TW201900866A - 分離基材、細胞分離過濾器及血小板之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種巨核細胞的排斥率高並且血小板的透過率高的分離基材以及使用了該分離基材之細胞分離過濾器及血小板之製造方法。本發明的分離基材由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液分離血小板之多孔膜構成，其中，分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，分離基材由選自包括聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之群組中之至少一種樹脂構成。
Description
本發明涉及一種分離基材、細胞分離過濾器及血小板之製造方法。
血小板係在血栓的形成中發揮中心作用，且在生體內顯現止血功能之細胞，因此若出血時或使用抗癌劑時血小板減少，則嚴重的情況下有時導致死亡。 而且，對血小板的減少之唯一的確定之治療法係輸血血小板製劑。目前的血小板製劑取決於來自志願者的獻血，儘管保存有效期間為4天之極短的天數，隨著因少子化而能夠獻血的年齡層的人口減少及獻血需要高之高齡人的人口增加，預測醫療現場中的需要與供給的平衡難以保持。 因此，代替獻血之血小板來源的開發備受關注。
近年來，已報導了藉由將多能性乾細胞、造血祖細胞、間充質細胞等作為來源培養巨核細胞來在體外大量生產血小板之技術。 在該技術中，血小板藉由巨核細胞的細胞質被切割而產生，因此在血小板生產後的培養液中含有複數個巨核細胞。 因此，從抑制免疫原性之觀點考慮，需要分離巨核細胞及從巨核細胞生產之血小板之技術開發。
作為該種分離技術，例如在專利文獻1中記載了“一種血小板分離基材，其由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液分離血小板之多孔體構成，其中，多孔體的流入側的平均孔徑係10 μm以上且20 μm以下，從流入側朝向流出側，平均孔徑連續或階段性地較少，並且流出側的平均孔徑係3 μm以上且8 μm以下。”（[申請專利範圍1]）。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2016-192960號公報
本發明人等對專利文獻1中所記載之血小板分離基材進行了研究，其結果可知巨核細胞的排斥率（除去率）高，但是明確了血小板的透過率（回收率）低而對巨核細胞與血小板的分離性能存在改善的空間。
因此，本發明的課題在於提供一種巨核細胞的排斥率高並且血小板的透過率高的分離基材以及使用了該分離基材之細胞分離過濾器及血小板之製造方法。
本發明人等為了實現上述課題而進行了深入研究的結果，發現如下從而完成了本發明，亦即，關於由多孔膜構成之分離基材，若平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，原材料由聚碸樹脂和/或聚偏二氟乙烯樹脂構成，則巨核細胞的排斥率高並且血小板的透過率變高。 亦即，發現了藉由以下的結構能夠實現上述課題。
[1]一種分離基材，其由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液分離血小板之多孔膜構成，其中 分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下， 分離基材由選自包括聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之群組中之至少一種樹脂構成。 [2]如[1]所述之分離基材，其中分離基材具有孔徑從表面朝向厚度的中心方向連續或不連續地變小之孔徑分佈。 [3]如[1]所述之分離基材，其中分離基材的表面藉由親水性高分子或親水性基來改質。
[4]一種細胞分離過濾器，其具備： 容器，配置有第1通液口及第2通液口；及 過濾材料，填充於第1通液口及第2通液口之間，該細胞分離過濾器中， 過濾材料係[1]至[3]中任一項所述之分離基材。 [5]一種血小板之製造方法，其具有： 接觸步驟，使至少包含巨核細胞之培養液與[1]至[3]中任一項所述之分離基材接觸； 培養步驟，在接觸步驟之前及之後的至少一者中，培養巨核細胞而產生血小板；及 回收步驟，在接觸步驟及培養步驟之後，回收含有所產生之血小板之培養液。 [發明效果]
藉由本發明，能夠提供一種巨核細胞的排斥率高並且血小板的透過率高的分離基材以及使用了該分離基材之細胞分離過濾器及血小板之製造方法。
以下，對本發明進行了詳細的說明。 以下所記載之構成要件的說明係根據本發明的代表性的實施態樣而完成者，但是本發明並不限定於該種實施態樣。 另外，在本說明書中，用“～”來表示之數值範圍係指將記載於“～”前後之數值作為下限值及上限值而包括之範圍。
通常，分離基材係指在複數個內部具有較小的孔隙之結構體，例如可舉出由纖維結構體、多孔膜、滾珠填充管柱及該等積層體構成者。 其中，纖維結構體係指纏結纖維而成為一個結構者，例如可舉出織物（網狀物（mesh））、編物、辮子、不織布及將纖維填充到管柱中者等，其中，從寬的孔徑分佈、複雜的流路、製作容易性的方面考慮，尤其不織布為較佳。又，作為不織布的製法，例如可舉出乾式法、濕式法、紡黏法、熔噴法、靜電紡絲法、針刺法等，其中，從生產性及通用性的方面考慮，濕式法及熔噴法、靜電紡絲法為較佳。 多孔膜係指在整個塑膠體具有多個連通孔者，作為製法可舉出相分離法、發泡法、照射放射線或雷射光等之蝕刻法、成孔法、冷凍乾燥法、塑膠燒結法等，但是從寬的孔徑分佈、複雜的流路、製作容易性的方面考慮，尤其使用了相分離法之多孔膜為較佳。 滾珠填充管柱係指藉由在管柱內填充滾珠而在滾珠之間形成孔隙者。滾珠的粒徑期望為均勻者，藉由滾珠的粒徑將滾珠之間的孔隙設為孔徑而容易控制。
[分離基材] 本發明的分離基材係由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液分離血小板之多孔膜構成之分離基材。 又，本發明的分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，2.0 μm以上且9.0 μm以下為較佳。 又，本發明的分離基材由選自包括聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之群組中之至少一種樹脂構成，至少由聚碸樹脂構成為較佳。
其中，本說明書中，“平均孔徑”係指在使用了perm-porometer（Seika Corporation製 CFE-1200AEX）之細孔徑分佈測量試驗中，相對於在GALWICK（Porous Materials,Inc製）中完全潤濕之樣品的空氣壓以2 cc/min增大而進行了評價之值。 具體而言，相對於在GALWICK中完全潤濕之膜狀樣品，在膜的一側以2 cc/min規定量送入空氣，一邊測量其壓力，一邊測量向與膜的相反的一側透過之空氣的流量。 在該方法中，首先關於在GALWICK中潤濕之膜狀樣品，得到了壓力與透氣流量的資料（以下，亦稱為“濕曲線”。）。接著，對與未潤濕之乾燥狀態的膜狀樣品相同的資料（以下，亦稱為“乾曲線”。）進行了測量，並求出相當於乾曲線的流量的一半之曲線（半乾曲線）與濕曲線的交點的壓力。之後，將GALWICK的表面張力（γ）、與基材的接觸角（θ）及空氣壓（P）導入到下述式（I），能夠計算平均孔徑。 平均孔徑=4γcosθ/P……（I）
本發明的分離基材如上所述，平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，且由聚碸樹脂和/或聚偏二氟乙烯樹脂構成，因此巨核細胞的排斥率高、並且血小板的透過率變高。 發揮該種效果之理由的詳細雖不明確，但是本發明人等如以下那樣推測。 亦即，從後述之實施例1～3與比較例1～4的對比，認為藉由分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，阻止巨核細胞的透過，並能夠使血小板透過。 又，從後述之比較例5～9的結果，認為即使分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，亦由不符合聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之樹脂材料構成，則評價較差，因此本發明中，構成分離基材之聚碸樹脂和/或聚偏二氟乙烯樹脂容易吸附巨核細胞，並且具有血小板難以吸附之性質。
本發明的分離基材的厚度係10.0 μm以上且500.0 μm以下為較佳，50.0 μm以上且500.0 μm以下為較佳，100.0 μm以上且300.0 μm以下為更佳。 其中，本說明書中，“厚度”係指使用測微儀（Mitutoyo Corporation製）在10處測量離基材的膜厚，並將各測量值進行平均之值。
本發明中，從巨核細胞與血小板的分離性能更加提高之理由，分離基材具有孔徑從表面朝向厚度的中心方向連續或不連續地變小之孔徑分佈為較佳。 其中，本說明書中，“孔徑分佈”係指如以下那樣測量之分佈。 首先，使甲醇浸漬於分離基材，在液狀氮中使其冷凍。 接著，藉由超薄切片機（Leica公司製 EM UC6）從經冷凍之分離基材切出作為截面觀察用切片，使用掃描型電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope：SEM）[Hitachi High-Technologies Corporation製 SU8030型FE-SEM]進行拍攝。另外，SEM撮影的倍率以3000倍進行。 其中，藉由超薄切片機進行切出，從分離基材的其中一者的表面側沿厚度方向切割成10份，用數字儀追蹤所得到之各切片的孔，求出各切片的50個孔的平均孔徑。但是，關於孔較大而無法測量50個之切片，僅對該切片中取得之數量進行測量。 接著，從其中一者的表面至另一表面為止依序繪出求出之各切片的平均孔徑，求出膜的厚度方向的平均孔徑的分佈。
又，本發明中，聚碸樹脂和/或聚偏二氟乙烯樹脂的數平均分子量（Mn）並無特別限定，1,000～10,000,000為較佳，5,000～1,000,000為更佳。 另外，本說明書中，“數平均分子量”係藉由凝膠滲透色譜（GPC）法在以下的條件下進行測量者。 ・裝置名： HLC-8220GPC（Tosoh Corporation） ・管柱的種類：TSK gel Super HZ4000及HZ2000（Tosoh Corporation） ・洗脫液：二甲基甲醯胺（DMF） ・流量：1 ml/分鐘 ・檢測器：RI ・試樣濃度：0.5% ・標準曲線基礎樹脂：TSK標準聚苯乙烯（分子量1050、5970、18100、37900、190000、706000）
本發明中，從抑制血小板在分離基材上的吸附，且血小板的回收率更加提高之理由，分離基材藉由與包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液接觸之部分的全部或一部分對親水性高分子或親水性基進行改質而被親水化為較佳。 其中，本說明書中，“親水性高分子”及“親水性基”分別係指能夠將使用其改質之表面的水的靜態接觸角設為80°以下之高分子及官能基。又，“改質”係指不僅包含親水性高分子或親水性基與分離基材的表面化學鍵結之情況，亦包含基於疏水性相互作用等之物理性吸附等之概念。作為親水性高分子，在側鏈具有親水性基之聚合物為較佳，例如可舉出2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼、乙二醇、甲基丙烯酸甲酯、羥基乙基甲基丙烯酸酯、乙烯醇、N-乙烯-2-吡咯烷酮、磺基甜菜鹼單體的聚合物等。 又，作為親水性基，具體而言，例如可舉出羥基、醚基、硝基、亞胺基、羰基、磷酸基、甲氧基二乙二醇基、甲氧基三乙二醇基、乙氧基二乙二醇基、乙氧基三乙二醇基、胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、羧基、磷醯基、磷酸膽鹼基、硫酸基或該等的鹽等。 基於親水性高分子或親水性基之改質方法並無特別限定，可舉出電漿處理、電暈處理、UV（紫外線）臭氧處理、火焰處理等親水化處理，藉由該等處理，在分離基材的表面導入羥基等親水基，並能夠將分離基材的表面進行親水化。 又，親水性高分子、親水性基及其改質方法，能夠利用WO87/05812、日本特開平4-152952、日本特開平5-194243、WO2010/113632等中所記載的材料及方法。
本發明的分離基材除了包含聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂以外，還包含其他成分作為添加劑。 作為上述添加劑，具體而言，例如能夠舉出食鹽、氯化鋰、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸鈉、氯化鋅等無機酸的金屬鹽；乙酸鈉、甲酸鈉等有機酸的金屬鹽；聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等高分子；聚苯乙烯磺酸鈉、聚乙烯二苯乙二酮三甲基氯化銨等高分子電解質；二辛基琥珀酸鈉、烷基甲基牛磺酸鈉等離子系界面活性劑；等。
又，本發明的分離基材可以是由複數個層構成之多孔質膜，但是一層的多孔質膜為較佳。
[製造方法] 本發明的分離基材（多孔膜）之製造方法並無特別限定，能夠利用通常的聚合物膜形成方法。 作為聚合物膜形成方法，可舉出延伸法及流延法等。例如，能夠藉由流延法中調節用於製膜原液之溶劑的種類及量或流延後的乾燥方法來製作具有上述之平均孔徑之多孔膜。
基於流延法之多孔膜的製造例如能夠由依次包含以下（1）～（4）之方法進行。 （1）將包含聚碸樹脂和/或聚偏二氟乙烯樹脂（以下，在多孔膜之製造方法的說明中亦簡稱為“聚合物”。）、亦可以依據需要添加之上述之添加劑、以及亦可以依據需要使用之任意的溶劑之製膜原液以溶解狀態流延於支撐體上。 （2）在流延之液膜的表面施加調溫濕風。 （3）將施加調溫濕風之後得到之膜浸漬於凝固液中。 （4）依據需要剝離支撐體。
調溫濕風的溫度在4℃～60℃為較佳，10℃～40℃為更佳。 調溫濕風的相對濕度係30%～70%為較佳，40%～50%為更佳。 溫濕風的絕對濕度係1.2～605 g/kg空氣為較佳，2.4～30.0 g/kg空氣為更佳。 調溫濕風以0.1 m/秒鐘～10 m/秒鐘的風速施加0.1秒鐘～30秒鐘為較佳，施加1秒鐘～10秒鐘為更佳。 緻密部位的平均孔徑及位置能夠藉由包含於調溫濕風中之水分濃度、施加調溫濕風之時間來控制。另外，緻密部位的平均孔徑亦能夠藉由製膜原液中的水分含量來控制。
如上述，藉由在液膜的表面施加調溫濕風，進行溶劑的蒸發的控制，能夠從液膜的表面朝向內部引起凝聚。 在該狀態下，對用於製膜原液之溶劑具有相溶性，並且浸漬於收容相對於聚合物之溶解性低之溶劑之凝固液，藉此使上述凝聚相固定而設為微細孔，亦能夠形成除了微細孔以外的細孔。
在浸漬於上述凝固液之過程中，凝固液的溫度需-10℃～80℃為較佳。藉由該期間內使溫度變化，調節從更靠緻密部位的支撐體面側中的凝聚相的形成至到達凝固為止的時間，並能夠控制到達支撐體面側為止的孔徑的大小。 另外，若提高凝固液的溫度，則凝聚相的形成提前，到達凝固為止的時間變長，因此朝向支撐體面側之孔徑容易變大。另一方面，若降低凝固液的溫度，則凝聚相的形成推遲而到達凝固為止的時間變短，因此朝向支撐體面側之孔徑難以變大。
作為支撐體，使用塑膠薄膜或玻璃板即可。作為塑膠薄膜的材料的例，可舉出聚對酞酸乙二酯（PET）等聚酯；聚碳酸酯；丙烯酸樹脂；環氧樹脂；聚胺酯；聚醯胺；聚烯烴；纖維素衍生物；聚矽氧；等。 作為支撐體，PET或玻璃板為較佳，PET為更佳。
製膜原液亦可以含有溶劑。溶劑依據所使用之聚合物，利用所使用之聚合物的溶解性高的溶劑（以下，亦簡稱為“良溶劑”。）即可。 良溶劑係溶劑浸漬於凝固液之情況下迅速地與凝固液進行取代者為較佳。 作為溶劑的例，聚合物係聚碸的情況下，可舉出N-甲基-2-吡咯烷酮、二氧雜環乙烷、四氫呋喃、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺或該等混合溶劑，聚合物係聚偏二氟乙烯樹脂的情況下，可舉出N-甲基-2-吡咯烷酮、四氫呋喃、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、四甲基尿素、二甲基亞碸、磷酸三甲基或該等混合溶劑。
製膜原液除了使用良溶劑以外，還使用聚合物的溶解性雖低但是對聚合物的溶劑具有相溶性之溶劑（以下，亦簡稱為“非溶劑”。）為較佳。 作為非溶劑，可舉出水、溶纖劑類、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃、聚乙二醇、丙三醇等。該等中，使用水為較佳。
作為製膜原液的聚合物濃度係5質量%以上且35質量%以下為較佳，10質量%以上且30質量%以下為更佳。 藉由聚合物濃度係35質量%以下，能夠對得到之多孔膜賦予充分的透過性，藉由設為5質量%以上，能夠擔保選擇性地透過物質之多孔膜的形成。 又，上述之任意添加劑的添加量只要藉由添加不損害製膜原液的均勻性，就無特別限定，但是通常相對於溶劑係0.5容量%以上且10容量%以下。 又，製膜原液含有非溶劑及良溶劑之情況下，若非溶劑相對於良溶劑之比例在混合液保持均勻狀態之範圍，則並無特別限制，但是1.0質量%～50質量%為較佳，2.0質量%～30質量%為更佳，3.0質量%～10質量%為進一步較佳。
作為凝固液，利用所使用之聚合物的溶解度低的溶劑為較佳。 作為該種溶劑的例，可舉出水、甲醇、乙醇、丁醇等醇類；乙二醇、二乙二醇等二醇類；醚、正己烷、正庚烷等脂肪族烴類；丙三醇等丙三醇類等。 作為較佳的凝固液的例，可舉出水、醇類或該等兩種以上的混合物。該等中，使用水為較佳。
浸漬於凝固液上之後，藉由與所使用之凝固液不同之溶劑進行清洗亦為較佳。 清洗能夠藉由浸漬於溶劑來進行。 作為清洗溶劑，二乙二醇為較佳。作為清洗溶劑，能夠藉由使用二乙二醇，調節浸漬薄膜之二乙二醇的溫度及浸漬時間中的任一個或這兩者來調整多孔質膜中的N元素的分佈。尤其，在多孔膜的製膜原液中使用聚乙烯吡咯烷酮作為添加劑之情況下，能夠控制在聚乙烯吡咯烷酮的膜上的殘量。二乙二醇之後，還可以藉由水進行清洗。
作為多孔膜的製膜原液，係將聚碸及聚乙烯吡咯烷酮溶解於N-甲基-2-吡咯烷酮並添加水而成之製膜原液為較佳。 關於多孔膜之製造方法，能夠參閱日本特開平4-349927號公報、日本特公平4-68966號公報、日本特開平04-351645號公報、日本特開2010-235808號公報等。
[細胞懸濁液] 使用本發明的分離基材供於血小板的分離之細胞懸濁液係包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液。 其中，巨核細胞及血小板並無特別限定，例如可舉出從成體組織採取之巨核細胞及血小板；從具有多能性乾細胞、造血祖細胞及間充質細胞等分化能之細胞分化之巨核細胞及血小板；在通常的方法中在不具有巨核細胞上的分化能之細胞藉由使用直接重新編程技術製作之巨核細胞及血小板；組合該等之巨核細胞及血小板；等。
作為多能性乾細胞，例如可舉出胚性乾細胞[ES（embryonic stem）細胞]、核移植胚性乾細胞[nt（nuclear transfer）ES細胞]及人工多能性乾細胞[iPS（induced pluripotent stem）細胞]等，其中，人工多能性乾細胞（iPS細胞）為較佳。 作為造血祖細胞，例如可舉出來自於骨髓、來自於臍帶血、動員[G-CSF（Granulocyte-colony stimulating factor，顆粒性白血球群落刺激因子）]末梢血、來自於ES細胞的中肺葉系細胞及來自於末梢血的細胞等，但是並不限定於該等。作為該等造血祖細胞，例如可舉出分化抗原群（cluster of differentiation：CD）34陽性者（例如，CD34+細胞、CD133+細胞、SP細胞、CD34+CD38-細胞、c-kit+細胞或者CD3-、CD4-、CD8-及CD34+細胞者）（國際公開WO2004/110139）。 作為間充質細胞，例如可舉出間充質乾細胞、脂肪祖細胞、骨髓細胞、脂肪細胞及滑膜細胞等，其中，脂肪祖細胞為較佳。 在通常的方法中，作為不具有在巨核細胞上的分化能之細胞，例如可舉出纖維芽細胞等，但是並不限定於該等。
[細胞分離過濾器] 本發明的細胞分離過濾器具備：容器，配置有第1通液口及第2通液口；及過濾材料，填充於第1通液口及第2通液口之間，其中在過濾材料中使用了上述之本發明的分離基材。
細胞分離過濾器中所使用之容器的形態、大小、材質並無特別限定。 作為容器的形態，例如可以為球、容器、盒狀、袋狀、管狀、管柱狀等、任意的形態。 作為容器的型（類型），亦能夠使用橫向類型及管柱狀類型中的任一個類型。
[血小板之製造方法] 本發明的血小板之製造方法具有： 接觸步驟，使至少包含巨核細胞之培養液與上述之本發明的分離基材接觸； 培養步驟，在接觸步驟之前和/或之後，培養巨核細胞而產生血小板；及 回收步驟，在接觸步驟及培養步驟之後，回收包含所產生之血小板之培養液。 其中，接觸步驟中的接觸機構能夠依據培養液的量及巨核細胞的濃度等來適當選擇，但是例如可舉出在填充有本發明的分離基材之塔或管柱等供給細胞懸濁液之方法等。 又，培養步驟中的產生血小板之方法，例如可舉出藉由流體加載剪切應力之方法，具體而言可舉出攪拌包含巨核細胞之培養液之方法等。另外，培養步驟中培養之巨核細胞可以為在接觸步驟之後具有培養步驟之情況下藉由本發明的分離基材中補充之巨核細胞。又，認為接觸步驟之後具有培養步驟之情況下如後述之實施例那樣使包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液與分離基材接觸時在初期階段補充之巨核細胞，藉由基於之後接觸之細胞懸濁液（亦即流體）之負荷，亦產生血小板。 又，作為回收步驟中的回收方法，例如可舉出在填充有本發明的分離基材之塔或管柱狀等使包含所產生之血小板之培養液通液之方法等。 [實施例]
以下，根據實施例對本發明進行進一步詳細的說明。以下的實施例中所示之材料、使用量、比例、處理內容、處理步驟等只要不脫離本發明的宗旨，則能夠適當變更。然而，本發明的範圍並非係被以下所示之實施例限定地解釋者。
[實施例1] ＜多孔膜＞ 將聚碸（P3500、Amoco公司製）15質量份、聚乙烯吡咯烷酮15質量份、氯化鋰2質量份及水1.2質量份溶解於N-甲基-2-吡咯烷酮66.8質量份，從而得到了製膜用混合物。 在PET薄膜表面以厚度200 μm流延該混合物。 接著，在上述流延之液膜表面以2 m/sec施加5秒鐘的調節成25℃、絕對濕度7.8 g/kgAir之空氣。 之後，直接浸漬於裝滿水之溫度40℃的凝固液槽。 接著，剝離PET之後，以2 m/sec，置於25℃的二乙二醇浴中120秒鐘，之後藉由純水充分清洗，從而製作了多孔膜。
＜巨核細胞及血小板＞ 培養基：向RPMI1640（Life Technologies公司）450 ml添加牛血清（Life Technologies公司）50 ml而使用。 巨核細胞：將MEG-01（ATCC公司）用作巨核細胞。將其與培養基混合，藉此製備了巨核細胞液（6×105cells/ml）。 血小板懸濁液：將從鼠末梢血單離者用作血小板。具體而言，在裝入有檸檬酸-葡萄糖溶液（ACD）（sigma-aldrich公司）之15 ml離心分離用錐形管狀（Falcon公司）回收了從鼠採血之全血10 ml。在300×g、室溫下進行7分鐘離心，回收了離心後的Plasma層及Bufffy coat層。相同地對回收液進行離心分離，僅回收了Plasma層之後，在1800×g、室溫下進行5分鐘離心，回收上清液，藉此測到了血小板。將其與培養基進行混合，藉此製備了血小板懸濁液（6×107
cells/ml）。 等量混合巨核細胞液及血小板懸濁液，藉此製備了細胞懸濁液。
＜細胞分離試驗＞ 使用過濾模組（ADVANTEC公司，KS-47）的供給側的其中一者的流通口與包含細胞懸濁液之50 ml注射器（TERUMO CORPORATION）管連接之過濾模組進行了膜分離處理。將注射器設置於注射器泵（HARVARD APPARATUS公司､PHD ULTRA 4400）運行注射器泵，以3 ml/min.的流量，細胞懸濁液30 ml以相對於設置於過濾模組內之分離基材直行之固定端方式供給。回收了從過濾模組的透過側的排出口排出之濾液。
＜回收細胞數的計數＞ 向從過濾模組的透過側採取之濾液100 μl添加加入了核染色劑亦即Hoechst33342（DOJINDO LABORATORIES製）之Dulbecco的磷酸緩衝食鹽水（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline：DPBS）[Thermo Fisher Scientific公司製]10 μl，在遮光環境下反應了15分鐘。加入300 μl的DPBS，使用BD Trucount tubes（Becton, Dickinson and Company製），藉由流式細胞術（FACS Aria）進行了測量。 從前方散射光（Forward scatter：FSC）及側方散射光（Side scatter：SSC）柵極確定了巨核細胞成分及血小板成分。將血小板成分中的核染色陰性細胞作為血小板，將巨核細胞成分中的核染色陽性細胞作為巨核細胞，藉此計算了回收液中的血小板數及巨核細胞數。 將從以下式得到之血小板透過率及巨核細胞排斥率示於表1中。 血小板透過率（%）=（濾液中的血小板數/元液中的血小板數）×100 巨核細胞排斥率（%）=100-（濾液中的巨核細胞數/元液中的巨核細胞數）×100
＜評價（分離的判定）＞ 作為分離的總合判定，由以下基準進行了評價。將結果示於下述表1中。 A：血小板透過率係80%以上並且巨核細胞排斥率95%以上 B：血小板透過率係80%以上並且巨核細胞排斥率90%以上 或、血小板透過率係70%以上並且巨核細胞排斥率95%以上 C：血小板透過率小於70%或巨核細胞排斥率小於90%
[實施例2及比較例1～3] 製作多孔膜時，變更包含於調溫濕風中之水分濃度、施加調溫濕風之時間，製作了表示下述表1所示之平均孔徑及厚度之多孔膜，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作分離基材並進行了評價。將結果示於表1。
[實施例3] 使用親水性聚偏二氟乙烯製多孔膜（SVLP04700、Merck KGaA, Darmstadt, Germany製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[比較例4] 使用親水性聚偏二氟乙烯製多孔膜（DVPP04700、Merck KGaA, Darmstadt, Germany製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[比較例5] 使用親水性聚四氟乙烯製多孔膜（Merck KGaA, Darmstadt, Germany製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[比較例6] 使用聚碳酸酯製多孔膜（Merck KGaA, Darmstadt, Germany製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[比較例7] 使用乙酸纖維素製多孔膜（ADVANTEC製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[比較例8] 使用乙酸纖維素/亞硝基纖維素製多孔膜（A300A047A、ADVANTEC製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[比較例9] 使用乙酸纖維素/亞硝基纖維素製多孔膜（A500A047A、ADVANTEC製），藉由與實施例1相同的方法進行了評價。將結果示於表1。
[表1]
從表1所示之結果，可知使用了由平均孔徑小於2.0 μm的多孔膜構成之分離基材之情況下，血小板的透過率變低（比較例1、2及4）。 又，可知使用了由平均孔徑大於12.0 μm之多孔膜構成之分離基材之情況下，巨核細胞的排斥率變低（比較例3）。 另外，可知即使分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，原材料未由選自包括聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之群組中之至少一種樹脂構成之情況下，血小板的透過率及巨核細胞的排斥率中的任一個變低（比較例5～9）。
相對於此，可知分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下，原材料由選自包括聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之群組中之至少一種樹脂構成之情況下，巨核細胞的排斥率變高並且血小板的透過率變高（實施例1～3）。
Claims (5)
- 一種分離基材，其由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液分離血小板之多孔膜構成，其中， 該分離基材的平均孔徑係2.0 μm以上且12.0 μm以下， 該分離基材由選自包括聚碸樹脂及聚偏二氟乙烯樹脂之群組中之至少一種樹脂構成。
- 如申請專利範圍第1項所述之分離基材，其中 該分離基材具有孔徑從表面朝向厚度的中心方向連續或不連續地變小之孔徑分佈。
- 如申請專利範圍第1項所述之分離基材，其中 該分離基材的表面藉由親水性高分子或親水性基來改質。
- 一種細胞分離過濾器，其具備： 容器，配置有第1通液口及第2通液口；及 過濾材料，填充於該第1通液口及該第2通液口之間，該細胞分離過濾器中， 該過濾材料係申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之分離基材。
- 一種血小板之製造方法，其具有： 接觸步驟，使至少包含巨核細胞之培養液與申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之分離基材接觸； 培養步驟，在該接觸步驟之前及之後的至少一者中，培養巨核細胞而產生血小板；及 回收步驟，在該接觸步驟及該培養步驟之後，回收含有所產生之血小板之培養液。
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