CN110327347A - G-749在制备抗真菌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种G‑749在制备抗真菌药物中的应用。体外细胞实验表明，G‑749对耐药白念珠菌103、白念珠菌SC5314、新生隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌具有不同程度的抗真菌甚至是杀真菌作用，因此可将G‑749用作抗真菌药物。目前临床上抗真菌谱广且具有杀真菌活性的药物非常少，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，蛋白激酶类抑制剂G‑749的抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，为临床高效治疗真菌甚至是耐药真菌的感染，提供新的治疗途径。

Description

G-749在制备抗真菌药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蛋白激酶类抑制剂8-溴-2-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-4-[(4-苯氧基苯基)氨基]吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮(常用名为G-749)在制备抗真菌药物中的应用。
背景技术
G-749是一个新型的FMS样的酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，Flt3)抑制剂，在白血病细胞中，G-749通过诱导细胞凋亡显示出抗增殖活性。目前处在临床研究的候选药物中，约20％-30％的药物为蛋白激酶类抑制剂。虽然蛋白激酶类抑制剂在肿瘤、糖尿病、风湿病等领域被广泛研究，在抗细菌感染方面近年也有许多研究报道，但在抗真菌感染领域研究较少。目前国内外未见G-749抗真菌作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种G-749在制备抗真菌药物中的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
G-749在制备抗真菌药物中的应用。
优选的，所述真菌为敏感真菌菌株或耐药真菌菌株。
进一步的，所述敏感真菌菌株为对氟康唑敏感的敏感真菌菌株，所述耐药真菌菌株为对氟康唑耐受的耐药真菌菌株。
优选的，所述真菌为克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)、耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、近平滑念珠菌或热带念珠菌。
优选的，G-749的MIC值为16μg/mL。
一种抗真菌药物，由G-749与药用辅料制成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过体外细胞实验表明，G-749对耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、新生隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌具有不同程度的抗真菌甚至是杀真菌作用，因此可将G-749用作抗真菌药物。本发明为G-749开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物。目前临床上抗真菌谱广且具有杀真菌活性的药物非常少，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，G-749的抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，为临床高效治疗真菌甚至是耐药真菌的感染，提供新的治疗途径。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提出一种G-749在制备抗真菌药物中的应用，其中：所述G-749为蛋白激酶类抑制剂(Flt3抑制剂)8-溴-2-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-4-[(4-苯氧基苯基)氨基]吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮，CAS号为1457983-28-6。
本发明中，所述真菌包括克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)、耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、近平滑念珠菌和热带念珠菌。
本发明中，所述耐药菌株是对氟康唑耐受，敏感菌株是对氟康唑敏感。
实施例1 G-749对不同真菌的作用
材料和方法
1.试药：
G-749(CAS号为1457983-28-6)：购于上海丹荃医药科技有限公司，纯度≥99％。
氟康唑：sigma公司，批号036M4709V。
二甲亚砜(DMSO)：天津市天力化学试剂有限公司。
各试药用DMSO配制，置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀。
2.菌株：
使用的菌株：包括1)敏感菌株：敏感白念珠菌(SC5314)，近平滑念珠菌(22019)，新生隐球菌(32609)；2)耐药菌株：耐药白念珠菌(103)，耐药热带念珠菌，天然耐药克柔念珠菌(ATCC2340)，天然耐药光滑念珠菌(ATCC2281)。菌株均惠赠于第二军医大学姜远英老师课题组，并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于35℃培养2-3天后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
3.培养液：
1)RPMI 1640液体培养液：
RPMI1640(Gibco)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165mol)，加三蒸水900mL溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0，三蒸水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜(Millipore)过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)：
蛋白胨10g，葡萄糖40g加三蒸水900mL溶解，加琼脂18g，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
3)YEPD培养液：
酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
4.仪器设备：
GHP-9080型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；
THZ-98C型恒温震荡箱(上海一恒科学仪器有限公司)；
SW-CT-IF型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。
5.G-749和氟康唑贮备液：
将购得的G-749称量，溶解于适量二甲基亚砜，配制成6.4mg/mL的药物溶液，放进冰箱-20℃备用。
氟康唑用DMSO溶解，配成浓度为6.4mg/mL，于-20℃保存备用。
6.菌液制备：
实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取各球状真菌少量，分别接种至1mL YEPD培养液，于35℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mL YEPD培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×103～5×103CFU/mL。
7.药敏板制备：
各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μL；2号孔加菌液200μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为6.4mg/mL的G-749或氟康唑各2μL。
对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终G-749和氟康唑浓度为64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于35℃恒温箱培养。
8.MIC值判定：
在35℃恒温箱中培养24h，观察实验结果，并确定其MIC值。观察结束后，放回恒温培养箱中，继续培养。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。实验结果见表1。
表1 G-749对各种真菌的MIC值(μg/mL)
由表1可见，G-749作用各种真菌24h后，对7种真菌(耐药白念珠菌、敏感白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌)的MIC值均为16μg/mL，这显示了G-749具有较广谱的抗真菌作用。
实施例2 G-749对各种真菌存活的影响
实验方法：
1、药物，菌株，材料同实施例1
2、实验步骤：
实验前，从4℃保存的SDA培养基上挑取菌克隆少量，接种至1mLYEPD培养液，于35℃，200rpm振荡培养16h，使真菌处于指数生长期后期。以RPMI1640培养液稀释并调整菌液浓度至1×105CFU/mL。分别于上述菌液中加入氟康唑使其终浓度为64μg/mL，化合物G-749终浓度为8μg/mL、16μg/mL和32μg/mL，空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5％。于35℃孵箱中，以200rpm振荡培养，分别于0h、24h，各样品分别取样，稀释不同浓度，涂铺于SDA平板，培养48小时后数克隆，计算各组的菌落存活数。实验结果见表2。
表2.G-749作用7种不同真菌后的存活菌落数(CFU/ml)
由表2可知，浓度为32μg/mL的G-749作用光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新生隐球菌24h后，菌落数由起始浓度约105CFU/ml变为103CFU/ml，这表明浓度为32μg/mL的G-749对这3种真菌均不仅具有较好的抑制生长作用，并表现杀菌活性，对7种真菌均具有不同程度的抑菌活性。
上述实验结果表明G-749具有抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，因此可用作抗真菌药物。

Claims (6)

1.G-749在制备抗真菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌为敏感真菌菌株或耐药真菌菌株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述敏感真菌菌株为对氟康唑敏感的敏感真菌菌株，所述耐药真菌菌株为对氟康唑耐受的耐药真菌菌株。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌为克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)、耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、近平滑念珠菌或热带念珠菌。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，G-749的MIC值为16μg/mL。
6.一种抗真菌药物，其特征在于，由G-749与药用辅料制成。
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