JPWO2018207565A1 - 分離基材、細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高い分離基材ならびにそれを用いた細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法を提供することを課題とする。本発明の分離基材は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔膜からなる分離基材であって、分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、分離基材が、ポリスルホン樹脂、および、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、分離基材である。

Description

本発明は、分離基材、細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法に関する。

血小板は血栓の形成に中心的な役割を果たし、生体内において止血機能を示す細胞であるため、出血の際や抗がん剤を使用した際に血小板が減少すると、重篤な場合には死に至ることがある。
そして、血小板の減少に対する唯一の確立された治療法は、血小板製剤を輸血することである。現行の血小板製剤は、ボランティアからの献血に依存しており、保存有効期間が４日という極めて短い日数であるのにも関わらず、少子化による献血可能年齢層の人口減少および献血需要の高い高齢者の人口増加に伴い、医療現場における需要と供給のバランスを保つことが困難になると予想されている。
そのため、献血に代替される血小板ソースの開発が着目されている。

近年、多能性幹細胞、造血前駆細胞、間葉系細胞などをソースとして、巨核球を培養することによって血小板を体外で大量に生産する技術が報告されている。
この技術では、巨核球の細胞質が千切れることによって血小板が生産されるため、血小板生産後の培養液には、多数の巨核球が含まれることになる。
そのため、免疫原性を抑制する観点から、巨核球と巨核球から生産された血小板を分離する技術開発が必要となる。

このような分離技術として、例えば、特許文献１には、「巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔質体からなる分離基材であって、多孔質体は、流入側における平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下であり、流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的または段階的に減少するとともに、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下である血小板分離基材。」が記載されている（［請求項１］）。

特開２０１６−１９２９６０号公報

本発明者らは、特許文献１に記載された血小板分離基材について検討したところ、巨核球の阻止率（除去率）は高いことが分かったが、血小板の透過率（回収率）が低く、巨核球と血小板との分離性能に改善の余地があることを明らかとした。

そこで、本発明は、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高い分離基材ならびにそれを用いた細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、多孔膜からなる分離基材について、平均孔径が２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、素材がポリスルホン樹脂および／またはポリフッ化ビニリデン樹脂で構成されていると、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高くなることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

［１］ 巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔膜からなる分離基材であって、
分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、
分離基材が、ポリスルホン樹脂、および、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、分離基材。
［２］ 分離基材が、表面から厚みの中心方向に向かって孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布を有する、［１］に記載の分離基材。
［３］ 分離基材の表面が、親水性高分子または親水性基によって修飾されている、［１］に記載の分離基材。

［４］ 第１通液口および第２通液口が配置された容器と、第１通液口および第２通液口の間に充填されたろ材を備えた細胞分離フィルターであって、
ろ材が、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離基材である、細胞分離フィルター。
［５］ ［１］〜［３］のいずれかに記載の分離基材に、少なくとも巨核球を含む培養液を接触させる接触工程と、
接触工程の前および後の少なくとも一方において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程と、
接触工程および培養工程の後に、産生した血小板を含む培養液を回収する回収工程とを有する、血小板の製造方法。

本発明によれば、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高い分離基材ならびにそれを用いた細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法を提供することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。

一般に、分離基材とは、小さな空隙を多数内部に有する構造体であり、例えば、繊維構造体、多孔膜、ビーズ充填カラムおよびこれらの積層体から構成されるものが挙げられる。
ここで、繊維構造体とは、繊維が絡み合って１つの構造をなしているものであり、例えば、織物（メッシュ）、編物、組紐、不織布、および、繊維をカラムに充填したものなどが挙げられ、中でも、広い孔径分布、複雑な流路、作製の容易性の点から特に不織布が好ましい。また、不織布の製法としては、例えば、乾式法、湿式法、スパンボンド法、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、ニードルパンチ法などが挙げられ、中でも、生産性と汎用性の点から、湿式法とメルトブロー法、エレクトロスピニング法が好ましい。
多孔膜とは、プラスチック体の全体に無数の連通孔を有するものであり、製法としては相分離法、発泡法、放射線やレーザー光などを照射するエッチング法、ポロジェン法、凍結乾燥法、プラスチック焼結法などが挙げられるが、広い孔径分布、複雑な流路、作製の容易性の点から特に相分離法を用いた多孔膜が好ましい。
ビーズ充填カラムとは、カラム内にビーズを充填させることでビーズ間に空隙を形成したものである。ビーズの粒径は均一であるものが望ましく、ビーズの粒径によってビーズ間の空隙を孔径として制御し易い。

［分離基材］
本発明の分離基材は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔膜からなる分離基材である。
また、本発明の分離基材の平均孔径は、２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、２．０μｍ以上９．０μｍ以下であることが好ましい。
また、本発明の分離基材は、ポリスルホン樹脂、および、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されており、少なくともポリスルホン樹脂で構成されていることが好ましい。

ここで、本明細書において、「平均孔径」とは、パームポロメータ（西華産業製 ＣＦＥ−１２００ＡＥＸ）を用いた細孔径分布測定試験において、ＧＡＬＷＩＣＫ（Porous Materials，Inc社製）に完全に濡らしたサンプルに対して空気圧を２ｃｃ／ｍｉｎで増大させて評価した値をいう。
具体的には、ＧＡＬＷＩＣＫに完全に濡らした膜状サンプルに対して、膜の片側に２ｃｃ／ｍｉｎで空気を一定量送り込み、その圧力を測りながら、膜の反対側へ透過してくる空気の流量を測定する。
この方法で、まず、ＧＡＬＷＩＣＫに濡れた膜状サンプルについて、圧力と透過空気流量とのデータ（以下、「ウェットカーブ」ともいう。）を得る。次いで、濡れていない、乾燥状態の膜状サンプルでも同様のデータ（以下、「ドライカーブ」ともいう。）を測定し、ドライカーブの流量の半分に相当する曲線（ハーフドライカーブ）とウェットカーブとの交点の圧力を求める。その後、ＧＡＬＷＩＣＫの表面張力（γ）、基材との接触角（θ）および空気圧（Ｐ）とを下記式（Ｉ）に導入し、平均孔径を算出することができる。
平均孔径＝４γｃｏｓθ／Ｐ ・・・（Ｉ）

本発明の分離基材は、上述した通り、平均孔径が２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、ポリスルホン樹脂および／またはポリフッ化ビニリデン樹脂で構成されているため、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高くなる。
このような効果を奏する理由は詳細には明らかではないが、本発明者らは以下のように推測している。
すなわち、後述する実施例１〜３と比較例１〜４との対比から、分離基材の平均孔径が２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であることにより、巨核球の透過を阻止し、血小板を透過させることが可能となったと考えられる。
また、後述する比較例５〜９の結果から、分離基材の平均孔径が２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であっても、ポリスルホン樹脂およびポリフッ化ビニリデン樹脂に該当しない樹脂材料で構成されていると評価が劣るため、本発明においては、分離基材を構成するポリスルホン樹脂および／またはポリフッ化ビニリデン樹脂は、巨核球が吸着しやすく、かつ、血小板が吸着し難い性質を有していると考えられる。

本発明の分離基材の厚みは、１０．０μｍ以上５００．０μｍ以下であることが好ましく、５０．０μｍ以上５００．０μｍ以下であることが好ましく、１００．０μｍ以上３００．０μｍ以下であることがより好ましい。
ここで、本明細書において、「厚み」とは、マイクロメータ（ミツトヨ製）を用いて分離基材の膜厚を１０か所で測定し、各測定値を平均した値をいう。

本発明においては、巨核球と血小板との分離性能がより向上する理由から、分離基材が、表面から厚みの中心方向に向かって孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布を有していることが好ましい。
ここで、本明細書において、「孔径分布」は、以下のようにして測定した分布をいう。
まず、分離基材にメタノールを含浸させ、液体窒素中で凍結させる。
次いで、凍結させた分離基材から、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製 ＥＭ ＵＣ６）で断面観察用の切片として切り出し、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ）〔日立ハイテクノロジーズ社製 ＳＵ８０３０型ＦＥ−ＳＥＭ〕を用いて撮影する。なお、ＳＥＭ撮影の倍率は、３０００倍で行う。
ここで、ミクロトームによる切り出しは、分離基材の一方の表面側から厚み方向に１０分割し、得られた各切片の孔をデジタイザーでなぞり、各切片の５０個の孔の平均孔径を求める。ただし、孔が大きく、５０個測定できない切片については、その切片でとれる数だけ測定する。
次いで、求めた各切片の平均孔径を、一方の表面から他方の表面まで順番にプロットし、膜の厚み方向の平均孔径の分布を求める。

また、本発明においては、ポリスルホン樹脂および／またはポリフッ化ビニリデン樹脂の数平均分子量（Ｍｎ）は特に限定されず、１，０００〜１０，０００，０００であることが好ましく、５，０００〜１，０００，０００であることがより好ましい。
なお、本明細書において、「数平均分子量」は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）法により以下の条件で測定したものである。
・装置名： ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ（東ソー）
・カラムの種類：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＨＺ４０００およびＨＺ２０００（東ソー）
・溶離液：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
・流量：１ｍｌ／分
・検出器：ＲＩ
・試料濃度：０．５％
・検量線ベース樹脂：ＴＳＫ標準ポリスチレン（分子量１０５０、５９７０、１８１００、３７９００、１９００００、７０６０００）

本発明においては、分離基材への血小板の吸着を抑制し、血小板の回収率がより向上する理由から、分離基材は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液と接触する部分の全部または一部が親水性高分子または親水性基を修飾することで親水化されていることが好ましい。
ここで、本明細書において、「親水性高分子」および「親水性基」は、それぞれ、それを用いて修飾した表面の水の静的接触角を８０°以下とすることができる高分子および官能基をいう。また、「修飾」とは、分離基材の表面に親水性高分子または親水性基が化学結合している場合だけでなく、疎水性相互作用などによる物理的な吸着なども含む概念をいう。
親水性高分子としては、側鎖に親水性基を有する重合体であることが好ましく、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、エチレングリコール、メタクリル酸メチル、ハイドロキシエチルメタクリレート、ビニルアルコール、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、スルホベタインモノマーの重合体等が挙げられる。
また、親水性基としては、具体的には、例えば、水酸基、エーテル基、ニトロ基、イミノ基、カルボニル基、リン酸基、メトキシジエチレングリコール基、メトキシトリエチレングリコール基、エトキシジエチレングリコール基、エトキシトリエチレングリコール基、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、カルボキシル基、ホスホリル基、ホスホリルコリン基、スルホン基、または、これらの塩などが挙げられる。
親水性高分子または親水性基による修飾方法は特に限定されず、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ（紫外線）オゾン処理、火炎処理等の親水化処理が挙げられ、これらの処理によって分離基材の表面に、水酸基等の親水基を導入し、分離基材の表面を親水化することができる。
また、親水性高分子、親水性基およびその修飾方法としては、ＷＯ８７／０５８１２、特開平４−１５２９５２、特開平５−１９４２４３、ＷＯ２０１０／１１３６３２等に記載の材料および方法を利用できる。

本発明の分離基材は、ポリスルホン樹脂およびポリフッ化ビニリデン樹脂以外に、他の成分を添加剤として含んでいてもよい。
上記添加剤としては、具体的には、例えば、食塩、塩化リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、塩化亜鉛等の無機酸の金属塩；酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム等の有機酸の金属塩；ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の高分子；ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド等の高分子電解質；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルメチルタウリン酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤；などを挙げることができる。

また、本発明の分離基材は、複数層からなる多孔質膜であってもよいが、一層の多孔質膜であることが好ましい。

〔製造方法〕
本発明の分離基材（多孔膜）の製造方法は特に限定されず、通常のポリマー膜形成方法を利用することができる。
ポリマー膜形成方法としては、延伸法および流延法などが挙げられる。例えば、流延法においては、製膜原液に用いる溶媒の種類および量や流延後の乾燥方法を調節することにより上述した平均孔径を有する多孔膜を作製することができる。

流延法による多孔膜の製造は、例えば、以下（１）〜（４）をこの順で含む方法で行なうことができる。
（１）ポリスルホン樹脂および／またはポリフッ化ビニリデン樹脂（以下、多孔膜の製造方法の説明においては「ポリマー」とも略す。）、必要に応じて添加してもよい上述した添加剤、ならびに、必要に応じて用いてもよい任意の溶媒を含む製膜原液を溶解状態で支持体上に流延する。
（２）流延された液膜の表面に調温湿風を当てる。
（３）調温湿風を当てた後に得られる膜を凝固液に浸漬する。
（４）必要に応じて支持体を剥離する。

調温湿風の温度は、４℃〜６０℃であることが好ましく、１０℃〜４０℃であることがより好ましい。
調温湿風の相対湿度は、３０％〜７０％であることが好ましく、４０％〜５０％であることがより好ましい。
温湿風の絶対湿度は、１．２〜６０５ｇ／ｋｇ空気であることが好ましく、２．４〜３０．０ｇ／ｋｇ空気であることがより好ましい。
調温湿風は、０.１ｍ／秒〜１０ｍ／秒の風速で、０.１秒間〜３０秒間当てることが好ましく、１秒間〜１０秒間当てることがより好ましい。
緻密部位の平均孔径および位置は、調温湿風中に含まれる水分濃度、調温湿風を当てる時間によって制御することができる。なお、緻密部位の平均孔径は、製膜原液中の含有水分量によっても制御することができる。

上記のように液膜の表面に調温湿風を当てることによって、溶媒の蒸発の制御を行い、液膜の表面から内部に向かってコアセルベーションを起こすことができる。
この状態で、製膜原液に用いた溶媒に相溶性を有し、かつ、ポリマーに対する溶解性の低い溶媒を収容する凝固液に浸漬することによって、上記のコアセルベーション相を微細孔として固定させ微細孔以外の細孔も形成することができる。

上記の凝固液に浸漬する過程において凝固液の温度は、−１０℃〜８０℃であることが好ましい。この間で温度を変化させることによって、緻密部位より支持体面側におけるコアセルベーション相の形成から凝固に至るまでの時間を調節し、支持体面側に至るまでの孔径の大きさを制御することが可能である。
なお、凝固液の温度を高くすると、コアセルベーション相の形成が早くなり、凝固に至るまでの時間が長くなるため、支持体面側へ向かう孔径は大きくなりやすい。一方、凝固液の温度を低くすると、コアセルベーション相の形成が遅くなり凝固に至るまでの時間が短くなるため、支持体面側へ向かう孔径は大きくなりにくい。

支持体としては、プラスチックフィルムまたはガラス板を用いればよい。プラスチックフィルムの材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などのポリエステル；ポリカーボネート；アクリル樹脂；エポキシ樹脂；ポリウレタン；ポリアミド；ポリオレフィン；セルロース誘導体；シリコーン；などが挙げられる。
支持体としては、ＰＥＴまたはガラス板が好ましく、ＰＥＴがより好ましい。

製膜原液は、溶媒を含んでいてもよい。溶媒は使用するポリマーに応じて、使用するポリマーの溶解性が高い溶媒（以下、「良溶媒」とも略す。）を用いればよい。
良溶媒は、溶媒は凝固液に浸漬した場合速やかに凝固液と置換されるものが好ましい。
溶媒の例としては、ポリマーがポリスルホンの場合、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがポリフッ化ビニリデン樹脂の場合、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、ジメチルスルホオキシド、リン酸トリメチルあるいはこれらの混合溶媒が挙げられる。

製膜原液は良溶媒のほか、ポリマーの溶解性が低いがポリマーの溶媒に相溶性を有する溶媒（以下、「非溶媒」とも略す。）を用いることが好ましい。
非溶媒としては、水、セルソルブ類、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。これらのうち、水を用いることが好ましい。

製膜原液としてのポリマー濃度は、５質量％以上３５質量％以下であることが好ましく、１０質量％以上３０質量％以下であることがより好ましい。
ポリマー濃度が３５質量％以下であることにより、得られる多孔膜に十分な透過性を与えることができ、５質量％以上とすることにより。選択的に物質を透過する多孔膜の形成を担保することができる。
また、上述した任意の添加剤の添加量は、添加によって製膜原液の均一性が失われることがない限り特に限定されないが、通常、溶媒に対して０．５容量％以上１０容量％以下である。
また、製膜原液が、非溶媒と良溶媒とを含む場合、非溶媒の良溶媒に対する割合は、混合液が均一状態を保てる範囲であれば特に制限はないが、１．０質量％〜５０質量％が好ましく、２．０質量％〜３０質量％がより好ましく、３．０質量％〜１０質量％がさらに好ましい。

凝固液としては、用いられるポリマーの溶解度が低い溶媒を用いることが好ましい。
このような溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコール、ジエチレングリコールなどのグリコール類；エーテル、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；グリセリン等のグリセロール類などが挙げられる。
好ましい凝固液の例としては、水、アルコール類またはこれらの２種以上の混合物が挙げられる。これらのうち、水を用いることが好ましい。

凝固液への浸漬の後、使用した凝固液とは異なる溶媒で洗浄を行なうことも好ましい。
洗浄は、溶媒に浸漬することにより行なうことができる。
洗浄溶媒としてはジエチレングリコールが好ましい。洗浄溶媒としてジエチレングリコールを用い、フィルムを浸漬するジエチレングリコールの温度および浸漬時間のいずれか一方または双方を調節することにより、多孔質膜中のＮ元素の分布を調節できる。特に、多孔膜の製膜原液に、添加剤としてポリビニルピロリドンを用いる場合において、ポリビニルピロリドンの膜への残量を制御することができる。ジエチレングリコールでの後さらに、水で洗浄してもよい。

多孔膜の製膜原液としては、ポリスルホンおよびポリビニルピロリドンをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解して水を加えてなる製膜原液が好ましい。
多孔膜の製造方法については、特開平４−３４９９２７号公報、特公平４−６８９６６号公報、特開平０４−３５１６４５号公報、特開２０１０−２３５８０８号公報等を参照することができる。

〔細胞懸濁液〕
本発明の分離基材を用いて血小板の分離に供する細胞懸濁液は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液である。
ここで、巨核球および血小板は特に限定されず、例えば、成体組織から採取した巨核球および血小板；多能性幹細胞、造血前駆細胞および間葉系細胞等の分化能を有する細胞から分化させた巨核球および血小板；通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで作製された巨核球および血小板；これらを組み合わせた巨核球および血小板；などが挙げられる。

多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞〔ＥＳ（embryonic stem）細胞〕、核移植胚性幹細胞〔ｎｔ（nuclear transfer）ＥＳ細胞〕、および、人工多能性幹細胞〔ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞〕などが挙げられ、なかでも、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好ましい。
造血前駆細胞としては、例えば、骨髄由来、臍帯血由来、動員〔Ｇ−ＣＳＦ（Granulocyte-colony stimulating factor）〕末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞および末梢血由来細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの造血前駆細胞としては、例えば、分化抗原群（cluster of differentiation：ＣＤ）３４陽性のもの（例えば、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−およびＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる（国際公開ＷＯ２００４／１１０１３９）。
間葉系細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、骨髄細胞、脂肪細胞および滑膜細胞などが挙げられ、なかでも、脂肪前駆細胞が好ましい。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞としては、例えば、繊維芽細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

［細胞分離フィルター］
本発明の細胞分離フィルターは、第１通液口および第２通液口が配置された容器と、第１通液口および第２通液口の間に充填されたろ材を備えた細胞分離フィルターであって、ろ材に上述した本発明の分離基材を用いた細胞分離フィルターである。

細胞分離フィルターに用いられる容器の形態、大きさ、材質は特に限定されない。
容器の形態としては、例えば、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態であってよい。
容器の型（タイプ）としては、クロスフロータイプおよびカラムタイプのいずれのタイプでも使用することができる。

［血小板の製造方法］
本発明の血小板の製造方法は、上述した本発明の分離基材に、少なくとも巨核球を含む培養液を接触させる接触工程と、
接触工程の前および／または後において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程と、
接触工程および培養工程の後に、産生した血小板を含む培養液を回収する回収工程とを有する、血小板の製造方法である。
ここで、接触工程における接触手段は、培養液の量および巨核球の濃度などに従って適宜選択することができるが、例えば、本発明の分離基材を充填した塔またはカラム等に細胞懸濁液を供給する方法などが挙げられる。
また、培養工程における血小板を産生させる手段は、例えば、流体によるシェアストレスを負荷させる方法が挙げられ、具体的には、巨核球を含む培養液を撹拌する方法などが挙げられる。なお、培養工程において培養する巨核球は、接触工程の後に培養工程を有する場合は、本発明の分離基材で補足された巨核球であってもよい。また、接触工程の後に培養工程を有する場合は、後述する実施例のように、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液を分離基材に接触させた際に、初期段階で補足された巨核球は、その後に接触する細胞懸濁液（すなわち流体）による負荷によっても血小板が産生していると考えられる。
また、回収工程における回収手段としては、例えば、本発明の分離基材を充填した塔またはカラム等に、産生した血小板を含む培養液を通液させる方法などが挙げられる。

以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。

〔実施例１〕
＜多孔膜＞
ポリスルホン（Ｐ３５００、アモコ社製）１５質量部、ポリビニルピロリドン１５質量部、塩化リチウム２質量部、および、水１．２質量部を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン６６．８質量部に溶解して製膜用混合物を得た。
この混合物をＰＥＴフィルム表面に、厚み２００μｍで流延した。
次いで、上記流延した液膜表面に、２５℃、絶対湿度７．８ｇ／ｋｇＡｉｒに調節した空気を２ｍ／ｓｅｃで５秒間当てた。
その後、直ちに水を満たした温度４０℃の凝固液槽に浸漬した。
次いで、ＰＥＴを剥離した後、２ｍ／ｓｅｃで、２５℃のジエチレングリコール浴に１２０秒間つけ、その後、純水で十分に洗浄し、多孔膜を作製した。

＜巨核球および血小板＞
培地：ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）４５０ｍｌにウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）５０ｍｌを添加したものを使用した。
巨核球：ＭＥＧ−０１（ＡＴＣＣ社）を巨核球として使用した。これを培地と混合することで、巨核球液（６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を調製した。
血小板懸濁液：ラット末梢血から単離したものを血小板として使用した。具体的には、クエン酸−デキロース溶液（ＡＣＤ）（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）が入った１５ｍｌ遠心分離用コニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ社）にラットから採血した全血１０ｍｌを回収した。３００×ｇ、室温で７分間遠心し、遠心後のＰｌａｓｍａ層およびＢｕｆｆｆｙ ｃｏａｔ層を回収した。回収液を同様に遠心分離し、Ｐｌａｓｍａ層のみを回収した後に、１８００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を回収することで血小板を得た。これを培地と混合することで、血小板懸濁液（６×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を調製した。
巨核球液と血小板懸濁液とを等量混合することで、細胞懸濁液を調製した。

＜細胞分離試験＞
濾過モジュール（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、ＫＳ−４７）の供給側の一方の流通口が細胞懸濁液を含む５０ｍｌシリンジ（テルモ社）にチューブ接続された濾過モジュールを用いて膜分離処理を行った。シリンジをシリンジポンプ（ＨＡＲＶＡＲＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ社、ＰＨＤ ＵＬＴＲＡ ４４００）に設置し、３ｍｌ／ｍｉｎ．の流量で細胞懸濁液３０ｍｌが濾過モジュール内に設置した分離基材に対して直行するデッドエンド方式で供給されるよう、シリンジポンプを運転した。濾過モジュールの透過側の排出口から排出された濾液を回収した。

＜回収細胞数のカウント＞
濾過モジュールの透過側から採取した濾液１００μｌに核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えたダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline：ＤＰＢＳ）〔Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕１０μｌを添加し、遮光環境で１５分反応した。ＤＰＢＳを３００μｌを加え、ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ ｔｕｂｅｓ（日本ベクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）により測定した。
前方散乱光（Forward scatter：ＦＳＣ）および側方散乱光（Side scatter：ＳＳＣ）ゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。血小板分画における核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画における核染色陽性細胞を巨核球とすることで、回収液中の血小板数及び巨核球数を算出した。
以下の式から得た血小板透過率および巨核球阻止率を表１に示す。
血小板透過率（％）＝（濾液中の血小板数／元液中の血小板数）×１００
巨核球阻止率（％）＝１００−（濾液中の巨核球数／元液中の巨核球数）×１００

＜評価（分離の判定）＞
分離の総合判定として、以下基準で評価を行った。結果を下記表１に示す。
Ａ：血小板透過率が８０％以上、かつ、巨核球阻止率９５％以上
Ｂ：血小板透過率が８０％以上、かつ、巨核球阻止率９０％以上
または、血小板透過率が７０％以上、かつ、巨核球阻止率９５％以上
Ｃ：血小板透過率が７０％未満、または、巨核球阻止率９０％未満

〔実施例２および比較例１〜３〕
多孔膜の作製時に、調温湿風中に含まれる水分濃度、調温湿風を当てる時間を変更し、下記表１に示す平均孔径および厚みを示す多孔膜を作製した以外は、実施例１と同様の方法で分離基材を作製し、評価を行った。結果を表１に示す。

〔実施例３〕
親水性ポリフッ化ビニリデン製多孔膜（ＳＶＬＰ０４７００、メルクミリポア製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

〔比較例４〕
親水性ポリフッ化ビニリデン製多孔膜（ＤＶＰＰ０４７００、メルクミリポア製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

〔比較例５〕
親水性ポリテトラフルオロエチレン製多孔膜（メルクミリポア製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

〔比較例６〕
ポリカーボネイト製多孔膜（メルクミリポア製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

〔比較例７〕
酢酸セルロース製多孔膜（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

〔比較例８〕
酢酸セルロース／ニトロセルロース製多孔膜（Ａ３００Ａ０４７Ａ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

〔比較例９〕
酢酸セルロース／ニトロセルロース製多孔膜（Ａ５００Ａ０４７Ａ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を表１に示す。

表１に示す結果から、平均孔径が２．０μｍより小さい多孔膜からなる分離基材を用いた場合には、血小板の透過率が低くなることが分かった（比較例１、２および４）。
また、平均孔径が１２．０μｍより大きい多孔膜からなる分離基材を用いた場合には、巨核球の阻止率が低くなることが分かった（比較例３）。
更に、分離基材の平均孔径が２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であっても、素材が、ポリスルホン樹脂、および、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されていない場合には、血小板の透過率および巨核球の阻止率のいずれかが低くなることが分かった（比較例５〜９）。

これに対し、分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、素材が、ポリスルホン樹脂、および、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている場合には、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高くなることが分かった（実施例１〜３）。

Claims (5)

1. 巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔膜からなる分離基材であって、
   前記分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１２．０μｍ以下であり、
   前記分離基材が、ポリスルホン樹脂、および、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、分離基材。
2. 前記分離基材が、表面から厚みの中心方向に向かって孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布を有する、請求項１に記載の分離基材。
3. 前記分離基材の表面が、親水性高分子または親水性基によって修飾されている、請求項１に記載の分離基材。
4. 第１通液口および第２通液口が配置された容器と、前記第１通液口および前記第２通液口の間に充填されたろ材を備えた細胞分離フィルターであって、
   前記ろ材が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離基材である、細胞分離フィルター。
5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離基材に、少なくとも巨核球を含む培養液を接触させる接触工程と、
   前記接触工程の前および後の少なくとも一方において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程と、
   前記接触工程および前記培養工程の後に、産生した血小板を含む培養液を回収する回収工程とを有する、血小板の製造方法。