维素/亚硝基纤维素制多孔膜(A500A047A、ADVANTEC制),通过与实施例1相同的方法进行了评价。将结果示于表1。
[表1]
从表1所示的结果,可知使用了由平均孔径小于2.0μm的多孔膜构成的分离基材的情况下,血小板的透过率变低(比较例1、2及4)。
并且,可知使用了由平均孔径大于12.0μm的多孔膜构成的分离基材的情况下,巨核细胞的排斥率变低(比较例3)。
另外,可知即使分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,原材料未由选自包括聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂的群组中的至少一种树脂构成的情况下,血小板的透过率及巨核细胞的排斥率中的任一个变低(比较例5~9)。
相对于此,可知分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,原材料由选自包括聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂的群组中的至少一种树脂构成的情况下,巨核细胞的排斥率变高并且血小板的透过率变高(实施例1~3)。
Claims (5)
1.一种分离基材,其包含用于从包含巨核细胞及血小板的细胞悬浊液分离血小板的多孔膜,
所述分离基材的平均孔径为2.0μm以上且12.0μm以下,
所述分离基材由选自由聚砜树脂及聚偏二氟乙烯树脂组成的组中的至少一种树脂构成。
2.根据权利要求1所述的分离基材,其中,
所述分离基材具有孔径从表面朝向厚度的中心方向连续或不连续地变小的孔径分布。
3.根据权利要求1所述的分离基材,其中,
所述分离基材的表面被亲水性高分子或亲水性基修饰。
4.一种细胞分离过滤器,其具备:
容器,配置有第1通液口及第2通液口;及
过滤材料,填充于所述第1通液口及所述第2通液口之间,
所述过滤材料为权利要求1至3中任一项所述的分离基材。
5.一种血小板的制造方法,其具有:
接触步骤,使权利要求1至3中任一项所述的分离基材接触至少包含巨核细胞的培养液;
培养步骤,在所述接触步骤之前及之后的至少一者中,培养巨核细胞而产生血小板;及
回收步骤,在所述接触步骤及所述培养步骤之后,回收含有所产生的血小板的培养液。
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