CN110577562A - 一种三萜类化合物和其药学上可接受的盐及制备方法和应用 - Google Patents

一种三萜类化合物和其药学上可接受的盐及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三萜类化合物和其药学上可接受的盐及制备方法和应用。所述化合物的结构式如式Ⅰ所示，所述药学上可接受的盐的结构如式Ⅱ所示；其中M为碱金属离子、碱土金属离子或铵根。本发明所述化合物结构新颖，原始来源于金樱根，从金樱根提取物中分离得到，其对抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌具有很好的抑菌作用，同时还具有很好的消炎作用、镇痛作用、解热作用，可制备成为抗菌药物、消炎药物、镇痛药物或解热药物进行应用；当其成盐后，所得成盐化合物同样具有与化合物相当或相同的生物活性。

Description

一种三萜类化合物和其药学上可接受的盐及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，更具体地，涉及一种三萜类化合物和其药学上可接受的盐及制备方法和应用。
背景技术
金樱根别名金樱蔃、脱骨丹等，为双子叶蔷薇科植物金樱子RosalaevigataMichx.的根，始见于《日华子本草》，其载“金樱东行根，平，无毒。治寸白虫，止泻血及崩中带下”。其味苦、酸、涩，平。归脾、肝、肾经，具有清热利湿、解毒消肿、活血止血，收敛固涩的作用。金樱根中主要含有三萜、黄酮、鞣质类成分，可治疗遗精、遗尿、痢疾泄泻、崩漏带下、子宫脱垂、痔疮、烫伤等，为妇科千金片、金鸡胶囊及广东凉茶等临床常用中药和凉茶中的主要药物。
金樱子可药食两用，在保健食品及饮品方面有较大的开发价值，为固阴养阴之佳品，但有实火，邪热者忌服，明·缪希雍《本草经疏》：泄泻由于火热暴注者，不宜用；小便不禁及精气滑脱，因于阴虚火炽而得者，不宜用。在药用方面，金樱根主要入复方用药，广泛应用于临床，主要用于治疗前列腺炎、妇科疾病、遗精遗尿、泌尿系统感染、烧烫伤等疾病，在妇科千金片、三金片、金鸡胶囊及其片剂等畅销中成药中用量较大。
金樱根的药用价值显著，但到目前为止其活性成分仍不明确、对其单体化合物的药效研究较少。而中药材提取物在应用的过程中，由于其组分复杂，为达到治疗效果，则必然导致使用量增大，一方面容易导致药物成本上涨，另一方面则容易因用药量的增大而导致副作用的产生或者增强。因此，有必要对金樱根中的活性化合物进行具体的研究，并提供简单、便捷、安全的化学合成方法，既提高药物的疗效，同时还能降低药物的成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三萜类化合物及其药学上可接受的盐。本发明所述化合物原始来源于金樱根，从金樱根提取物中分离得到，其对抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌具有很好的抑菌作用，同时还具有很好的消炎作用、镇痛作用、解热作用，可制备成为抗菌药物、消炎药物、镇痛药物或解热药物进行应用。
本发明的第二目的在于提供所述三萜类化合物和/或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明的第三目的在于提供所述三萜类化合物的提取和分离方法。
本发明的第四目的在于提供所述三萜类化合物及其药学上可接受的盐的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种三萜类化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物的结构式如式Ⅰ所示，化学名称为2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸；所述药学上可接受的盐的结构如式Ⅱ所示：
其中M为碱金属离子、碱土金属离子或铵根；所述n为1或2。
本发明所述式Ⅰ化合物的分子式为C30H48O6，为乌苏烷型五环三萜类化合物，其对抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌具有很好的抑菌作用，同时还具有很好的消炎作用、解热作用，可制备成为抗菌药物、消炎药物或解热药物进行应用。
优选地，所述碱金属离子为钾离子、钠离子或锂离子；所述碱土金属离子为钙离子、镁离子或钡离子。
本发明同时还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述所述三萜类化合物(2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物)和/或其药学上可接受的盐。
优选地，所述药物组合物含有上述三萜类化合物(2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物)和/或其药学上可接受的盐，以及药学上允许的辅料和/或载体。
优选地，所述药物组合物含有上述所述三萜类化合物(2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物)和/或其药学上可接受的盐，以及其他药性成分。
优选地，所述药物组合物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参中的一种或几种。
优选地，所述药物组合物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参中的一种或几种的提取物。
所述提取物为按专利公告号CN104529984B、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、CN1296073C的任意一件或几件专利文件中所述的提取方法制备得到。
优选地，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、软膏剂、栓剂或喷雾剂，以及其他现有技术可实现的剂型。
本发明所述式Ⅰ化合物原始来源于传统的中药材金樱根，从金樱根中通过溶剂提取、柱层析分离、制备液相分离、纯化制得的一种新化合物，其具体的分离过程包括以下步骤：
S1.将金樱根药材粗粉用乙醇回流提取，浓缩得干膏；将上述金樱根干膏加水制成悬浮液，并依次用石油醚和氯仿、正丁醇萃取，得石油醚部位、氯仿部位和正丁醇部位；
S2.将步骤S1得到的氯仿部位采取步琦中压柱进行初步分离，采用干法装柱，用中压柱进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到7个不同洗脱部位，分别为A1、A2、A3、A4、A5、A3、A6、A7；
S3.将步骤S2得到的A7部分以二氯甲烷-乙酸乙酯体积比为10:1～0:1梯度进行硅胶柱层析，以薄层色谱为依据合并相似斑点得7个不同洗脱部位A7.1～A7.7；
S4.将得到的A7.7部位用反相柱甲醇-水梯度洗脱得到流份Fr42-55，将其进行凝胶柱甲醇洗脱，得到流份Fr12-39，并进一步采用制备液相纯化，以甲醇-0.1％甲酸进行洗脱，得目标化合物。
优选地，步骤S2中，梯度洗脱中石油醚-乙酸乙酯的体积比为30:1～0:1。
更优选地，步骤S2中，具体的梯度洗脱过程为：石油醚-乙酸乙酯体积比为30:1洗脱得A1部位；体积比为20:1洗脱得A2部位；体积比为10:1、5:1洗脱得A3部位；体积比为3:1、2:1洗脱得A4部位；体积比为1:1洗脱得A5部位；体积比为1:2洗脱得A6部位；体积比为1:3、1:5和0:1洗脱得A7部位。
优选地，步骤S4中，反相柱梯度洗脱中甲醇-水的体积比4:6～10:0。
更优选地，步骤S4中，具体的梯度洗脱过程为：甲醇-水体积比5:5～5.5:4.5得到流份Fr42-55，将其进行凝胶柱甲醇洗脱，每10mL收集一份，得到流份Fr12-39，并进一步采用制备液相纯化，以甲醇-0.1％甲酸体积比为55:45进行洗脱，洗脱时间为40min时，即可得目标化合物。
优选地，步骤S1中金樱根药材粗粉提取3次，每次回流1h；所采用的乙醇的体积分数为70％。
所述化合物在制备抗菌药物、消炎药物、镇痛药物或热解药物中的应用也在本发明的保护范围内。
优选地，所述抗菌药物为抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌或白色念珠菌的药物。
优选地，所述消炎药物为治疗宫颈炎、阴道炎、子宫内膜炎、盆腔炎或附件炎的药物。
优选地，所述药物含有药学上允许的辅料和/或载体。
优选地，所述药物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参中的一种或几种。
优选地，所述药物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参中的一种或几种的提取物。
优选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、软膏剂、栓剂或喷雾剂。
本发明所述化合物不仅可以从金樱根中分离得到，同时，也可以人工合成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述化合物结构新颖，原始来源于金樱根，从金樱根提取物中分离得到，其对抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌具有很好的抑菌作用，同时还具有很好的消炎作用、解热作用，可制备成为抗菌药物、消炎药物或解热药物进行应用；当其成盐后，所得成盐化合物同样具有与化合物相当或相同的生物活性。
附图说明
图1为化合物的分离流程示意图。
图2为化合物的(+)HR-ESI-MS谱图。
图3为化合物的(－)HR-ESI-MS谱图。
图4为化合物的氢谱图。
图5为化合物的碳谱图。
图6为化合物的DEPT 90谱图。
图7为化合物的DEPT 135谱图。
图8为化合物的HSQC谱图。
图9为化合物的HMBC谱图。
图10为化合物的1H-1H COSY谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1化合物2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸的提取和分离
以金樱根为研究对象，对其70％乙醇提取物进行提取和分离，以期明确其具体的活性成本以及不同成分的生物活性。具体采用的金樱根药材由株洲千金业股份有限公司提供，经中国中医科学院研究所李春研究员鉴定该药材为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigataMichx.的根。
提取与分离过程应用到的仪器包括：Dionex U-3000型高效液相色谱仪；WatersAcquityUPLC/Xevo G2 QTOF系统；FW135粉碎机；Bruker Ascend 600M超导核磁共振仪；Ultimate 3000超高效液相色谱仪和LTQ Orbitray Velos pro质谱仪；LC 3000型制备液相色谱仪；步琦中压制备色谱BUCHIflash systems X-10快速色谱柱系统。
用到的材料包括：常规柱色谱硅胶，羟丙基葡聚糖凝胶，RP-C18柱色谱填料，高效薄层板GF254，Thermo制备色谱柱BDS HYPERSIL C18，Kromasil 100 5 C18半制备色谱柱，氘代试剂，色谱甲醇和乙腈，其他试剂均为分析纯，显色剂：香草醛-浓硫酸显色剂。
具体的提取和分离过程包括：
1.将10Kg金樱根药材粉粗粉70％乙醇回流提取3次，每次回流1小时，减压浓缩，得干膏1144.56g；将上述金樱根干膏在水中弥散，使之成为悬浮液，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，得石油醚部位(5.73g)、氯仿部位(90.9g)、正丁醇部位(504.67g)和水部位(475.42g)。
2.将步骤1得到的氯仿部位采取步琦中压柱进行初步分离，即取氯仿部位(79.99g)，干法装柱，用中压柱进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯(体积比为30:1～0:1)梯度洗脱，得到7个不同洗脱部分(A1-A7)；其中石油醚-乙酸乙酯体积比为30:1洗脱得A1部位；体积比为20:1洗脱得A2部位；体积比为10:1、5:1洗脱得A3部位；体积比为3:1、2:1洗脱得A4部位；体积比为1:1洗脱得A5部位；体积比为1:2洗脱得A6部位；体积比为1:3、1:5和0:1洗脱得A7部位。
3.将上一步得到的A7部分(18.37g)以二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比为10:1～0:1)梯度进行硅胶柱层析，以薄层色谱为依据合并相似斑点得7个不同洗脱部位(A7.1-A7.7)；将得到的A7.7(5.55g)反相柱甲醇-水梯度洗脱，并将得到的Fr42-55(173.5mg)进行凝胶柱甲醇-水洗脱，得到Fr12-39(32.8mg)，然后制备液相洗脱液为甲醇-0.1％甲酸(体积比为55:45)洗脱，洗脱时间为40min后，即可得目标化合物(tR＝40min，7.2mg)。
实施例2
化合物2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸在提取过程中，还可将金樱根药材粉粗粉50％乙醇回流提取3次，每次回流1小时，减压浓缩，得干膏；然后按照实施例1所述萃取和分离过程进行，得到目标化合物。
实施例3
化合物2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸在提取过程中，还可将金樱根药材粉粗粉100％乙醇回流提取3次，每次回流1小时，减压浓缩，得干膏；然后按照实施例1所述萃取和分离过程进行，得到目标化合物。
实施例4目标化合物的结构鉴定
将实施例1至3制备得到的目标化合物进行结构鉴定，其结构如式Ⅰ所示：
化合物为白色粉末(甲醇)，喷以香草醛-浓硫酸显紫红色斑点。HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z527.3336[M+Na]+(calcd.527.3349，C30H48O6Na)，m/z503.3386[M-H]-(calcd.503.3373，C30H47O6)，给出分子式C30H48O6，不饱和度为7。1H NMR高场区显示五环三萜类化合物的7个甲基信号，分别为δH：0.83(3H,s,H-26)，0.89(3H,s,H-24)，0.98(3H,d,J＝6.7Hz,H-30)，1.01(6H,s,H-23,25)，1.18(3H,s,H-29)和1.39(3H,s,H-27)；1个次甲基信号δH2.48(1H,s，H-18)，1个三取代烯氢质子信号δH5.3(1H,t，H-12)以及3个与连氧碳相连的氢信号δH3.35(1H,m,H-3)，δH3.70(1H,dd,J＝11.8,4.4,H-22)和δH3.95(1H,dt,J＝12.1,3.8,H-2)。13C NMR谱、DEPT谱和HSQC谱综合分析可知：该化合物中有7个甲基，7个亚甲基，8个次甲基及8个季碳，其中δc128.10和δc138.38为典型的乌苏烷型三萜12，13位烯碳信号，δc179.16为28位羧基碳信号；4个连氧碳中3个为次甲基，分别是δc65.76(δH3.95)、δc74.28(δH3.70)和δc78.71(δH3.35)，1个为季碳δc71.81。以上信息提示该化合物的基本母核为乌苏烷型五环三萜类。
结合已报道的从金樱根中分离出大量的五环三萜类化合物，其中以乌苏烷型五环三萜为主，且金樱根中的乌苏烷型五环三萜类化合物多在C-2、3、19、23位具羟基取代。当2位和3位均有羟基取代时，可根据H-3的裂分方式初步判断羟基的空间取向，基本规律如下：若H-3表现为d峰，偶合常数大于9.0Hz，H-2和H-3为a-a偶合关系，C-2和C-3上的羟基均处于e键，即为2α，3β取代；若H-3表现为brs或者brd，偶合常数为2.0～3.0Hz，则H-2和H-3为a-e偶合关系，C-2和C-3上的羟基为2α、3α取代。当19位羟基取代时，C-19的化学位移多在73ppm左右。对照此规律，可推测此化合物具2α-OH，3α-OH取代，C-2和C-3化学位移分别为δc65.76和δc78.71；19位有羟基取代，C-19化学位移为δc71.81。HMBC谱上，δH1.01(H-23)、δH0.89(H-24)与78.71相关证实3位具羟基取代，1H-1H COSY中δH3.95(H-2)与δH3.35(H-3)相关证明δc78.71为3位碳信号，δc65.76为2位碳信号；δH2.48(H-18)、δH1.18(H-29)、δH0.98(H-30)与δc71.81相关证实δc71.81为19位碳信号；HMBC谱上，δH3.70(H-22)与δc179.16(C-28)和δc34.28(C-21)相关，证明还有一个羟基连在22位；1H-1H COSY谱中δH3.71与δH1.43、δH1.85(H-21)相关也验证了22具羟基取代。综合分析上述信息，推测分离得到的化合物结构为2,3,19,22-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid。与已知化合物methyl2α,3α,l9α,22α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oate的碳谱进行比较，除缺少一个-OCH3外，其他数据基本一致，因此确定目标化合物的结构为2α,3α,19α,22α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oicacid。
根据一维、二维及相关谱对目标化合物的核磁数据进行全归属，结果见表1。
表1化合物的核磁数据
(注：δ in ppm，J in Hz；a：CD3OD，600MHz for 1H-NMR，150MHz for 13C-NMR；b；CDCl3，75MHz for 13C-NMR)
实施例5 2α，3α，19α，22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物盐的制备
1、2α，3α，19α，22α-四羟基-12-烯-28-羧酸钾盐或钠盐的制备：先将氢氧化钾或氢氧化钠溶于乙醇，然后再向溶液中加入2α，3α，19α，22α-四羟基-12-烯-28-羧酸，边搅拌边加热回流，待回流结束之后，冷却至室温，然后边搅拌边滴加乙腈、抽滤、干燥即可得到白色固体，即为2α，3α，19α，22α-四羟基-12-烯-28-羧酸钾盐或钠盐。
2、2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸铵盐的制备：将2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸溶于乙醇，制备乙醇溶液，然后将其中滴加饱和氨水，至溶液的pH值为9-11，边搅拌边滴加乙腈、抽滤、干燥即可得到白色固体，即为2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸铵盐。
3、2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸钙盐的制备：将2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸溶于乙醇，然后将其中滴加饱和氨水，至溶液的pH值为9-13，边搅拌边滴加含钙离子的水溶液，持续搅拌，充分反应后，静置，析出沉淀后，过滤、干燥即可得到白色固体，即为2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸钙盐。
4、2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸镁盐的制备：将2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸溶于乙醇，然后将其中滴加饱和氨水，至溶液的pH值为9-13，边搅拌边滴加含镁离子的水溶液，持续搅拌，充分反应后，静置，析出沉淀后，过滤、干燥即可得到白色固体，即为2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸镁盐。
5、2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸钡盐的制备：将2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸溶于乙醇，然后将其中滴加饱和氨水，至溶液的pH值为9-13，边搅拌边滴加含钡离子的水溶液，持续搅拌，充分反应后，静置，析出沉淀后，过滤、干燥即可得到白色固体，即为2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸钡盐。
实施例6化合物的生物活性测试
1、抑菌试验
(1)抑菌圈测试
测试菌种为：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。
配置待测液：先将2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物溶于乙醇溶液中，然后加水配置成为所需浓度，配置好的待测样中，乙醇的体积比例低于2％。以链霉素为阳性对照药物。
抑菌圈测试过程：在无菌条件下，分别取金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌放入肉汤培养基试管中。管口灭菌后塞上试管塞，于37℃细菌培养箱内培养24h后取出置于冰箱4℃保存，其含菌量为5～10CFU/mL。将营养琼脂煮沸溶化灭菌，移至超净工作台内将营养琼脂倒至培养皿中使其冷却，用无菌微量加样器吸取100μL菌液倾注在营养琼脂平板上，涂布均匀，待菌液稍干后，取直径6mm的无菌圆形纸片，分别吸取不同浓度的待测样或者阳性对照药物溶液，每片吸取10μL，均匀分布在营养琼脂平板表面。在恒温恒湿培养箱中以37℃培养24h后观察并测量抑菌圈直径，每个浓度的药物抑菌实验重复3次，抑菌结果为3次实验平均值。测得结果见表1所示。
表1 2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物的抑菌结果
(2)最低抑菌浓度(MIC)的测定
2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸的测试浓度0.4、0.2、0.1、0.05、0.025和0.0125mg/mL，进行测试，测得结果如表2所示。
表2 2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸的最低抑菌浓度结果
从表1和表2中可知，本发明所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均表现出一定程度的抑菌作用，且其抑菌圈直径随着2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物的浓度增大而增加，其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌的抑菌效果更佳。
2、消炎试验
以吲哚美辛片为阳性对照药物，用药剂量为6.5mg/kg，以生理氯化钠溶液为空白对照，其中2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸的用量为26mg/kg、52mg/kg和104mg/kg。
取雄性小鼠50只，每组10只，随机分为5组。在小鼠左后足跖正面上端作一清晰横线，利用容积测量装置采用排水阀测量鼠爪体积，分别测量3次取平均值。然后按照0.2mL/10g的剂量连续灌胃给药4天，于末次给药1小时后，用省力氯化钠溶液配置好10％蛋清(0.1mL/跖)注入小鼠左后脚跖皮下，肿胀度＝致炎后足跖体积-致炎前足跖体积。测得结果如表3所示。
表3 2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物的消炎结果
从表3中可知，2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物具有消炎的作用，且消炎作用具有用药量的依赖性，当给药量为104mg/kg时，其抑制小鼠足跖肿胀的作用与吲哚美辛片相当。
3、镇痛试验
2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸的用量为26mg/kg、52mg/kg和104mg/kg。
测试方法：预防给药5天，试验前各小组小鼠禁食过夜，试验当天各组灌胃相应药物1h后，腹腔注射0.6％醋酸(0.2mL/只)，记录注射后10min内小鼠出现扭体的次数，以小鼠出现腰部肌肉反复收缩、拱背、臀部扭转和后肢伸展为扭体反应阳性，按照下列公式计算药物抑制扭体百分率：
抑制率(％)＝(对照组扭体数-给药组扭体数)/对照组扭体数*100％；其中对照组扭体为灌胃生理氯化钠溶液，以扎托布洛芬(给药剂量为80mg/kg)为阳性对照。
测得的扭体结果如表4所示。
表4小鼠扭体次数结果表
从表4中可知，服用不同剂量的2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸后，小鼠的扭体次数明显下降，抑制率为24％～76％，对小鼠扭体的抑制率呈现浓度依赖性；当服用剂量为104mg/kg时，小鼠扭体的次数与扎托布洛芬(给药剂量为80mg/kg)相当，表明2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物具有较好的镇痛效果。
4、解热试验
2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸的用量为26mg/kg、52mg/kg和104mg/kg。
实验前3d每天测体温2次，挑选体温在36.6～38.0℃、体温变化不超过0.3℃的大鼠供制备发热模型用。取体重150～200g健康大鼠60只，雌雄各半，分6组，连续灌胃给药6d，第7天按1mL/100g的剂量给大鼠皮下注射20％酵母粉混悬液，1h后开始测肛温，然后每1h测1次，于第4小时有80％以上的大鼠体温升至0.5℃以上时即为造模成功。然后每1h测1次体温，测9h。以每次测得的体温与基础体温的差值△△比较其解热效果。以生理氯化钠溶液为空白对照组，阿司匹林(100mg/kg)为阳性对照药物，测试结果如表5所示。
表5小鼠的热解试验结果
从表5中可知，服用2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸之后，小鼠的体温变化有所缓解，且呈现浓度依赖性，当服用剂量为104mg/kg时，其热解效果与阳性对照药物的效果相当。
上述实验结果表明本发明所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸或其药学上可接受的盐具有抑菌作用、消炎作用、镇痛作用和解热作用，其可制备成为药学上常用的剂型进行应用，或者与其他的药物进行复配，制备成为药物组合物进行应用。
实施例7不同剂型的制备
1、片剂的制备：按实施例1方法先制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及利用该化合物与碱金属或铵制成的盐，按该化合物或其任意一种盐与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
2、散剂的制备：按实施例1方法先制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及利用该化合物与碱金属或铵制成的盐，按常规散剂制法制成散剂。
3、胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及利用该化合物与碱金属或铵制成的盐，按该化合物或其任意一种盐与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制成胶囊剂或颗粒剂。
4、注射剂的制备：按实施例1方法先制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及利用该化合物与碱金属或铵制成的盐，按常规注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射剂。
实施例8药物组合物
一种药物组合物，含有实施例1方法制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及利用该化合物与碱金属、碱土金属或铵制成的盐，以及千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参制成的粉末和辅料。
实施例9药物组合物
一种药物组合物，含有实施例1方法制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参制成的粉末和辅料。
实施例10药物组合物
一种药物组合物，含有实施例1方法制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参制成的提取物，和辅料。提取物为按专利公告号CN104529984B、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、CN1296073C的任意一件或几件专利文件中所述的提取方法制备得到。
实施例11药物组合物
一种药物组合物，含有实施例1方法制得式Ⅰ所述2α,3α,19α,22α-四羟基-12-烯-28-羧酸化合物，以及利用该化合物与碱金属、碱土金属或铵制成的盐，以及千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参制成的提取物，和辅料。提取物为按专利公告号CN104529984B、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、CN1296073C的任意一件或几件专利文件中所述的提取方法制备得到。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种三萜类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的结构式如式Ⅰ所示，所述药学上可接受的盐的结构如式Ⅱ所示：
其中M为碱金属离子、碱土金属离子或铵根；所述n为1或2。
2.根据权利要求1所述三萜类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述碱金属离子为钾离子、钠离子或锂离子；所述碱土金属离子为钙离子、镁离子或钡离子。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1或2所述三萜类化合物和/或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有药学上允许的辅料和/或载体。
5.根据权利要求3所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参中的一种或几种的提取物。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、软膏剂、栓剂或喷雾剂。
8.权利要求1或2任一项所述三萜类化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将金樱根药材粗粉用乙醇回流提取，浓缩得干膏；将上述金樱根干膏加水制成悬浮液，并依次用石油醚和氯仿、正丁醇萃取，得石油醚部位、氯仿部位和正丁醇部位；
S2.将步骤S1得到的氯仿部位采取中压柱进行初步分离，采用干法装柱，用中压柱进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到7个不同洗脱部位，分别为A1、A2、A3、A4、A5、A3、A6、A7；
S3.将步骤S2得到的A7部位以二氯甲烷-乙酸乙酯体积比为10:1～0:1梯度进行硅胶柱层析，以薄层色谱为依据合并相似斑点得7个不同洗脱部位A7.1～A7.7；
S4.将得到的A7.7部位用反相柱甲醇-水梯度洗脱得到流份Fr42-55，将其进行凝胶柱甲醇洗脱，得到流份Fr12-39，并进一步采用制备液相纯化，以甲醇-0.1％甲酸进行洗脱，得目标化合物；
优选地，步骤S1中金樱根药材粗粉提取3次，每次回流1h；所采用的乙醇的体积分数为50％～100％；优选为70％。
9.权利要求1或2所述三萜类化合物及其药学上可接受的盐在制备抗菌药物、消炎药物、镇痛药物或热解药物中的应用；
优选地，所述抗菌药物为抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌或白色念珠菌的药物；
优选地，所述消炎药物为治疗宫颈炎、阴道炎、子宫内膜炎、盆腔炎或附件炎的药物。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物含有药学上允许的辅料和/或载体。
11.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳术、穿心莲、当归、党参中的一种或几种。
12.根据权利要求11所述应用，其特征在于，所述药物还含有千斤拔、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参中的一种或几种的提取物。
13.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、软膏剂、栓剂或喷雾剂。
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