CN110438078A - 一种党参炔醇体外促进nk细胞增殖、增强其杀伤活性的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种党参炔醇体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性的用途。本发明实施例的实验结果说明，党参中的两种成分党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞的体外培养具有不完全相同的作用，党参炔醇可以显著促进NK细胞的体外增殖，也可以提高NK细胞杀伤活性，党参苷Ⅰ虽然不能明显促进NK细胞的体外增殖，但是可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且党参炔醇、党参苷Ⅰ均不会影响NK细胞中CD3－CD56+细胞比例。因此，党参炔醇可以用于体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性，可以用于制备促进NK细胞体外增殖、增强其杀伤活性的培养基，党参苷Ⅰ可以用于体外增强NK细胞杀伤活性，可以用于制备增强NK细胞杀伤活性的培养基。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞领域，涉及免疫细胞的体外培养，具体涉及一种党参炔醇体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性的用途。
背景技术
自然杀伤(Natural killer，NK)细胞是具有多种免疫学功能的淋巴样细胞，约占外周血淋巴细胞的10％～15％。人的NK细胞一般指CD3－CD56+淋巴细胞。NK细胞是机体抗肿瘤的、抗感染的第一道防线，对肿瘤和病毒的识别和杀伤无组织相容性复合体(MHC)限制、不依赖于抗体，因此在肿瘤的免疫治疗领域有较好的发展前景。
NK细胞具有较广的抗瘤谱，NK细胞杀伤靶细胞的一个重要机制为：释放穿孔素和颗粒酶B引起靶细胞坏死或凋亡。NK细胞在体内接触到肿瘤细胞之后，通过胞吐将含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性物质释放，穿孔素通过聚合作用在靶细胞表面形成小孔，释放的颗粒酶B进入靶细胞，可通过多种不同途径激起细胞的死亡，如激起caspases的链锁反应，引起靶细胞DNA降解活动，然后裂解致使肿瘤细胞凋亡。
NK细胞是否能够在肿瘤治疗中发挥作用，最大的关键在于细胞的数量和对肿瘤细胞的杀伤能力。然而，NK细胞在体外增殖速度有限，数量上难以满足需要，杀伤活性也有待加强。
党参具有补中益气、增强机体免疫力的作用，党参炔醇和党参苷Ⅰ是党参中含量非常低的两种成分，研究极少，目前还没有报道过其对NK细胞增殖和杀伤活性的影响。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种党参炔醇体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种党参炔醇体外促进NK细胞增殖、增强NK细胞杀伤活性的用途。
一种党参炔醇用于制备促进NK细胞体外增殖、增强其杀伤活性的培养基的用途。
一种提高NK细胞体外增殖率、增强其杀伤活性的培养基，该培养基包括NK细胞培养液和党参炔醇。
优选地，党参炔醇浓度为40～60μM。
更优选地，党参炔醇浓度为50μM。
有益效果：
本发明实施例的实验结果说明，党参中的两种成分党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞的体外培养具有不完全相同的作用，党参炔醇可以显著促进NK细胞的体外增殖，也可以提高NK细胞杀伤活性，党参苷Ⅰ虽然不能明显促进NK细胞的体外增殖，但是可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且党参炔醇、党参苷Ⅰ均不会影响NK细胞中CD3－CD56+细胞比例。因此，党参炔醇可以用于体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性，可以用于制备促进NK细胞体外增殖、增强其杀伤活性的培养基，党参苷Ⅰ可以用于体外增强NK细胞杀伤活性，可以用于制备增强NK细胞杀伤活性的培养基。
附图说明
图1为第10天NK细胞流式细胞仪检测结果；
图2为党参炔醇、党参苷Ⅰ培养48h后NK细胞的流式细胞仪检测结果，其中：A为党参炔醇，B为党参苷Ⅰ；
图3为党参炔醇、党参苷Ⅰ培养48h对NK细胞中颗粒酶B、穿孔素表达水平的影响，其中：A为对照组，B为党参炔醇，C为党参苷Ⅰ。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、试验材料
淋巴细胞分离液，上海源叶生物科技有限公司；
NK细胞培养液CellGro SCGM，德国CellGenix公司；
rhIL-2，厦门特宝生物工程股份有限公司；
党参炔醇，上海源叶生物科技有限公司，HPLC纯度≥95％；
党参苷Ⅰ，四川省维克奇生物科技有限公司，HPLC纯度≥98％；
穿孔素和颗粒酶B一抗，美国Santa Cruz公司。
二、试验方法
1、NK细胞培养和鉴定
取100mL健康成年人外周血，用淋巴细胞分离液收集外周血单个核细胞(PBMC)，然后用添加有200U/mL rhIL-2的NK细胞培养液调整细胞密度为5×105/mL，加入6孔培养板，每孔3mL，于37℃、5％CO2培养，每2～3d半量换液1次。
收集第10天NK细胞，流式细胞仪检测CD3－CD56+细胞比例。
2、CCK-8法测定NK细胞的增殖率、CD3－CD56+比例的测定
取培养第10天NK细胞，用NK细胞培养液制成密度为5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL，分为对照组、党参炔醇组、党参苷Ⅰ组。接种于96孔板适应性培养24h后，对照组更换为新鲜的NK细胞培养液继续培养，党参炔醇组或党参苷Ⅰ组更换为含有50μM党参炔醇或党参苷Ⅰ的NK细胞培养液继续培养。每组8个复孔，其中5个复孔用于测定增殖率，剩余3个复孔用于流式细胞仪测定药物培养48h后CD3－CD56+比例。
继续培养48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续孵育4h，在450nm波长酶标仪上测定各孔光密度(OD)值，按照如下公式计算药物党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞的增殖率：增殖率(％)＝[(药物组OD值－对照组OD值)/对照组OD值]×100％。
3、Western blot法测定NK细胞中颗粒酶B、穿孔素表达水平
取培养第10天NK细胞，用NK细胞培养液制成密度为5×104/mL的细胞悬液，接种于24孔板，每孔1mL，分为对照组、党参炔醇组、党参苷Ⅰ组。接种于24孔板适应性培养24h后，对照组更换为新鲜的NK细胞培养液继续培养，党参炔醇组或党参苷Ⅰ组更换为含有50μM党参炔醇或党参苷Ⅰ的NK细胞培养液继续培养，48h后洗涤收集细胞，用Western blot法测定NK细胞中颗粒酶B、穿孔素表达水平，具体方法如下：
用细胞裂解液裂解细胞，离心收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，取40μg蛋白上样，经10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后用湿转法(50V，3h)将蛋白质转移至PVDF膜上，在于含5％脱脂奶粉的封闭液中室温封闭2h，分别加入穿孔素和颗粒酶B一抗，4℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育lh，充分洗涤后，用Imager拍照分析。
4、统计学方法
采用SPSS16.0软件分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用One-way ANOVA检验，P<0.05代表差异有统计学意义。
三、试验结果
1、NK细胞培养和鉴定
第10天NK细胞流式细胞仪检测结果如图1所示，CD3－CD56+细胞比例为(84.4±1.6)％(84.5％、82.7％、85.9％)，符合NK细胞的表型特点。
2、党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞增殖活性和CD3－CD56+细胞比例的影响
党参炔醇、党参苷Ⅰ培养48h对NK细胞的增殖率影响结果如表1所示，从表1可见，党参炔醇可以显著促进NK细胞的增殖，而党参苷Ⅰ对NK细胞无明显增殖促进作用。
表1各组OD值和党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞的增殖率
党参炔醇、党参苷Ⅰ培养48h后NK细胞的流式细胞仪检测结果如图2所示，CD3－CD56+比例分别为(84.2±1.8)％(84.9％、85.5％、82.1％)、(83.5±1.7)％(84.2％、81.6％、84.8％)，与党参炔醇、党参苷Ⅰ培养前无明显差异，说明党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞中CD3－CD56+细胞比例无明显影响。
3、党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞中颗粒酶B、穿孔素表达水平的影响
党参炔醇、党参苷Ⅰ培养48h对NK细胞中颗粒酶B、穿孔素表达水平的影响结果如图3所示，从图3可见，党参炔醇、党参苷Ⅰ均可以促进NK细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达，且党参苷Ⅰ的促进作用明显更强。
上述实验结果说明，党参中的两种成分党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞的体外培养具有不完全相同的作用，党参炔醇可以显著促进NK细胞的体外增殖，也可以提高NK细胞杀伤活性，党参苷Ⅰ虽然不能明显促进NK细胞的体外增殖，但是可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且党参炔醇、党参苷Ⅰ均不会影响NK细胞中CD3－CD56+细胞比例。因此，党参炔醇可以用于体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性，可以用于制备促进NK细胞体外增殖、增强其杀伤活性的培养基，党参苷Ⅰ可以用于体外增强NK细胞杀伤活性，可以用于制备增强NK细胞杀伤活性的培养基。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (5)
1.一种党参炔醇体外促进NK细胞增殖、增强NK细胞杀伤活性的用途。
2.一种党参炔醇用于制备促进NK细胞体外增殖、增强其杀伤活性的培养基的用途。
3.一种提高NK细胞体外增殖率、增强其杀伤活性的培养基，其特征在于：该培养基包括NK细胞培养液和党参炔醇。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：党参炔醇浓度为40～60μM。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：党参炔醇浓度为50μM。
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