CN110402282B

CN110402282B - 细胞培养用袋状容器及其制造方法

Info

Publication number: CN110402282B
Application number: CN201880015945.7A
Authority: CN
Inventors: 伊藤越美; 仓内启辅; 荻原直人; 草间大辅
Original assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd; Toyocolor Co Ltd
Current assignee: Toyocolor Co Ltd; Artience Co Ltd
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: JP6206612B1; JP2018143180A; CN110402282A; WO2018164168A1

Abstract

本发明提供一种细胞培养用袋状容器及其制造方法，所述细胞培养用袋状容器即便在长期的细胞培养中，也可抑制抗体蛋白质的吸附，具有不阻碍细胞增殖的细胞接着性低的表面性状，且冷藏保存性、透明性、热封性、及遮光性优异。本发明的细胞培养用袋状容器为用以封入细胞培养液作为内容物的细胞培养用袋状容器，且袋状容器的与细胞培养液接触的内表面包含含有疏水剂及热塑性树脂的疏水性材料，疏水剂与热塑性树脂的质量比为疏水剂：热塑性树脂＝1：5～1：1000的范围内。

Description

细胞培养用袋状容器及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养用袋状容器及其制造方法。

背景技术

作为进行再生医学的方法，有器官组织的培养、细胞培养的利用、及自组织诱导的研究等。将来也考虑在进行了基因操作的猪等的体内养殖人的器官的方法。关于自组织诱导，发现通过巧妙地组合细胞、分化或诱导因子(信号分子)、及支架(scaffold)这三个，能够进行组织再生。在之前的材料的功能的恢复(基于工程技术的人工器官)中，困难多且受限，器官移植医疗具有移植适合性等困难，故对于再生医学寄予大的期待。之前，作为此种再生医疗研究等中所使用的细胞培养用容器，一般是玻璃制或合成树脂制的烧瓶或培养皿，但这些不适合大量生产。因此就大量生产、运输、及废弃的容易度而言，推进袋状容器(袋)的开发。例如，专利文献1中公开了包含含有聚(乙烯丁烯)聚苯乙烯嵌段共聚物的聚合物合金(polymer alloy)的细胞培养用袋。

对细胞培养用容器要求优异的细胞增殖能力。例如，专利文献2中公开了通过氟气将与构成聚合物的碳原子键结的氢原子的一部分进行氟取代的聚乙烯制容器。然而，在所述技术中必须使用毒性高的氟气。另外，虽然可确认到短期的细胞接着的抑制效果，但氟气处理后的聚合物片的表面随着时间逐渐亲水化，因此难以长期维持细胞接着的抑制效果。

专利文献3中公开了在支撑体上具有包含含氟化合物、优选为含氟聚合物的表面层的细胞培养器材。在所述技术中，使用包含含氟聚合物等含氟化合物的溶液，通过浇铸法等在孔板上形成表面层。在所述方法中，担心形成表面层时的残留有机溶剂会对细胞的生存带来不良影响。另外，所获得的细胞培养器材的氧气透过性、冷藏保存性、透明性、及热封性等对于细胞培养袋状容器而言所需的特性并不充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1日本专利特开平3-65177号公报

专利文献2日本专利特开2005-218444号公报

专利文献3国际公开第2016/121994号

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供一种细胞培养用袋状容器，所述细胞培养用袋状容器即便在长期的细胞培养中，也可抑制抗体蛋白质的吸附，具有不阻碍细胞增殖的细胞接着性低的表面性状，且冷藏保存性、透明性、热封性、及遮光性优异。

解决问题的技术手段

本发明人等人为了解决所述课题而进行了努力研究，结果完成了本发明。

本发明的一实施方式为一种细胞培养用袋状容器，用以封入细胞培养液作为内容物，所述细胞培养用袋状容器中袋状容器的与细胞培养液接触的内表面包含含有疏水剂及热塑性树脂而成的疏水性材料，疏水剂与热塑性树脂的质量比为疏水剂：热塑性树脂＝1：5～1：1000的范围内(其中，热塑性树脂是除疏水剂以外)。

所述实施方式中，疏水剂优选为选自由聚四氟乙烯、聚氯三氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯、含氟丙烯酸共聚物、含聚有机硅氧烷基的丙烯酸共聚物、硅油(siliconeoil)、及硅酮-烯烃共聚物所组成的群组中的至少一种。

所述实施方式中，疏水剂优选为选自由含氟丙烯酸共聚物、含聚有机硅氧烷基的丙烯酸共聚物、硅油、及硅酮-烯烃共聚物所组成的群组中的至少一种。

所述实施方式中，热塑性树脂优选为选自由聚烯烃、聚环烯烃、及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物所组成的群组中的至少一种。

所述实施方式中，细胞培养用袋状容器优选为包含含有基材层与表面层的两层以上的层叠片，所述表面层配置于袋状容器的内面侧，且包含所述疏水性材料。

所述实施方式中，基材层优选为包含选自由聚烯烃、聚环烯烃、及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物所组成的群组中的至少一种。

本发明的另一实施方式为一种细胞培养用袋状容器的制造方法，是所述实施方式的细胞培养用袋状容器的制造方法，所述细胞培养用袋状容器的制造方法是将包含所述疏水性材料的单层片、或含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的层叠片成形，使用所获得的单层片或层叠片来形成袋状容器。

本发明的另一实施方式为一种疏水性材料，用以形成封入细胞培养液作为内容物的细胞培养用袋状容器，所述疏水性材料中袋状容器的与细胞培养液接触的内表面包含含有疏水剂及热塑性树脂的疏水性材料，疏水剂与热塑性树脂的质量比为疏水剂：热塑性树脂＝1：5～1：1000的范围内(其中，热塑性树脂是除疏水剂以外)。

发明的效果

根据本发明，可提供一种细胞培养用袋状容器，所述细胞培养用袋状容器即便在长期的细胞培养中，也可抑制抗体蛋白质的吸附，具有不阻碍细胞增殖的细胞接着性低的表面性状，且冷藏保存性、透明性、热封性、及遮光性优异。

具体实施方式

以下，对本发明进行说明。再者，本说明书中，有时将“细胞培养用袋状容器”简单简称为“袋状容器”或“袋”。另外，所谓“(甲基)丙烯酸”，是指丙烯酸和/或甲基丙烯酸。

本发明涉及一种用以封入细胞培养液作为内容物的细胞培养用袋状容器。关于本发明的细胞培养用袋状容器，袋状容器的与细胞培养液接触的内表面包含含有疏水剂及热塑性树脂的疏水性材料，疏水剂与热塑性树脂的质量比为疏水剂：热塑性树脂＝1：5～1：1000的范围内。

本发明的细胞培养用袋状容器包括包含所述疏水性材料的单层片、或含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的两层以上的层叠片。就氧气透过性及强度的观点而言，优选为含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的两层以上的层叠片。

(疏水剂)

作为疏水剂，只要为可解决本发明的课题者，则并无特别限制，优选为容易表现出表面层的疏水性的氟树脂和/或硅酮树脂。其中，更优选为聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)、聚氯三氟乙烯(polychloro trifluoroethylene，PCTFE)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)、聚氟乙烯(polyvinylfluoride，PVF)、含氟丙烯酸共聚物、含聚有机硅氧烷基的丙烯酸共聚物、硅油、及硅酮-烯烃共聚物，特别优选为含氟丙烯酸共聚物、含聚有机硅氧烷基的丙烯酸共聚物、硅油、及硅酮-烯烃共聚物。

所谓含氟丙烯酸共聚物，是指具有含氟单量体单元与丙烯酸单量体单元的共聚物，优选为具有含氟链段与丙烯酸链段的嵌段共聚物。

所谓含氟链段，是包含含氟单量体单元的链段(部分结构)。作为含氟单量体，优选为具有全氟烷基的单量体，更优选为具有碳数4～8的全氟烷基的单量体。

所谓丙烯酸链段，是包含丙烯酸系单量体单元的链段(部分结构)。所谓丙烯酸系单量体，是包含丙烯酸单量体及甲基丙烯酸单量体的用语。作为此种丙烯酸系单量体，可列举：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十六烷基酯、(甲基)丙烯酸十八烷基酯、及(甲基)丙烯酸2-乙基己酯等(甲基)丙烯酸烷基酯；(甲基)丙烯酸环己酯等(甲基)丙烯酸环烷基酯；(甲基)丙烯酸羟乙酯及(甲基)丙烯酸羟丁酯等(甲基)丙烯酸羟烷基酯；(甲基)丙烯酸缩水甘油酯；(甲基)丙烯酸苄酯；(甲基)丙烯酰胺等。作为含氟丙烯酸共聚物的市售品，可列举日油公司制造的莫迪帕(Modiper)F系列(F606、F206、F246、F906、F3636、及F226等)等。

所谓含聚有机硅氧烷基的丙烯酸共聚物，是指具有含聚有机硅氧烷基的单量体单元与丙烯酸单量体单元的共聚物，优选为具有含聚有机硅氧烷基的链段与丙烯酸链段的嵌段共聚物。

所谓含聚有机硅氧烷基的链段，是包含含聚有机硅氧烷基的单量体单元的链段(部分结构)。作为含聚有机硅氧烷基的单量体，优选为含聚甲基硅氧烷基的单量体或其一部分甲基被氢原子取代的改性体。

所谓丙烯酸链段，与所述含氟丙烯酸共聚物中的丙烯酸链段的含义相同。作为含氟丙烯酸共聚物的市售品，可列举日油公司制造的莫迪帕(Modiper)FS系列(FS700、FS710、FS720、FS730、及FS770等)等。

所谓硅油，是指在25℃下为液体的聚有机硅氧烷。作为聚有机硅氧烷，可列举：二甲基聚硅氧烷、甲基氢聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、烷基改性硅酮、氨基改性硅酮、环氧改性硅酮、羧基改性硅酮、巯基改性硅酮、氯烷基改性硅酮、烷基高级醇改性硅酮、醇改性硅酮、及聚醚改性硅酮等。作为硅油的市售品，可列举作为信越化学工业公司制造的硅油的KF-99(甲基氢硅油)及KF-96(二甲基硅油)等。

硅酮-烯烃共聚物是包含硅酮(包含硅氧烷键的高分子化合物)与烯烃(或聚烯烃)的共聚物。硅酮-烯烃共聚物可使用市售品，也可制造后使用。

作为硅酮-烯烃共聚物，优选为选自由接枝共聚物(接枝型)及嵌段共聚物(嵌段型)所组成的群组中的至少一种，更优选为嵌段共聚物。接枝型及嵌段型的硅酮-烯烃共聚物可参考国际公开第2011/083043号及日本专利特开2010-037555号公报等的记载来制造。

接枝型的硅酮-烯烃共聚物例如可通过在自由基引发剂的存在下，将聚烯烃树脂、及在Si原子上键结有至少一个脂肪族不饱和有机基与至少一个水解性基的硅化合物(含有不饱和基的硅烷偶合剂)进行热混合来制造。关于所述方法，可使用将聚烯烃树脂与所述硅化合物混合并母料化而成的颗粒(例如，“X-22-2101”(信越化学工业股份有限公司制造)、“X-22-2125H”(信越化学工业股份有限公司制造)、“BY27-001S”(东丽道康宁(Toray DowCorning)股份有限公司制造))、或者将所述硅化合物相对于聚烯烃树脂部分接枝聚合而成的颗粒(例如，“BY27-202H”(东丽道康宁(Toray Dow Corning)股份有限公司制造))。

嵌段型的硅酮-烯烃共聚物例如可通过在过渡金属催化剂的存在下，对具有末端双键的聚烯烃高选择性地加成硅烷化合物来制造。关于所述方法，可使用将过渡金属催化剂、所述聚烯烃及硅烷化合物进行母料化而成的颗粒。

作为过渡金属催化剂材料，可使用将氢硅烷(hydrosilane)与卤化过渡金属的混合悬浮溶液过滤而获得的滤液。卤化过渡金属是元素周期表第3族～第12族的过渡金属的卤化物。就获取的容易性及经济性的方面而言，优选为元素周期表第8族～第10族的过渡金属的卤化物，更优选为选自由铂、铑、铱、钌、锇、镍、及钯所组成的群组中的过渡金属的卤化物，特别优选为铂的卤化物。也可使用两种以上的卤化过渡金属。作为卤化过渡金属中所含的卤素，可列举：氟、氯、溴、及碘，就处理的容易性的方面而言，优选为氯。

具有末端双键的聚烯烃为包含一个以上的乙烯基的含末端双键的聚烯烃。作为包含一个以上的乙烯基的含末端双键的聚烯烃，并无特别限制，可使用公知者。含末端双键的聚烯烃的乙烯基以外的部分优选为选自乙烯均聚链、丙烯均聚链、或碳数2～50的烯烃中的两种以上的烯烃的共聚链。

在下述通式(10)～通式(14)表示嵌段型的硅酮-烯烃共聚物的非限定的例子。再者，以下的式中，n表示乙烯单元的重复数，m表示0～3的整数。

[化1]

作为聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、及聚氟乙烯(PVF)的市售品，可列举：大金(Daikin)工业公司制造的鲁布隆(Rubulon)系列(PTFE)、大金(Daikin)工业公司制造的乃奥隆(Neoflon)PCTFE系列(PCTFE)、大金(Daikin)工业公司制造的乃奥隆(Neoflon)PVDF系列(PVDF)、杜邦公司制造的泰德勒(Tedlar)(注册商标)PVF(PVF)等。

疏水剂的数量平均分子量优选为2000万～1000000万。疏水剂可单独使用一种，也可将两种以上组合而使用。

(热塑性树脂)

作为热塑性树脂，并无特别限制，可列举：聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚烯烃、聚环烯烃、及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等，优选为聚烯烃、聚环烯烃、及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等。作为聚烯烃的具体例，可列举：低密度聚乙烯(low-densitypolyethylene，LDPE)及高密度聚乙烯(high-density polyethylene，HDPE)等聚乙烯；聚丙烯(polypropylene，PP)；聚(4-甲基戊烯)等。聚烯烃中，优选为通过高压聚合法制造的直链状低密度聚乙烯。作为聚乙烯的市售品，可列举东曹公司制造的尼泊隆(Nipolon)-Z级、TZ250B；日本聚乙烯公司制造的UF420、UF421等。作为乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，可列举乙烯-乙酸乙烯酯共聚物及其皂化物。

热塑性树脂的数量平均分子量优选为2000万～1000000万。热塑性树脂可单独使用一种，也可将两种以上组合而使用。

(疏水性材料)

本发明中所使用的疏水性材料包含疏水剂及热塑性树脂，疏水剂与热塑性树脂的质量比为疏水剂：热塑性树脂＝1：5～1：1000的范围内。疏水性材料中的疏水剂与热塑性树脂的质量比优选为疏水剂：热塑性树脂＝1：5～1：100，更优选为1：10～1：100。疏水性材料的制造方法并无特别限定。例如，对于疏水剂与热塑性化树脂而言，可使用亨舍尔混合机、转鼓机、及分散机等进行混合，继而使用捏合机、辊磨机、超级混合机、亨舍尔混合机、修给(Schugi)混合机、立式制粒机(vertical granulator)、高速混合机、球磨机、钢磨机、砂磨机、振动磨机、磨碎机、及班伯里混合机等分批式混炼机、双轴挤出机、或单轴挤出机进行混合或熔融混炼，从而获得颗粒(pallet)状、粉体状、颗粒状、或珠状等形状的疏水性材料。以所述方式获得的疏水性材料也被称为母料或复合物(compound)。其中，优选为通过使用双轴挤出机的熔融捏合来制造疏水性材料的方法。

(表面层)

关于本发明的细胞培养用袋状容器，与细胞培养液接触的表面层为包含含有所述疏水剂与热塑性树脂的疏水性材料的层。表面层的厚度并无特别限制，优选为约20μm～200μm。表面层优选为片状。

(基材层)

基材层只要为适合作为细胞培养用袋状容器的基材者，则并无特别限制，可使用与所述表面层用的疏水性材料中使用的热塑性树脂相同者。特别是聚烯烃、聚环烯烃、及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物的氧透过性优异，因此可优选地使用。基材层的厚度并无特别限制，优选为约20μm～200μm。基材层优选为片状。

(片的成形法)

如所述般，本发明的细胞培养用袋状容器包括包含所述疏水性材料的单层片、或含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的层叠片，优选为包括含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的层叠片。

在本发明的细胞培养用袋状容器包括含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的层叠片的情况下，可同时实施基材层及表面层的片状成形与这些的层叠，也可在将基材层与表面层分别个别地成形为片状后，将这些贴合并层叠。作为单层或层叠的片的成形法，可列举：压延成形法、充气(inflation)成形法、T模挤出成形法、吹塑成形法、及层压法等。

(细胞培养用袋状容器)

本发明的细胞培养用袋状容器为如下的容器：将包含所述疏水性材料的单层片、或者含有基材层与包含所述疏水性材料的表面层的两层以上的层叠片加工成袋状。就处理方面而言，优选为在容器设置将细胞液导入至袋内的流入口(port)以及将袋内的细胞液导出的流出口。片整体的厚度优选为10μm～500μm。各层的厚度并无特别限制，可根据用途适宜变更。可将一枚或两枚的片加工成袋状来制作容器。在所述情况下，优选为通过热封法对一枚或两枚的片进行热熔接。

(细胞培养)

＜细胞＞

使用本发明的细胞培养用袋状容器的细胞培养可按照常规方法实施。作为可进行培养的细胞，可列举：脐带血细胞、造血干细胞、淋巴细胞、及杂交瘤细胞(hybridoma)等浮游细胞；肝细胞等形成器官的非贴壁依赖性细胞(anchorage-independent cell)等。

＜培养基＞

作为培养基，可使用公知的基础培养基，可列举：伊格尔(Eagle)最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)培养基、达尔伯克氏改良必需培养基(Dulbecco'sModified Essential Medium，DMEM)培养基、RPMI1640、HamF10培养基、及HamF12培养基等。

实施例

以下，通过实施例来更具体地说明本发明，但以下的实施例不对本发明作任何限制。再者，[实施例]的项中，只要未特别明确记载，则“份”及“％”分别是指“质量份”及“质量％”。表1表示使用的材料。

[硅酮-烯烃共聚物的制造]

(铂催化剂组合物(Cat1)的制备)

在放入有磁性搅拌器芯片的50ml样品管内，将氯化铂(II)0.5g悬浮在三乙氧基硅烷(10ml)中，在氮气流下、室温下进行搅拌。搅拌160小时后，利用注射器采集约0.4ml的反应液，使用开口直径0.45μm的PTFE过滤器进行过滤，在样品管中采集10ml的滤液。使用微量移液管(micropipette)秤量10μl的滤液，分取至10ml样品管中后，加入三乙氧基硅烷1.99ml，稀释200倍而获得铂催化剂组合物(Cat1)。

(铂催化剂组合物(Cat2)的制备)

在放入有磁性搅拌器芯片的50ml样品管内，将氯化铂(II)30mg悬浮在下述式所表示的硅烷化合物HS(A)(600μl)中，在氮气流下、室温下进行搅拌。搅拌100小时后，利用注射器采集约100μl的反应液，使用开口直径0.45μm的PTFE过滤器进行过滤，在样品管中采集10ml的滤液。使用微量移液管秤量10μl的滤液，分取至10ml样品管中后，加入硅烷化合物HS(A)1.99ml，稀释200倍而获得铂催化剂组合物(Cat2)。

[化3]

(单末端具有乙烯基的聚乙烯(PE1)的合成)

依照日本专利特开2003-73412号公报的实施例1中记载的方法，而合成单末端具有乙烯基的聚乙烯(PE1)(Mn＝730、Mw/Mn＝1.9)。

(硅酮-烯烃共聚物(S1)的制备)

在50ml的双颈烧瓶内装入所述单末端具有乙烯基的聚乙烯(PE1)1.0g(1.4mmol)，在氮气环境下装入三乙氧基硅烷254μl与所述的铂催化剂组合物(Cat1)15μl。在预先将液温升温至130℃的油浴中设置所述反应器，并搅拌内容液。约3分钟后，聚合物熔解。6小时后将反应器冷却，投入约30ml的甲醇。取出内容物并放入至100ml的烧杯内，搅拌2小时后进行过滤。利用甲醇清洗残留在滤纸上的固体，在60℃、2hPa以下的减压下使其干燥，从而获得白色固体的硅酮-烯烃共聚物(S1)(嵌段型)。

(硅酮-烯烃共聚物(S2)的制备)

在50ml的双颈烧瓶内装入所述单末端具有乙烯基的聚乙烯(PE1)1.0g(1.4mmol)，在氮气环境下装入所述HS(A)186μl与所述的铂催化剂组合物(Cat2)15μl。在预先将液温升温至130℃的油浴中设置所述反应器，并搅拌内容液。约3分钟后，聚合物熔解。6小时后将反应器冷却，投入甲醇约30ml。取出内容物并放入至100ml的烧杯内，搅拌2小时后进行过滤。利用甲醇清洗残留在滤纸上的固体，在60℃、2hPa以下的减压下使其干燥，从而获得硅酮-烯烃共聚物(S2)(嵌段型)。

[实施例1]

将疏水剂A1份与热塑性树脂A1000份投入超级混合机(川田(Kawata)公司制造)中，在25℃下搅拌3分钟而获得混合物。继而，将所述混合物投入至双轴挤出机(日本普拉康(Placon)公司制造)中，在160℃下进行熔融混炼并挤出，利用造粒机进行切割，由此获得复合状的疏水性材料。其次，使用作为表面层用材料的所述复合状的疏水性材料、作为基材层用材料的热塑性树脂B，在160℃下使用水冷式共挤出充气成形机，来制造包括表面层与基材层的筒状的层叠片。此时，在表面层的厚度为50μm、基材层的厚度为50μm的条件下进行成形。切断所述层叠片而获得两枚的10cm见方的层叠片。继而，通过设置细胞悬浮液的流入口及流出口的配置，以表面层成为袋状容器的内面侧的方式将所述两枚层叠片重合，通过热封法使两枚层叠片的边缘部彼此密接，从而制作细胞培养用袋状容器。

[实施例2～实施例75、比较例1～比较例3]

在各例中，如表2-1～表2-3所示般变更表面层及基材层的构成材料的种类与配方、以及表面层及基材层的厚度，除此以外与实施例1同样地进行而制作细胞培养用袋状容器。再者，在实施例4、实施例9、实施例13、实施例18、实施例22、实施例27、实施例31、实施例36、实施例40、实施例45、实施例49、实施例54、实施例58、实施例63、实施例69及比较例1中，仅使用复合状的疏水性材料而获得不具有基材层而仅包含表面层的单层片，使用所述单层片来制作细胞培养用袋状容器。

(评价)

按照以下所示的评价方法，对各例中获得的细胞培养用袋状容器进行评价。将评价结果示于表2-4～表2-6、表3-1～表3-3、表4-1～表4-3。

评价项目1.＜与水的接触角＞

基于日本工业标准(Japanese Industrial Standards，JIS)K 6788(国际标准化组织(International Standard Organization，ISO)8296)测定各例中获得的片的表面层的与水的接触角。

评价项目2.＜有机溶剂残存量＞

将各例中获得的10cm见方的片用作测定用试样。使用气相色谱仪GC(gaschromatograph)-8A(岛津制作所公司制造，使用火焰离子化检测器(flame ionizationdetector，FID)检测器，载气：氮，管柱填充物质(GL科技(GL Sciences)公司制造)：PEG-HT(5％)-单向转运(UNIPORT)HP(60/80目)，管柱尺寸：直径3mm×3m，试样投入温度(注入温度)：150℃，管柱温度：60℃，内部标准物质：正丁醇)，求出片的有机溶剂的残存量，按照以下基准进行评价。

评价基准：

○：有机溶剂的残存量为1ppm以下。良好。

×：有机溶剂的残存量为1ppm以上。不良。

评价项目3.＜氧气透过性＞

基于JIS K 7126-2(差压法)，对各例中获得的片测定23℃下的氧透过度(cc/m²·24hr·atm)。氧透过度越大越良好。按照以下基准进行评价。

评价基准：

◎：氧透过度为20cc/m²·24hr·atm以上。极其良好。

○：氧透过度为10cc/m²·24hr·atm以上且未满20cc/m²·24hr·atm。良好。

△：氧透过度为1cc/m²·24hr·atm以上且未满10cc/m²·24hr·atm。能够使用。

×：氧透过度未满1cc/m²·24hr·atm。不良。

评价项目4.＜透明性＞

使用紫外分光光度计，对各例中获得的片测定450nm下的透光率。透光率越高则透明性越良好。按照以下基准进行评价。

评价基准：

◎：透光率为95％以上。极其良好。

○：透光率为90％以上且未满95％。良好。

△：透光率为85％以上且未满90％。能够使用。

×：透光率为85％以下。不良。

评价项目5.＜抗体蛋白质吸附性＞

(试验条件)

板：96孔板、

酶、抗体：HPR-IgG(辣根过氧化酶免疫球蛋白G)、

染色液：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine，TMBZ)、反应停止液(Stop Solution)：宝生物工程(Takara Bio)公司制造利用不含硫酸的ELISA溶液进行的ELISA的清洗与停止液(WASH and Stop Solution For ELISA With Solutionfor ELISA without Sulfuric Acid)、

测定机器：MITHRAS2 LD943-M2M微盘读仪(Microplate Reader)。

(顺序)

1.将细胞培养用袋试样切成11mm见方，浸渍于利用磷酸缓冲生理食盐水(phosphate buffered saline，PBS)稀释10000倍的HPR-IgG溶液1ml中。

2.在室温下孵育1小时。

3.使用PBS-T(0.1％吐温(Tween)20)将各孔清洗4次。

4.将TMBZ溶液分注各1ml至各孔中，在室温下孵育10分钟。

5.将停止液分注各1ml至各孔中后，测定450nm(副波长650nm)的吸光度Aλ。吸光度Aλ越小则越良好。按照以下基准进行评价。

评价基准：

◎：吸光度Aλ≦0.2。极其良好。

○：0.2＜Aλ≦0.6。良好。

△：0.6＜Aλ≦0.8。能够使用。

×：0.8＜Aλ。不良。

评价项目6.＜细胞增殖倍率＞

在各例中获得的细胞培养用袋状容器内，放入含有悬浮有人白血病细胞株的MOLT-4细胞的10％胎牛血清的RPMI1640培养基(MOLT-4细胞株的接种浓度：1.0×10⁵细胞(cells)/毫升(ml))5ml，在37℃/5％二氧化碳/99％RH(relative humidity，相对湿度)的条件下培养14日。在所述培养后，自袋状容器中取样培养液的一部分，使用血细胞计(hemocytometer)算出袋内的细胞浓度与细胞增殖倍率。将评价结果示于表3-1～表3-3中。细胞增殖倍率越大则越良好。按照以下基准进行评价。

评价基准：

◎：细胞增殖倍率＞30倍。极其良好。

○：26倍＜细胞增殖倍率≦30倍。良好。

△：21倍＜细胞增殖倍率≦26倍。能够使用。

×：细胞增殖倍率≦21倍。不良。

评价项目7.＜冰箱保存性＞

将各例中获得的细胞培养用袋状容器在5℃的冰箱内保管一年。按照下述所示的基准目视判定细胞培养用袋状容器的表面层的状态。裂纹的大小越小、裂纹的数量越少，则越良好。按照以下基准进行评价。

评价基准：

◎：无裂纹。极其良好。

○：观察到长度未满1mm的小裂纹为4处以下。良好。

△：观察到长度未满1mm的小裂纹为5处以上且10处以下。能够使用。

×：观察到长度未满1mm的小裂纹为11处以上。或者观察到长度为1mm以上的大裂纹。不良。

评价项目8.＜热封强度＞

在使各例中获得的2枚片的表面层彼此接触的状态下，在140℃、0.4MPa、及1秒钟的条件下进行端部彼此的热封，制作试验片。使用所述试验片，并使用“英斯特朗(Instron)3345”(英斯特朗(Instron)公司制造)，在300mm/min的条件下基于JIS K6854-2进行180°剥离试验。将测定的剥离力设为热封强度。热封强度越大则越良好。按照以下基准进行评价。

评价基准：

◎：热封强度＞70N/25mm。极其良好。

○：40N/25mm＜热封强度≦70N/25mm。良好。

△：25N/25mm＜热封强度≦40N/25mm。能够使用。

×：热封强度≦25N/25mm。不良。

评价项目9.＜遮光性＞

在D65标准光源的照射下，利用与所述细胞增殖倍率相同的方法及基准进行评价。

如表2-4～表2-6、表3-1～表3-3、表4-1～表4-3所示，实施例1～实施例75的各例中获得的细胞培养用袋均为表面层的水接触角大(疏水性高)、无有机溶剂含量、氧气透过性、透明性、抗体蛋白质吸附性、细胞增殖倍率、冰箱保存性、热封性、及遮光性优异者。特别是在使用含氟丙烯酸共聚物、含聚有机硅氧烷基的丙烯酸共聚物、硅油、或硅酮-烯烃共聚物作为疏水剂的实施例中，这些评价结果极其优异。

与此相对，比较例1中获得的细胞培养用袋由于表面层不含疏水剂，故抗体蛋白质吸附性、细胞增殖倍率、及遮光性明显不良。另外，比较例2中获得的细胞培养用袋由于无法形成充分的疏水性表面，故抗体蛋白质吸附性、细胞增殖倍率、及遮光性明显不良。比较例3中获得的细胞培养用袋的透明性、抗体蛋白质吸附性、细胞增殖倍率、热封性、及遮光性不良。

[表1]

[表2-1]

[表2-2]

[表2-3]

[表2-4]

[表2-5]

[表2-6]

[表3-1]

[表3-2]

[表3-3]

[表4-1]

[表4-2]

[表4-3]

本申请主张以2017年3月7日提出申请的日本专利申请特愿2017-042382号为基础的优先权，将其公开的全部内容并入本文中。