CN113527324A - 暗绿蒿烯内酯a-l及其药物组合物和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结构式(I)所示12个新的倍半萜二聚体，暗绿蒿烯内酯A−L(1−12)，及其制备方法和应用、药物组合物及其应用，涉及药物技术领域。该类化合物对人肝癌细胞株HepG2、SMMC‑7721和Huh7具有显著的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。

Description

暗绿蒿烯内酯A-L及其药物组合物和其应用
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及暗绿蒿烯内酯A-L(1-12),及其制备方法和其应用、药物组合物及其应用。
背景技术：
肝癌仍然是一个全球性的健康挑战，其发病率在全球范围内不断增加，到2025年估计发病率将达到100万例。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，约占90％。导致HCC发生的因素有多种，如HBV或HCV感染、过度饮酒、糖尿病或肥胖、年龄、性别等。虽然疫苗和抗病毒治疗降低了HCC的发生率，但其发病率在全球范围内稳步增长。此外，大约25％的HCC可能产生潜在的突变。然而，只有7种抗肝癌药物被批准临床应用，包括sorafenib、regorafenib、lenvatinib、cabozantinib、nivolumab、pembrolizumab和ramucirumab，另外3种药物因其深远的影响获得FDA加速批准。虽然这些系统疗法取得重大进步，但临床上可用于HCC的药物仍然有限。因此，人类仍然需要新的、有效的靶向药物来改变肝癌治疗的前景。从天然产物中寻找具有抗肝癌活性的候选药物具有重要意义。
蒿属(ArtemisiaL.)是菊科(Asteraceae)中的一个大属，全球约有380余种，我国有186种，44变种，特有种82种，其中许多种根据中国药典已记载具有药用功效。例如，黄花蒿(A.annua)对治疗疟疾非常有效；艾(A.argyi)具有免疫调节活性，具有治疗炎症的潜力；茵陈(A.scoparia,A.capillaris)被用于治疗急慢性肝炎。暗绿蒿(Artemisiaatrovirens)为菊科蒿属为多年生草本植物，在《中国菊科药用植物化学成分及开发利用》(1998)收录为具有医疗价值的药用植物，但目前有关暗绿蒿的化学成分及其药理活性的研究较少，仅有文献报道其挥发油的化学成分分析，发现其主要成分为1,3-环戊二烯-5-(1,1-二甲基乙基)、蓝素-2-醇、1,4-二甲基-7-(1-甲基乙基)和桉油醇。
在本发明的前期工作中发现，暗绿蒿干燥地上部分的乙醇提取物对三株肝癌细胞(HepG 2,Huh7,SMMC-7721)具有较强的细胞毒活性，进一步从中分离得到12个对三株肝癌细胞株具有细胞毒活性的倍半萜二聚体类化合物，暗绿蒿烯内酯A-L(artematrovirenolides A-L,1-12)。迄今，现有技术中无暗绿蒿烯内酯A-L(artematrovirenolides A-L,1-12)的报道，也没有其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有其药物组合物在制备或治疗肝癌药物中的应用报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的式(I)所示的暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)，及其制备方法和应用，药物组合物及其应用，该类化合物对肝癌细胞株具有明显的细胞毒活性，能够用于制备抗肝癌药物中。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一系列倍半萜二聚体类化合物，暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)，具有如下式(I)所示结构：
Figure BDA0003145223200000021
本发明提供了上述化合物1-12的制备方法，取暗绿蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚(10:90,30:70,50:50,v/v)以及丙酮进行梯度洗脱得到3个流分Fr.1～Fr.3；Fr.2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,40:60,100:0,v/v)得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4；Fr.2-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.2-2-1～Fr.2-2-4；Fr.2-2-3经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90至40:60)得到4个流分Fr.2-2-3-1～Fr.2-2-3-4；Fr.2-2-3-2经中压RP-C18柱层析，用水-甲醇(70:30至10:90)梯度洗脱，得到4个组分Fr.2-2-3-2a-Fr.2-2-3-2d；Fr.2-2-3-2b经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,15:85至40:60)得到4个流分Fr.2-2-3-2b-1～Fr.2-2-3-2b-4；Fr.2-2-3-2b-1经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80)得到2个流分Fr.2-2-3-2b-1a～Fr.2-2-3-2b-1b；Fr.2-2-3-2b-1a再通过制备TLC(乙酸乙酯-氯仿,30:70)纯化得到化合物1和2；将Fr.2-2-3-2b-1b经半制备HPLC(水-乙腈,50:50)纯化得到化合物3和4；Fr.2-2-3-2c经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,15:85至30:70)得到3个流分Fr.2-2-3-2c-1～Fr.2-2-3-2c-3；Fr.2-2-3-2c-2经半制备HPLC(水-乙腈,53:47)纯化得到化合物11和12；Fr.2-2-3-2c-3经半制备HPLC(水-乙腈,51:49)纯化得到化合物5,6和7；Fr.2-2-3-3经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80至50:50)得到4个流分Fr.2-2-3-3a～Fr.2-2-3-3d；Fr.2-2-3-3b先经凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，再经制备HPLC(水-甲醇,40:60)纯化得到化合物8和一混合物；该混合物再通过制备TLC(乙酸乙酯-氯仿,40:60)纯化得到化合物9和10。
本发明提供了上述化合物1-12任其一种或任意组合在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
本发明同时还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的式(I)化合物1-12的至少一种或任意组合和药学上可接受的载体或赋型剂。
并此，还提供了所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
当所述化合物1-12中的至少一种或任意组合用于制备抗肝癌药物时，本发明优选将所述化合物1-12直接使用，或以药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物1-12中的至少一种或任意组合和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1-12中的至少一种或任意组合与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝癌药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1-12中的至少一种或任意组合在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
附图说明：
图1为本发明化合物1的X-单晶衍射结构示意图；
图2为本发明化合物2的X-单晶衍射结构示意图；
图3为本发明化合物5的X-单晶衍射结构示意图；
图4为本发明化合物8的X-单晶衍射结构示意图；
图5为本发明化合物9的X-单晶衍射结构示意图；
图6为本发明化合物1-12的结构式示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明倍半萜二聚体类化合物，暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)及其制备方法、结构鉴定、药理作用，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
化合物暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)的制备：
取暗绿蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚(10:90,30:70,50:50,v/v)以及丙酮进行梯度洗脱得到3个流分Fr.1～Fr.3；Fr.2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,40:60,100:0,v/v)得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4；Fr.2-2经中压MCICHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.2-2-1～Fr.2-2-4；Fr.2-2-3经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90至40:60)得到4个流分Fr.2-2-3-1～Fr.2-2-3-4；Fr.2-2-3-2经中压RP-C18柱层析，用水-甲醇(70:30至10:90)梯度洗脱，得到4个组分Fr.2-2-3-2a-Fr.2-2-3-2d；Fr.2-2-3-2b经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,15:85至40:60)得到4个流分Fr.2-2-3-2b-1～Fr.2-2-3-2b-4；Fr.2-2-3-2b-1经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80)得到2个流分Fr.2-2-3-2b-1a～Fr.2-2-3-2b-1b；Fr.2-2-3-2b-1a再通过制备TLC(乙酸乙酯-氯仿,30:70)纯化得到化合物1和2；将Fr.2-2-3-2b-1b经半制备HPLC(水-乙腈,50:50)纯化得到化合物3和4；Fr.2-2-3-2c经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,15:85至30:70)得到3个流分Fr.2-2-3-2c-1～Fr.2-2-3-2c-3；Fr.2-2-3-2c-2经半制备HPLC(水-乙腈,53:47)纯化得到化合物11和12；Fr.2-2-3-2c-3经半制备HPLC(水-乙腈,51:49)纯化得到化合物5,6,和7；Fr.2-2-3-3经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80至50:50)得到4个流分Fr.2-2-3-3a～Fr.2-2-3-3d；Fr.2-2-3-3b先经凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，再经制备HPLC(水-甲醇,40:60)纯化得到化合物8和一混合物；该混合物再通过制备TLC(乙酸乙酯-氯仿,40:60)纯化得到化合物9和10。
化合物1-12的结构数据：
核磁共振图谱使用Avance III 600(Bruker,
Figure BDA0003145223200000051
Switzerland)或AvanceIII HD 400(Bruker,Bremerhaven,Germany)超导核磁共振仪测定，TMS(四甲基硅烷)作为内标。高分辨质谱分析采用岛津LC-MS-IT-TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定。红外光谱(IR)经KBr压片方法，通过NICOLET iS10型红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific,Madison,USA)测定。ECD谱采用Chirascan型仪器(Applied Photophysics,Surrey,UK)测定。旋光经Autopol VI旋光仪(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,USA)测定。熔点用
Figure BDA0003145223200000052
X-4B显微熔点仪来测定，该熔点仪购自上海精密科学仪器有限公司。薄层层析硅胶板HSGF254是烟台江友硅胶开发有限公司产品；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；柱层析葡聚糖凝胶LH-20购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司。高效液相色谱仪为岛津公司生产，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，使用的色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)。色谱纯乙腈购自迈瑞达公司，去离子通道水通过MingCheTM-D 24UV MerkMillipore系统纯化而得。中压液相(Dr Flash-Ⅱ)为上海利穗公司产品，MCI柱日本三菱公司，型号为CHP-20P(75～150μm)。分析纯甲醇和乙腈购自天津大茂化学试剂厂。显色剂为10％H2SO4-EtOH溶液。
Figure BDA0003145223200000053
暗绿蒿烯内酯A(1)
分子式：C30H36O6
分子量：492.25
性状：斜方晶体
熔点：261～262℃
旋光：
Figure BDA0003145223200000061
(c 0.16,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值493.2580[M+H]+,计算值493.2585[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3430,1755,1724,1644,1382,1256,1214,1068cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):202(–12.25),259(+11.46),326(–2.24)nm。
晶体数据：C30H36O6·CH3OH·2(H2O),M＝560.66,
Figure BDA0003145223200000062
Figure BDA0003145223200000063
α＝90°,β＝90°,γ＝90°,
Figure BDA0003145223200000064
T＝100.(2)K,晶格尺寸P212121,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.802mm-1,晶体数据采用D8QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为50774次,其中观测到5474次(Rint＝0.0959),I>2σ(I),R1＝0.0746,wR(F2)＝0.1979,F2＝1.089,Flack parameter＝0.05(11)。化合物1的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC 2040404。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0003145223200000065
暗绿蒿烯内酯B(2)
分子式：C30H36O6
分子量：492.25
性状：斜方晶体
熔点：263～264℃
旋光：
Figure BDA0003145223200000066
(c 0.13,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值493.2578[M+H]+,计算值493.2585[M+H]+。
IR νmax:3437,1764,1708,1646,1382,1233,1220,1066cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):202(–15.36),259(+12.32),325(–2.12)nm。
晶体数据：C30H36O6·CH3OH,M＝524.63,
Figure BDA0003145223200000071
α＝90°,β＝90°,γ＝90°,
Figure BDA0003145223200000072
T＝100.(2)K,晶格尺寸P212121,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.748mm-1,晶体数据采用D8QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为28607次,其中观测到5222次(Rint＝0.0538),I>2σ(I),R1＝0.0319,wR(F2)＝0.0737,F2＝1.045,Flack parameter＝-0.07(5)。化合物2的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC2049391。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0003145223200000073
暗绿蒿烯内酯C(3)
分子式：C30H36O6
分子量：492.25
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000074
(c 0.08,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值493.2565[M+H]+,计算值493.2585[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3440,1738,1630,1462,1384,1230,1141,1066cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):199(–34.60),228(–2.88),259(–12.94),320(+3.14)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0003145223200000081
暗绿蒿烯内酯D(4)
分子式：C30H36O6
分子量：492.25
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000082
(c 0.08,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值493.2584[M+H]+,计算值493.2585[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3437,1757,1743,1649,1461,1384,1306,1201,1065cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):199(–28.98),227(–0.77),261(–13.48),328(+3.34)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0003145223200000083
暗绿蒿烯内酯E(5)
分子式：C30H34O5
分子量：474.24
性状：斜方晶体
熔点：221～223℃
旋光：
Figure BDA0003145223200000084
(c 0.04,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值497.2261[M+Na]+,计算值497.2298[M+Na]+。
IR νmax:3529,1763,1752,1665,1457,1384,1230,1104,1012cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):199(–11.76),249(+11.05),277(–0.67)nm。
晶体数据：C30H34O5,M＝474.57,
Figure BDA0003145223200000091
α＝90°,β＝90°,γ＝90°,
Figure BDA0003145223200000092
T＝100.(2)K,晶格尺寸P212121,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.704mm-1,晶体数据采用D8QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为20954次,其中观测到4760次(Rint＝0.0351),I>2σ(I),R1＝0.0284,wR(F2)＝0.0705,F2＝1.042,Flack parameter＝0.04(4)。化合物5的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC1999093。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0003145223200000093
暗绿蒿烯内酯F(6)
分子式：C30H36O5
分子量：476.26
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000094
(c 0.12,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值499.2453[M+Na]+,计算值499.2455[M+Na]+。
IR νmax:3451,1759,1636,1457,1311,1292,1200,1064cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):198(–10.20),251(+4.89),283(–0.34)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0003145223200000095
暗绿蒿烯内酯G(7)
分子式：C30H36O5
分子量：476.26
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000101
(c 0.08,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值477.2624[M+H]+,计算值477.2636[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3450,1758,1639,1458,1384,1221,1066cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε)199(–6.57),224(+2.39),251(+3.09),281(–0.24)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0003145223200000102
暗绿蒿烯内酯H(8)
分子式：C30H38O7
分子量：510.26
性状：斜方晶体
熔点：203～204℃
旋光：
Figure BDA0003145223200000103
(c 0.03,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值555.2606[M+HCOO]–,计算值555.2600[M+HCOO]–。
IR νmax:3469,1763,1644,1387,1321,1114,1104cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):199(+2.21),227(+12.73),266(+0.02)nm。
晶体数据：C30H38O7,M＝510.60,
Figure BDA0003145223200000104
α＝90°,β＝90°,γ＝90°,
Figure BDA0003145223200000105
T＝100.(2)K,晶格尺寸P212121,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.749mm-1,晶体数据采用D8QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为48696次,其中观测到5123次(Rint＝0.0347),I>2σ(I),R1＝0.0257,wR(F2)＝0.0654,F2＝1.030,Flackparameter＝0.01(3)。化合物8的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC1999132。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0003145223200000111
暗绿蒿烯内酯I(9)
分子式：C30H38O6
分子量：494.27
性状：单斜晶体
熔点：211～212℃
旋光：
Figure BDA0003145223200000112
(c 0.08,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值517.2576[M+Na]+,计算值517.2561[M+Na]+。
IR νmax:3486,1769,1749,1632,1452,1379,1329,1134cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):200(–29.28),228(+8.21)nm。
晶体数据：C30H38O6,M＝494.60,
Figure BDA0003145223200000113
α＝90°,β＝119.089(2)°,γ＝90°,
Figure BDA0003145223200000114
T＝100.(2)K,晶格尺寸P1211,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.687mm-1,晶体数据采用D8QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为49663次,其中观测到10320次(Rint＝0.0797).(I>2σ(I).R1＝0.1447,wR(F2)＝0.3503,F2＝1.057.Flack parameter＝0.04(12)。化合物9的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC2016460。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0003145223200000121
暗绿蒿烯内酯J(10)
分子式：C30H36O6
分子量：492.25
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000122
(c 0.11,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值515.2408[M+Na]+,计算值515.2404[M+Na]+。
IR νmax:3487,1762,1749,1633,1382,1371,1260,1160cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):200(–8.84),225(+4.16)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0003145223200000123
暗绿蒿烯内酯K(11)
分子式：C30H36O5
分子量：476.26
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000124
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值499.2442[M+Na]+,计算值499.2455[M+Na]+。
IR(KBr)νmax:3450,1765,1636,1447,1257,1106,1024cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):198(–1.74),221(+0.57)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0003145223200000131
暗绿蒿烯内酯L(12)
分子式：C30H34O5
分子量：474.24
性状：白色无定型粉末
旋光：
Figure BDA0003145223200000132
(c 0.12,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值475.2473[M+H]+,计算值475.2479[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3487,1767,1664,1318,1263,1244,1198cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):200(–15.67),222(+3.78)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0003145223200000141
Figure BDA0003145223200000151
Figure BDA0003145223200000161
实施例2：
化合物1-12对三株肝癌细胞株的细胞毒活性。
1.材料和方法
1.1材料
HepG2细胞株由中国科学院昆明植物研究所活性筛选中心赠予，SMMC-7721和Huh7细胞株购自上海纪宁生物科技有限公司；培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)购自Thermo Fisher Scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,FBS)购自Life Technologies(NY,USA)；RPMI-1640购自ThermoFisher Biochemical Products(北京，中国)。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
1).取对数期生长的肝癌细胞，弃去旧培养基，用PBS清洗两遍，弃去PBS；
2).用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
3)用含10％FBS的DMEM完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μL细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至1×104/mL，接种在96孔板上，每孔加入100μL细胞悬液，在37℃，5％CO2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
4).吸去培养基，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔，培养箱中继续孵育48h；
5).吸去培养基，加入配好的MTT溶液(1mg/mL)，每孔加入100μL，培养箱中孵育4h；
6).吸去MTT溶液，加入DMSO，每孔加入100μL，培养箱中孵育10min；
7).使用酶标仪在490nm波长下测量吸光度值，通过公式：抑制率＝(阴性－实验组)/(阴性－空白组)×100％计算细胞抑制率，并用统计软件GraphPad prism 5计算IC50，实验重复3次。
2.结果
化合物1-12对三株肝癌细胞(HepG2,SMMC-7721和Huh7)的细胞毒活性如表4所示，对于HepG2细胞,化合物5,6,10和11具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为13.6,14.8,9.3和12.8μM,基本与阳性药物索拉非尼相当；化合物2,4和7-9亦具有一定的细胞毒活性，其IC50值分别为32.7,48.4,19.4,24.3和22.0μM，而化合物1,3和12活性则相对较弱。
对于SMMC-7721细胞,化合物5,7和11具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为18.5,17.4和13.1μM,基本与阳性药物索拉非尼相当；化合物4,10和12也表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为24.0,21.7和28.4μM，而化合物1-3,6,8和9活性则相对较弱。
对于Huh7细胞,化合物5和11具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为16.5和19.4μM,基本与阳性药物索拉非尼相当；化合物2,4,6和7也具有一定的细胞毒活性，其IC50值分别为33.4,35.2,32.5和30.7μM，而化合物1,3,8-10和12活性则相对较弱。
有趣的是，化合物11不仅对HepG2和SMMC-7721细胞株表现出与阳性药物索拉菲尼相当的细胞毒活性，其IC50值分别为12.8和13.1μM；而且对Huh7细胞株也表现出较好的细胞毒活性，其IC50值为19.4μM。此外，化合物5对三株肝癌细胞株(HepG2,SMMC-7721,and Huh7)均表现出较好的细胞毒活性，其IC50值分别为13.6,18.5和16.5μM。上述研究结果提示化合物11是一种有效的抗肝癌候选药物。
表4.化合物1-12对三株肝癌细胞的细胞毒活性结果
Figure BDA0003145223200000181
a数值表示为IC50±SD(n＝3).
b索拉菲尼为阳性对照.
3.结论
实验结果显示，对于HepG2细胞，4个化合物(5,6,10和11)具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为13.6,14.8,9.3和12.8μM,基本与阳性药物索拉非尼相当；对于SMMC-7721细胞，3个化合物(5,7和11)具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为18.5,17.4和13.1μM,基本与阳性药物索拉非尼相当；对于Huh7细胞,化合物5和11具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为16.5和19.4μM,基本与阳性药物索拉非尼相当；其余化合物也均表现出不同程度的细胞毒活性，特别是，化合物11不仅对HepG2和SMMC-7721细胞株都表现出与阳性药物索拉菲尼相当的细胞毒活性，其IC50值分别为12.8和13.1μM；而且对Huh7细胞株也表现出较好的细胞毒活性，其IC50值为19.4μM。此外，化合物5对三株肝癌细胞株(HepG2,SMMC-7721,andHuh7)均表现出较好的细胞毒活性，其IC50值分别为13.6,18.5和16.5μM。以上结果表明暗绿蒿中分离得到的化合物1-12可作为药物用于肝癌相关的疾病。
制剂实施例：
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物1-12中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/mL。
2.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，用DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将化合物1-12中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一种暗绿蒿中化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的暗绿蒿烯内酯，主要包括12种新结构的倍半萜二聚体，这些化合物对肝癌细胞具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.结构式(I)所示的化合物暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)，
Figure FDA0003145223190000011
2.权利要求1所述的式(I)化合物暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：取暗绿蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚(10:90,30:70,50:50,v/v)以及丙酮进行梯度洗脱得到3个流分Fr.1～Fr.3；Fr.2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,40:60,100:0,v/v)得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4；Fr.2-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.2-2-1～Fr.2-2-4；Fr.2-2-3经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90至40:60)得到4个流分Fr.2-2-3-1～Fr.2-2-3-4；Fr.2-2-3-2经中压RP-C18柱层析，用水-甲醇(70:30至10:90)梯度洗脱，得到4个组分Fr.2-2-3-2a-Fr.2-2-3-2d；Fr.2-2-3-2b经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,15:85至40:60)得到4个流分Fr.2-2-3-2b-1～Fr.2-2-3-2b-4；Fr.2-2-3-2b-1经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80)得到2个流分Fr.2-2-3-2b-1a～Fr.2-2-3-2b-1b；Fr.2-2-3-2b-1a再通过制备TLC(乙酸乙酯-氯仿,30:70)纯化得到化合物1和2；将Fr.2-2-3-2b-1b经半制备HPLC(水-乙腈,50:50)纯化得到化合物3和4；Fr.2-2-3-2c经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,15:85至30:70)得到3个流分Fr.2-2-3-2c-1～Fr.2-2-3-2c-3；Fr.2-2-3-2c-2经半制备HPLC(水-乙腈,53:47)纯化得到化合物11和12；Fr.2-2-3-2c-3经半制备HPLC(水-乙腈,51:49)纯化得到化合物5,6和7；Fr.2-2-3-3经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80至50:50)得到4个流分Fr.2-2-3-3a～Fr.2-2-3-3d；Fr.2-2-3-3b先经凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，再经制备HPLC(水-甲醇,40:60)纯化得到化合物8和一混合物；该混合物再通过制备TLC(乙酸乙酯-氯仿,40:60)纯化得到化合物9和10。
3.权利要求1所述的式(I)化合物暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)任其一或任意组合在制备抗肝癌药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的式(I)化合物暗绿蒿烯内酯A-L(1-12)的至少一种或任意组合和药学上可接受的载体或赋型剂。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
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