JP2019154342A - 細胞培養用袋状容器及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、長期間の細胞培養でも、抗体タンパクの吸着が抑制でき、細胞の増殖を阻害しない細胞接着性の低い表面性状を有し、且つ耐衝撃強度に優れた細胞培養用袋状容器を提供することである。【解決手段】上記課題は、内部に細胞培養液を封入するために用いられ、基材層及び表面層を含む、二層以上の積層シートからなり、表面層が、細胞培養液と接する内面側に配置され、条件（１）〜（４）の全てを満たす、細胞培養用袋状容器によって解決される。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞培養用袋状容器及びその製造方法に関する。

再生医学を行う手法として、臓器組織の培養、細胞培養の利用、及び自己組織誘導の研究等がある。将来的には遺伝子操作をした豚等の体内で人間の臓器を養殖するという手法も考えられている。自己組織誘導については、細胞と、分化あるいは誘導因子（シグナル分子）と、足場の３つを巧みに組み合わせることによって、組織再生が可能になると見られている。従来の材料による機能の回復（工学技術にもとづく人工臓器）には困難が多く限界があること、臓器移植医療が移植適合性等の困難を抱えていることから、再生医学には大きな期待が寄せられている。従来、このような再生医療研究等に使用される細胞培養用容器としてはガラス製又は合成樹脂製のフラスコ又はシャーレが一般的であるが、これらは大量生産には不向きである。そこで、大量生産、輸送、及び廃棄の容易さから、袋状容器（バッグ）の開発が進められている。例えば、特許文献１には、ポリ（エチレンブチレン）ポリスチレンブロック共重合体を含むポリマーアロイからなる細胞培養用バッグが開示されている。

細胞培養用容器には優れた細胞増殖能が求められる。例えば、特許文献２には、フッ素ガスによってポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素置換されたポリエチレン製容器が開示されている。しかしながら、この技術では、毒性の高いフッ素ガスを使用しなければならない。また、短期間での細胞接着の抑制効果は認められるものの、フッ素ガス処理後のポリマーシートの表面が経時的に徐々に親水化するため、細胞接着の抑制効果を長期間維持することは難しい。

特許文献３には、支持体上に含フッ素化合物、好ましくは含フッ素ポリマーを含む表面層を有する細胞培養器材が開示されている。この技術では、含フッ素ポリマー等の含フッ素化合物を含む溶液を用いて、キャスト法等によってウェルプレート上に表面層を形成している。この方法では、表面層を形成する際の残留有機溶剤が細胞の生存に悪影響を及ぼす懸念がある。また、得られる細胞培養器材は、酸素ガス透過性、冷蔵保存性、透明性、及びヒートシール性等の、細胞培養袋状容器に必要とされる特性が不充分である。

また、特許文献４には、培養液と接するフィルムの表面層にフッ素系樹脂、アクリル-シリコーン樹脂又はシリコーンオイル等の撥水剤及び熱可塑性樹脂を含む表面層を有する細胞培養袋状容器が開示されている。しかしながら、この技術では、撥水剤と熱可塑性樹脂との相溶性不足から撥水剤がブリードアウトすることで、表面層の凝集力が低下し、細胞培養袋状容器の耐衝撃強度が低下する問題があった。

特開平３−６５１７７号公報 特開２００５−２１８４４４号公報 国際公開第２０１６／１２１９９４号 特許第６２０６６１２号公報

本発明は、長期間の細胞培養でも、抗体タンパクの吸着が抑制でき、細胞の増殖を阻害しない細胞接着性の低い表面性状を有し、且つ耐衝撃強度に優れた細胞培養用袋状容器及び該細胞培養用袋状容器の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは詳細に検討した結果、細胞培養用袋状容器の表面層が、シリコーン−オレフィン共重合体及び特定の熱可塑性樹脂を所定の比率で含む撥水性材料からなることにより、上記課題を解決しうることを見出した。具体的には、下記手段＜１＞により、好ましくは、＜２＞〜＜１６＞により、上記課題は解決された。

＜１＞内部に細胞培養液を封入するために用いられ、基材層及び表面層を含む、二層以上の積層シートからなり、前記表面層が、前記細胞培養液と接する内面側に配置された細胞培養用袋状容器であって、
下記（１）〜（４）の条件の全てを満たす、細胞培養用袋状容器。
（１） 前記表面層は、撥水剤及び熱可塑性樹脂を、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：１〜１：１０００の質量比の範囲で含む撥水性材料からなる。
（２） 前記撥水剤は、シリコーン−オレフィン共重合体である。
（３） 前記表面層に含まれる前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
（４） 前記基材層は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む。

＜２＞前記シリコーン−オレフィン共重合体が、グラフト共重合体及びブロック共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、＜１＞に記載の細胞培養用袋状容器。

＜３＞内部に細胞培養液を封入するために用いられ、基材層及び表面層を含む、二層以上の積層シートからなり、前記表面層が、前記細胞培養液と接する内面側に配置された細胞培養用袋状容器の製造方法であって、
下記（１１）〜（１５）の条件の全てを満たす、細胞培養用袋状容器の製造方法。
（１１） 撥水剤及び熱可塑性樹脂を、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：１〜１：１０００の質量比の範囲で含む、前記表面層用の撥水性材料を用意する。
（１２） 前記撥水性材料からなる前記表面層と熱可塑性樹脂からなる前記基材層とを含む前記積層シートを成形し、得られた当該積層シートを用いて前記細胞培養用袋状容器を形成する。
（１３） 前記撥水剤は、シリコーン−オレフィン共重合体である。
（１４） 前記撥水性材料に含まれる前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
（１５） 前記基材層用の前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。

＜４＞前記シリコーン−オレフィン共重合体が、グラフト共重合体及びブロック共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、＜３＞に記載の細胞培養用袋状容器の製造方法。

＜５＞前記積層シートの成形法が、インフレーション成形法、Ｔダイ押出成形法、及びブロー成形法からなる群より選ばれる少なくとも１種の成形法である、＜３＞又は＜４＞に記載の細胞培養用袋状容器の製造方法。

本発明によれば、長期間の細胞培養でも、抗体タンパクの吸着が抑制でき、細胞の増殖を阻害しない細胞接着性の低い表面性状を有し、且つ耐衝撃強度に優れた細胞培養用袋状容器及び該細胞培養用袋状容器の製造方法を提供することができる。

以下、本発明について説明する。尚、本明細書では、「細胞培養用袋状容器」を単に「袋状容器」又は「袋」と略記することがある。また、「（メタ）アクリル」とは、アクリル及び／又はメタクリルを意味する。
本発明は、内部に細胞培養液を封入するために用いられ、基材層及び表面層を含む、二層以上の積層シートからなり、前記表面層が、前記細胞培養液と接する内面側に配置された細胞培養用袋状容器に関し、下記（１）〜（４）の条件の全てを満たすことを特徴とする。
（１） 前記表面層は、撥水剤及び熱可塑性樹脂を、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：１〜１：１０００の質量比の範囲で含む撥水性材料からなる。
（２） 前記撥水剤は、シリコーン−オレフィン共重合体である。
（３） 前記表面層に含まれる前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
（４） 前記基材層は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む。

＜表面層＞
［撥水剤］
本発明の撥水剤はシリコーン−オレフィン共重合体である。シリコーンオレフィン共重合体は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である後述の熱可塑性樹脂との相溶性が高いことから、撥水性材料の凝集力を向上させ、胞培養袋状容器の耐衝撃強度に優れる効果を発揮する。

（シリコーン−オレフィン共重合体）
シリコーン−オレフィン共重合体は、シリコーン（シロキサン結合を含む高分子化合物）とオレフィン（又はポリオレフィン）とを含む共重合体である。シリコーン−オレフィン共重合体は、市販品を用いても、製造して用いてもよい。
シリコーン−オレフィン共重合体としては、グラフト共重合体（グラフトタイプ）及びブロック共重合体（ブロックタイプ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましく、ブロック共重合体がより好ましい。グラフトタイプ及びブロックタイプのシリコーン−オレフィン共重合体は、国際公開第２０１１／０８３０４３号及び特開２０１０−０３７５５５号公報等の記載を参考にして製造することができる。

グラフトタイプのシリコーン−オレフィン共重合体は例えば、フリーラジカル開始剤の存在下で、ポリオレフィン樹脂と、Ｓｉ原子に少なくとも１つの脂肪族不飽和有機基と少なくとも１つの加水分解性基が結合したシリコーン化合物（いわゆる不飽和基を有するシランカップリング剤）とを熱混合することにより製造することができる。この方法においては、ポリオレフィン樹脂と上記のシリコーン化合物とを混合しマスターバッチ化したペレット（例えば、「Ｘ−２２−２１０１」（信越化学工業株式会社製）、「Ｘ−２２−２１２５Ｈ」（信越化学工業株式会社製）、「ＢＹ２７−００１Ｓ」（東レ・ダウコーニング株式会社製））、あるいは、ポリオレフィン樹脂に対して上記のシリコーン化合物を部分グラフト重合したペレット（例えば、「ＢＹ２７−２０２Ｈ」（東レ・ダウコーニング株式会社製））を用いてもよい。

ブロックタイプのシリコーン−オレフィン共重合体は例えば、遷移金属触媒の存在下で、末端二重結合を有するポリオレフィンに対して高選択的にシラン化合物を付加することにより製造することがでる。この方法においては、遷移金属触媒と上記ポリオレフィンとシラン化合物とマスターバッチ化したペレットを用いてもよい。

遷移金属触媒材料として、ヒドロシランとハロゲン化遷移金属との混合懸濁溶液を濾過し、得られた濾液を用いることができる。ハロゲン化遷移金属は元素周期表第３族〜第１２族の遷移金属のハロゲン化物である。入手の容易さ及び経済性の点から、好ましくは元素周期表第８族〜第１０族の遷移金属のハロゲン化物、より好ましくは白金、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、オスミウム、ニッケル、及びパラジウムからなる群から選択される遷移金属のハロゲン化物、特に好ましくは白金のハロゲン化物である。二種以上のハロゲン化遷移金属を用いてもよい。ハロゲン化遷移金属に含まれるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素が挙げられ、取扱いの容易さの点で塩素が好ましい。

末端二重結合を有するポリオレフィンは、ビニル基を１つ以上含む末端二重結合含有ポリオレフィンである。ビニル基を１つ以上含む末端二重結合含有ポリオレフィンとしては特に制限されず、公知のものを用いることができる。末端二重結合含有ポリオレフィンのビニル基以外の部分は、エチレン単独重合鎖、プロピレン単独重合鎖、又は炭素数２〜５０のオレフィンから選択される２種以上のオレフィンの共重合鎖であることが好ましい。

下記一般式（１０）〜（１４）に、ブロックタイプのシリコーン−オレフィン共重合体の非限定的な例を示す。なお、以下の式中、ｎはエチレン単位の繰り返し数を表す０以上の整数であり、ｍは０〜３の整数を表す。

［熱可塑性樹脂］
本発明の熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
ポリオレフィンの具体例としては、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）及び高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）等のポリエチレン；ポリプロピレン（ＰＰ）；ポリ（４−メチルペンテン）等が挙げられる。ポリオレフィンの中でも、高圧重合法で製造される直鎖状低密度ポリエチレンが好ましい。ポリエチレンの市販品としては、東ソ―社製のニポロン―Ｚグレード、ＴＺ２５０Ｂ；日本ポリエチレン社製のＵＦ４２０、ＵＦ４２１等が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル共重合体としては、エチレン−酢酸ビニル共重合体及びそのケン化物が挙げられる。
熱可塑性樹脂は、数平均分子量が２０００〜１００００００万であることが好ましい。熱可塑性樹脂は、１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。組み合わせてもよい熱可塑性樹脂としては特に制限されず、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフレート等が挙げられる。

［撥水性材料］
本発明で用いられる撥水性材料は、撥水剤及び熱可塑性樹脂を含み、撥水剤と熱可塑性樹脂との質量比は、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：１〜１：１０００の範囲内である。撥水性材料中の撥水剤と熱可塑性樹脂との質量比は、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：５〜１：２００であることが好ましく、１：１０〜１：１００であることがより好ましい。撥水性材料の製造方法は特に限定されるものではない。例えば、撥水剤と熱可塑性化樹脂とを、ヘンシェルミキサー、タンブラー、及びディスパー等を用いて混合し、次いで、ニーダー、ロールミル、スーパーミキサー、ヘンシェルミキサー、シュギミキサー、バーティカルグラニュレーター、ハイスピードミキサー、ファーマトリックス、ボールミル、スチールミル、サンドミル、振動ミル、アトライター、及びバンバリーミキサー等の回分式混練機、二軸押出機、又は単軸押出機を用いて混合又は溶融混練して、ペレット状、粉体状、顆粒状、あるいはビーズ状等の形状の撥水性材料を得ることができる。このようにして得られる撥水性材料は、マスターバッチまたはコンパウンドとも呼ばれる。中でも、二軸押出機を用いた溶融混錬により撥水性材料を製造する方法が好ましい。

（表面層）
本発明の細胞培養用袋状容器において、細胞培養液と接する表面層は、上記の撥水剤と熱可塑性樹脂とを含む撥水性材料からなる層である。表面層の厚みは特に制限されず、好ましくは２０〜２００μｍであり、より好ましくは１０〜１００μｍである。表面層は、シート状であることが好ましい。

＜基材層＞
本発明の基材層は、上述した表面層用の撥水性材料で使用される熱可塑性樹脂と同様に、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン及びエチレン−酢酸ビニル共重合体は、酸素透過性が優れているため、好ましく使用することができる。
基材層の厚みは特に制限されず、好ましくは１０〜２００μｍであり、より好ましくは２０〜１００μｍである。基材層は、シート状であることが好ましい。

＜積層シート＞
（シートの成形法）
上記したように、本発明の細胞培養用袋状容器は、上記基材層と上記撥水性材料からなる表面層とを含む積層シートからなる。
基材層及び表面層のシート状の成形とこれらの積層は、同時に実施してもよいし、基材層と表面層とをそれぞれ個別にシート状に成形した後、これらを貼り合わせて積層してもよい。積層のシートの成形法としては、カレンダー成形法、インフレーション成形法、Ｔダイ押出成形法、ブロー成形法、及びラミネート法等が挙げられる。

＜細胞培養用袋状容器＞
本発明の細胞培養用袋状容器は、上記基材層と上記撥水性材料からなる表面層とを含む二層以上の積層シートを袋状に加工した容器である。容器には、細胞液を袋内に導入する流入ポートと袋内の細胞液を導出する流出ポートとを設けることが、取り扱いの上で好ましい。シート全体の厚みは、好ましくは１０〜５００μｍであり、より好ましくは１００〜３００μｍである。各層の厚みは特に制限されるものではなく、用途に応じて適宜変更することができる。１枚又は２枚のシートを袋状に加工して容器を作製することができる。この場合、ヒートシール法により１枚又は２枚のシートを熱融着することが好ましい。

＜細胞培養＞
［細胞］
本発明の細胞培養用袋状容器を用いた細胞培養は、常法に従って実施できる。培養できる細胞としては、臍帯血細胞、造血幹細胞、リンパ球細胞、及びハイブリドーマ等の浮遊細胞；肝細胞等の臓器を形成する足場非依存性細胞等が挙げられる。

［培地］
培地としては公知の基礎培地を用いることができ、イーグルＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０、ＨａｍＦ１０培地、及びＨａｍＦ１２培地等が挙げられる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を何ら制限するものではない。なお、［実施例］の項において、特に明記しない限り、「部」および「％」は、それぞれ「質量部」および「質量％」を意味する。表１に、使用した材料を示す。

＜シリコーン−オレフィン共重合体の製造＞
（白金触媒組成物（Ｃａｔ１）の調製）
マグネットスターラーチップを入れた５０ｍｌサンプル管内で、塩化白金（ＩＩ）０．５ｇをトリエトキシシラン（１０ｍｌ）中に懸濁し、窒素気流下、室温で攪拌した。１６０時間攪拌した後、シリンジにて反応液を約０．４ｍｌ採取し、開口径０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを用いて濾過し、サンプル管中に濾液を１０ｍｌ採取した。マイクロピペットを用いて濾液を１０μｌ秤取って１０ｍｌサンプル管中に分取した後、トリエトキシシラン１．９９ｍｌを加えて２００倍希釈し、白金触媒組成物（Ｃａｔ１）を得た。

（白金触媒組成物（Ｃａｔ２）の調製）
マグネットスターラーチップを入れた５０ｍｌサンプル管内で、塩化白金（ＩＩ）３０ｍｇを下記式で表されるシラン化合物ＨＳ（Ａ）（６００μｌ）中に懸濁し、窒素気流下、室温で攪拌した。１００時間攪拌した後、シリンジにて反応液を約１００μｌ採取し、開口径０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを用いて濾過し、サンプル管中に濾液を１０ｍｌ採取した。マイクロピペットを用いて濾液を１０μｌ秤取って１０ｍｌサンプル管中に分取した後、シラン化合物ＨＳ（Ａ）１．９９ｍｌを加えて２００倍希釈し、白金触媒組成物（Ｃａｔ２）を得た。

（片末端にビニル基を有するポリエチレン（ＰＥ１）の合成）
特開２００３−７３４１２号公報の実施例１に記載の方法に準じて、片末端にビニル基を有するポリエチレン（ＰＥ１）（Ｍｎ＝７３０、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９）を合成した。

（シリコーン−オレフィン共重合体（Ｓ１）の調製）
５０ｍｌの２ツ口フラスコ内に、上述の片末端にビニル基を有するポリエチレン（ＰＥ１）１．０ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を装入し、窒素雰囲気下、トリエトキシシラン２５４μｌと上述の白金触媒組成物（Ｃａｔ１）１５μｌとを装入した。予め液温を１３０℃に昇温しておいた油浴中に上記反応器をセットし、内容液を攪拌した。約３分後にポリマーは融解した。６時間後に反応器を冷却し、メタノールを約３０ｍｌ投入した。内容物を取り出して１００ｍｌビーカー内に入れ、２時間攪拌した後、濾過した。濾紙上に残った固体をメタノールで洗浄し、６０℃、２ｈＰａ以下の減圧下で乾燥させて、白色固体のシリコーン−オレフィン共重合体（Ｓ１）（ブロックタイプ）を得た。

（シリコーン−オレフィン共重合体（Ｓ２）の調製）
５０ｍｌの２ツ口フラスコ内に、上述の片末端にビニル基を有するポリエチレン（ＰＥ１）１．０ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を装入し、窒素雰囲気下、上述のＨＳ（Ａ）１８６μｌと上述の白金触媒組成物（Ｃａｔ２）１５μｌを装入した。予め液温を１３０℃に昇温しておいた油浴中に、上記反応器をセットし、内容液を攪拌した。約３分後にポリマーは融解した。６時間後に反応器を冷却し、メタノール約３０ｍｌを投入した。内容物を取り出して１００ｍｌビーカー内に入れ、２時間攪拌した後、濾過した。濾紙上に残った固体をメタノールで洗浄し、６０℃、２ｈＰａ以下の減圧下で乾燥させて、シリコーン−オレフィン共重合体（Ｓ２）（ブロックタイプ）を得た。

＜細胞培養袋状容器の製造＞
［実施例１］
撥水剤Ａ１部と熱可塑性樹脂Ａ１部とをスーパーミキサー（カワタ社製）に投入し、２５℃にて３分間撹拌して混合物を得た。次いで、この混合物を二軸押出し機(日本プラコン社製)に投入し、１６０℃で溶融混練して押し出し、ペレタイザーでカットすることで、コンパウンド状の撥水性材料を得た。次に、表面層用材料として上記コンパウンド状の撥水性材料、基材層用材料として熱可塑性樹脂Ｂ を用い、１６０℃で水冷式共押出インフレーション成形機を用いて、表面層と基材層とからなる筒状の積層シートを製造した。その際、表面層の厚さが５０μｍ、基材層の厚さが８０μｍとなる条件で成形した。この積層シートを切断して、２枚の１０ｃｍ角の積層シートを得た。次いで、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを設ける配置で、表面層が袋状容器の内面側となるように上記２枚の積層シートを重ね合わせ、２枚の積層シートの縁部同士をヒートシール法により密着させて細胞培養袋状容器を作製した。

［実施例２〜２６、参考例１〜２、比較例１〜４］
各例においては、表面層及び基材層の構成材料の種類と配合、ならびに表面層及び基材層の厚みを表２に示すように変更した以外は、実施例１ と同様にして、細胞培養袋状容器を作製した。尚、参考例１〜２及び比較例１では、コンパウンド状の撥水性材料のみを使用して基材層を有さない表面層のみからなる単層シートを得、これを用いて細胞培養袋状容器を作製した。

＜細胞培養袋状容器の評価＞
各例で得られた細胞培養用袋状容器について、以下に示す評価方法に従い評価を行った。評価結果を表３に示す。

評価項目１．＜水との接触角＞
各例において得られたシートの表面層における水との接触角を、ＪＩＳ Ｋ ６７８８（ＩＳＯ８２９６）に基づいて測定した。

評価項目２．＜抗体タンパク吸着性＞
（試験条件）
プレート：９６ウェルプレート、
酵素、抗体：ＨＰＲ-ＩｇＧ（ＨＯＲＳＥＲＡＤＩＨ ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＧ）、
染色液：ＴＭＢＺ（３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン）、
反応停止液（Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：タカラバイオ社製 ＷＡＳＨ ａｎｄ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ Ｗｉｔｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ、
測定機器：ＭＩＴＨＲＡＳ２ ＬＤ９４３−Ｍ２Ｍマイクロプレートリーダー。
（手順）
１．細胞培養用袋試料を１１ｍｍ角にカットし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１００００倍希釈したＨＰＲ-ＩｇＧ溶液１ｍｌ中に浸漬させた。
２．室温で１時間インキュベートした。
３．ＰＢＳ-Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて各ウェルを４回洗浄した。
４．ＴＭＢＺ溶液を各ウェルに１ｍｌずつ分注し、室温で１０分間インキュベートした。
５．Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに１ｍｌずつ分注後、４５０ｎｍ（副波長６５０ｎｍ）の吸光度Ａλを測定した。吸光度Ａλが小さいほど良好である。以下の基準で評価した。
評価基準：
◎：吸光度Ａλ≦０．２。極めて良好。
○：０．２＜Ａλ≦０．６。良好。
△：０．６＜Ａλ≦０．８。使用可能。
×：０．８＜Ａλ。不良。

評価項目３．＜細胞増殖倍率＞
各例において得られた細胞培養袋状容器内に、ヒト白血病細胞株のＭＯＬＴ−４細胞を懸濁した１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＯＬＴ−４細胞株の播種濃度：１.０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５ｍｌを入れ、３７℃／５％二酸化炭素／９９％ＲＨ（相対湿度）の条件で１４日間培養を行った。この培養後に袋状容器から培養液の一部をサンプリングし、ヘモサイトメーターを用いて袋内の細胞濃度と細胞増殖倍率を算出した。細胞増殖倍率が大きいほど良好である。以下の基準で評価した。
評価基準：
◎：細胞増殖倍率＞３０倍。極めて良好。
○：２６倍＜細胞増殖倍率≦３０倍。良好。
△：２１倍＜細胞増殖倍率≦２６倍。使用可能。
×：細胞増殖倍率≦２１倍。不良。

評価項目４．＜耐衝撃性＞
各例において得られたシートについて、東洋精機製フィルムインパクトテスターを使用し、直径１５ｍｍの半球状衝撃頭を用いて、２３℃におけるフィルムの衝撃強度を測定した。衝撃強度が高いほど耐衝撃強度が良好であり、以下の基準で評価した。
◎：衝撃強度が１００Ｋｇ・ｃｍ／ｍｍ以上である。極めて良好。
○：衝撃強度が８０Ｋｇ・ｃｍ／ｍｍ以上、１００Ｋｇ・ｃｍ／ｍｍ未満である。良好。
△：衝撃強度が５０Ｋｇ・ｃｍ／ｍｍ以上、８０Ｋｇ・ｃｍ／ｍｍ未満である。使用可能。
×：衝撃強度が５０Ｋｇ・ｃｍ／ｍｍ未満。不良。

評価項目５．＜有機溶剤残存量＞
各例において得られた１０ｃｍ角のシートを測定用試料として用いた。ガスクロマトグラフＧＣ−８Ａ（島津製作所社製、ＦＩＤ検出器使用、キャリアーガス：窒素、カラム充填物質（ジーエルサイエンス社製）：ＰＥＧ−ＨＴ（５％）−ＵＮＩＰＯＲＴ ＨＰ（６０／８０メッシュ）、カラムサイズ：直径３ｍｍ×３ｍ、試料投入温度（インジェクション温度）：１５０℃、カラム温度：６０℃、内部標準物質：ｎ‐ブタノール）を用い、シートの有機溶剤の残存量を求め、以下の基準で評価した。
評価基準：
○：有機溶剤の残存量が１ｐｐｍ以下である。良好。
×：有機溶剤の残存量が１ｐｐｍ以上である。不良。

評価項目６．＜酸素ガス透過性＞
各例において得られたシートについて、ＪＩＳ Ｋ ７１２６−２（差圧法）に基づいて、２３℃での酸素透過度（ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ）を測定した。酸素透過度が大きいものほど良好である。以下の基準で評価した。
評価基準：
◎：酸素透過度が２０ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上である。極めて良好。
○：酸素透過度が１０ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上、２０ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である。良好。
△：酸素透過度が１ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上、１０ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である。使用可能。
×：酸素透過度が１ｃｃ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である。不良。

評価項目７．＜透明性＞
各例において得られたシートについて、紫外分光光度計を用いて、４５０ｎｍにおける光透過率を測定した。光透過率が高いほど透明性が良好である。以下の基準で評価した。
評価基準：
◎：光透過率が９５％以上である。極めて良好。
○：光透過率が９０％以上、９５％未満である。良好。
△：光透過率が８５％以上、９０％未満である。使用可能。
×：光透過率が８５％以下。不良。

評価項目８．＜冷蔵庫保存性＞
各例において得られた細胞培養袋状容器を５℃の冷蔵庫内で、一年間保管した。下記に示す基準で細胞培養袋状容器の表面層の状態を目視判定した。ひび割れの大きさが小さく、ひび割れの数が少ないものほど、良好である。以下の基準で評価した。
評価基準：
◎：ひび割れがない。極めて良好。
○：長さ１ｍｍ未満の小さなひび割れが４箇所以下認められる。良好。
△：長さ１ｍｍ未満の小さなひび割れが５箇所以上１０箇所以下認められる。使用可能。×：長さ１ｍｍ未満の小さなひび割れが１１箇所以上認められる。または長さ１ｍｍ以上の大きなひび割れが認められる。不良。

評価項目９.＜ヒートシール強度＞
各例において得られた２枚のシートの表面層同士を接触させた状態で、１４０℃、０．４ＭＰａ、及び１秒間の条件で端部同士のヒートシールを行い、試験片を作製した。この試験片を用いて「インストロン３３４５」（インストロン社製）を用い、３００ｍｍ／分の条件にて、ＪＩＳ Ｋ６８５４‐２に基づいて１８０°剥離試験を行った。測定された剥離力をヒートシール強度とした。ヒートシール強度が大きいものほど、良好である。以下の基準で評価した。
評価基準：
◎：ヒートシール強度＞７０Ｎ／２５ｍｍ。極めて良好。
○：４０Ｎ／２５ｍｍ＜ヒートシール強度≦７０Ｎ／２５ｍｍ。良好。
△：２５Ｎ／２５ｍｍ＜ヒートシール強度≦４０Ｎ／２５ｍｍ。使用可能。
×：ヒートシール強度≦２５Ｎ／２５ｍｍ。不良。

評価項目１０．＜遮光性＞
Ｄ６５標準光源の照射下で上記の細胞増殖倍率と同じ方法及び基準で評価を行った。

表２及び３に示すように、実施例１〜２６の各例で得られた細胞培養用袋はいずれも、表面層の水接触角が大きく（撥水性が高く）、抗体タンパク吸着性、細胞増殖倍率、及び耐衝撃性に優れたものであった。また、さらに、有機溶剤含有量がなく、酸素ガス透過性、透明性、冷蔵庫保存性、ヒートシール性、及び遮光性に優れていた。特に、シリコーン−オレフィン共重合体として、シリコーン−オレフィン共重合体ブロックタイプを使用した実施例では、耐衝撃性が極めて優れていた。

これに対して、比較例１で得られた細胞培養用袋は、表面層が撥水剤を含まないため、抗体タンパク吸着性、細胞増殖倍率、及び耐衝撃性が著しく不良であった。比較例２の袋は、充分な疎水性表面を形成することができなかったため、抗体タンパク吸着性、及び細胞生存率が著しく不良であった。比較例３、４の袋は、表面層に撥水剤としてシリコーン−オレフィン共重合体を含まないため、耐衝撃性が低下していた。参考例１、２の袋は、基材層を有していないため、基材層を有する実施例と比較して、ヒートシール性の点で劣ることが示された。

Claims (5)

1. 内部に細胞培養液を封入するために用いられ、基材層及び表面層を含む、二層以上の積層シートからなり、前記表面層が、前記細胞培養液と接する内面側に配置された細胞培養用袋状容器であって、
   下記（１）〜（４）の条件の全てを満たす、細胞培養用袋状容器。
   （１） 前記表面層は、撥水剤及び熱可塑性樹脂を、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：１〜１：１０００の質量比の範囲で含む撥水性材料からなる。
   （２） 前記撥水剤は、シリコーン−オレフィン共重合体である。
   （３） 前記表面層に含まれる前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
   （４） 前記基材層は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む。
2. 前記シリコーン−オレフィン共重合体が、グラフト共重合体及びブロック共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の細胞培養用袋状容器。
3. 内部に細胞培養液を封入するために用いられ、基材層及び表面層を含む、二層以上の積層シートからなり、前記表面層が、前記細胞培養液と接する内面側に配置された細胞培養用袋状容器の製造方法であって、
   下記（１１）〜（１５）の条件の全てを満たす、細胞培養用袋状容器の製造方法。
   （１１） 撥水剤及び熱可塑性樹脂を、撥水剤：熱可塑性樹脂＝１：１〜１：１０００の質量比の範囲で含む、前記表面層用の撥水性材料を用意する。
   （１２） 前記撥水性材料からなる前記表面層と熱可塑性樹脂からなる前記基材層とを含む前記積層シートを成形し、得られた当該積層シートを用いて前記細胞培養用袋状容器を形成する。
   （１３） 前記撥水剤は、シリコーン−オレフィン共重合体である。
   （１４） 前記撥水性材料に含まれる前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
   （１５） 前記基材層用の前記熱可塑性樹脂は、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、及びエチレン−酢酸ビニル共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
4. 前記シリコーン−オレフィン共重合体が、グラフト共重合体及びブロック共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の細胞培養用袋状容器の製造方法。
5. 前記積層シートの成形法が、インフレーション成形法、Ｔダイ押出成形法、及びブロー成形法からなる群より選ばれる少なくとも１種の成形法である、請求項３又は４に記載の細胞培養用袋状容器の製造方法。