CN110302238A - 一种从苦槠果粉中提取黄酮的煎煮方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从苦槠果粉中提取黄酮的煎煮方法，苦槠树(Castanopsis sclerophylla)是山毛榉目，壳斗科，锥属乔木，分布于中国长江五岭以北各地。其果实外表与板栗类似，种仁富含淀粉，浸水脱涩后可制成富含黄酮等活性成分的果粉。本发明采用传统煎煮法，利用煎煮法结合响应面分析，通过析因实验筛选，以煎煮温度、煎煮时间、煎煮料液比为自变量，黄酮含量为响应值，采用Box‑Benhnken中心组合辅助优化提取条件。本发明有利于野生资源利用和山区农民致富，加速农村经济发展，一举两得。

Description

一种从苦槠果粉中提取黄酮的煎煮方法
技术领域
本发明具体涉及一种从苦槠果粉中提取黄酮的煎煮技术，属于生物 化工技术。
背景技术
苦槠(Castanopsis sclerophylla)是山毛榉目，壳斗科，锥属 乔木，布中国长江五岭以北各地，该种为常绿乔木，树冠浓密，圆球 形，抗CO等有毒气体，可用于园林绿化。苦槠树叶为厚革质，兼有 防风、避火作用，鲜叶可耐425℃的着火温度，还是很好的防火树种之一。苦槠果实种仁富含淀粉，浸水脱涩后可制成苦槠粉，进一步加 工可制成苦槠豆腐、苦槠粉丝、苦槠粉皮、苦槠糕，是防暑降温的佳 品。苦槠木材浅黄色或黄白色，结构致密、纹理直，富有弹性，耐湿 抗腐，是建筑、桥梁、家具、运动器材、农具及机械等的上等用材。 同时，苦槠的枝丫为优良的食用菌培养材料。
本发明采用传统煎煮技术提取苦槠果粉中黄酮，结合响应面分 析，通过析因实验筛选，以煎煮温度、煎煮时间、煎煮料液比为自变 量，黄酮提取量为响应值，采用Box-Benhnken中心组合辅助优化提 取条件。通过这项研究可得到最优的煎煮提取黄酮的方法，进行苦槠 果实中黄酮提取。
发明内容
发明目的：本方法探索煎煮法影响因素对苦槠果实中黄酮得率的影 发明以最终黄酮得率为标准，用传统煎煮技术进行黄酮提取，分光光 度法测定黄酮提取量。结合响应面分析，通过析因实验筛选，以煎煮 温度、煎煮时间、煎煮料液比为自变量，黄酮含量为响应值，采用 Box-Benhnken中心组合辅助优化提取条件，最后得出最优结果。技 术方案流程如下：
①黄酮标准曲线建立
精密称取20mg干燥至恒重的芦丁，置于小烧杯中，用少量60％ 乙醇使之溶解，再移至100mL容量瓶内定容，即为0.2mg/mL芦丁标 准品溶液。精密吸取标准品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL， 分别置于10mL容量瓶中，各加乙醇5.0，4.5，4.0，3.0，2.0，1.0，0mL，再加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加10％硝酸铝 溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液4mL， 用乙醇定容至10mL，放置15min，在波长510nm处测吸光度。以浓度 c对吸光度A作标准曲线，得回归方程，计算总黄酮得率。
②煎煮温度对苦槠粉中总黄酮含量的影响研究
准确称取1.00g苦槠粉，共称五份，按料液比1：40g/ml加水， 分为试样一、试样二、试样三、试样四、试样五。试样一加热至80℃， 试样二加热至85℃，试样三加热至90℃，试样四加热至95℃，试样 五加热至100℃。并维持60min，使苦槠粉中的总黄酮尽可能浸出。 煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣。所得滤液再用高 速离心机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提 取液。测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据C1、 C2、C3、C4、C5，并求得总黄酮得率最高的最适温度。
③煎煮料液比对苦槠粉中总黄酮含量的影响研究
准确称取1.00g苦槠粉，共称五份，分别按料液比1：30g/ml、 1：35g/ml、1：40g/ml、1：45g/ml、1:50g/ml加水，分为试样一、 试样二、试样三、试样四、试样五。按照②中最适温度加热并维持 50min。使苦槠粉中的总黄酮尽可能浸出。煎煮结束后，先用6层纱 布粗滤，滤去较大的残渣。所得滤液再用高速离心机4000r/min离心 15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液。测定吸光度，根据 标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据为V1、V2、V3、V4、V5，并 求得总黄酮得率最高的最适料液比。
④煎煮时间对苦槠粉中总黄酮含量的影响研究
准确称取1.00g苦槠粉，共称五份，按③中最适料液比加水，分 为试样一、试样二、试样三、试样四、试样五。按②中最适温度加热 并分别维持30min、40min、50min、60min、70min。使苦槠粉中的总 黄酮尽可能浸出。煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣。 所得滤液再用高速离心机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣， 最后得澄清提取液。测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量， 记录数据为T1、T2、T3、T4、T5。
⑤最佳煎煮方法的研究
结合响应面分析，通过析因实验筛选，采用Box-Benhnken中心 组合辅助优化提取条件，最后得出最优的煎煮工艺参数为：料液比为 1：43的时候，煎煮温度为90℃，煎煮时间54min，可获得最佳 黄酮提取效果。
有益效果
本发明是采用煎煮法进行苦槠果实中黄酮提取，具有提取效率 高、提取时间短；适应性广；有效成分易于分离、纯化；提取工艺运 行成本低；操作简单易行等优点。
附图说明
图1为黄酮标准曲线工作图；
图2煎煮温度对苦槠粉中总黄酮得率的影响曲线图；
图3料液比对苦槠粉中总黄酮得率的影响曲线图；
图4煎煮时间对苦槠粉中总黄酮得率的影响曲线图；
图5时间和温度对黄酮含量影响；
图6料液比和温度对黄酮含量的影响；
图7料液比和时间对黄酮含量的影响；
图8为技术方案流程图。
具体实施方式
以下结合附图具体说明本发明。
(1)黄酮标准曲线建立：
精密称取20mg干燥至恒重的芦丁，置于小烧杯中，用少量60％ 乙醇使之溶解，再移至100mL容量瓶内定容，即为0.2mg/mL芦丁标 准品溶液。精密吸取标准品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL， 分别置于10mL容量瓶中，各加乙醇5.0，4.5，4.0，3.0，2.0，1.0，0mL，再加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加10％硝酸铝 溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液4mL， 用乙醇定容至10mL，放置15min，在波长510nm处测吸光度。以浓度 c对吸光度A作标准曲线(见图1)，得回归方程，计算总黄酮得率。 所得标准曲线方程y＝1.7636x+0.0041,R2＝0.9991。
(2)单因素实验：
①煎煮温度对苦槠粉中总黄酮得率的影响
准确称取1.00g苦槠粉，共称五份，按料液比1：40g/ml加水， 分为试样一、试样二、试样三、试样四、试样五。试样一加热至80℃， 试样二加热至85℃，试样三加热至90℃，试样四加热至95℃，试样 五加热至100℃。并维持60min，使苦槠粉中的总黄酮尽可能浸出。 煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣。所得滤液再用高 速离心机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提 取液。测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据。
表1煎煮温度与总黄酮得率关系表
②煎煮料液比对苦槠粉总黄酮得率的影响
准确称取1.00g苦槠粉，共称五份，分别按料液比1：30g/ml、 1：35g/ml、1：40g/ml、1：45g/ml、1:50g/ml加水，分为试样一、 试样二、试样三、试样四、试样五。按照①中测得总黄酮得率最大时 的温度加热并维持50min。使苦槠粉中的总黄酮尽可能浸出。煎煮结 束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣。所得滤液再用高速离心 机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液。 测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据为V1、V2、 V3、V4、V5。
表2料液比与黄酮得率关系表
③煎煮时间对苦槠粉总黄酮得率的影响
准确称取1.00g苦槠粉，共称五份，按②中测得总黄酮得率最大 时的料液比加水，分为试样一、试样二、试样三、试样四、试样五。 按①中测得总黄酮得率最大时的温度加热并分别维持30min、40min、 50min、60min、70min。使苦槠粉中的总黄酮尽可能浸出。煎煮结束 后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣。所得滤液再用高速离心机 4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液。测 定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据为T1、T2、 T3、T4、T5。
表3煎煮时间与黄酮得率关系表
(3)单因素实验结果及分析
由图2可以看出随着温度升高所测得样液吸光度逐渐增大，在 90℃左右时吸光度最大；由图3可以看出在最好的温度下，随着料液 比的增加吸光度逐渐增大，在1:40左右处吸光度达到最大，随后料 液比增加，吸光度逐渐减小；由图4可以看出在最好的煎煮温度和料 液比的单因素条件下，煎煮时间控制在50min左右时，所得的吸光度 值最大。
(4)Box-Benhnken中心组合设计进行实验
根据Box-Benhnken中心组合设计原理，分别设置煎煮温度、煎 煮时间、煎煮料液比3个因素水平(见表4)。以黄酮含量为响应值， 实验结果见表5。回归方程的方差分析结果见表6。
表4实验因素水平表
表5析因实验结果
由表5可知：以煎煮温度(A)、煎煮时间(B)、煎煮料液比(C) 为自变量，黄酮含量(Y)为因变量，建立回归方程：Y＝0.011850+ 0.000071A+0.000000B-0.001205C-0.004608A*A-0.003049 B*B+0.000212C*C-0.000565A*B+0.000427A*C+0.004255B*C
表6回归方程的方差分析结果
由表6可知：对该模型进行方差分析及复相关系数考察，该模型 的P值为0.000<0.01，表明该模型显著性极好，温度的P值 0.850>0.05,说明温度对实验结果影响不显著，但温度×温度的P值 0.000<0.05，说明温度×温度对实验结果影响显著；时间的P值 0.975>0.05，但时间×时间的P值0.000<0.05，说明时间×时间对 实验结果影响显著；煎煮料液比P值0.036<0.05，说明料液比对实 验结果影响显著。
(5)利用MINITAB软件对实验结果进行分析
以煎煮温度、煎煮时间、煎煮料液比为自变量，黄酮含量为响应 值。析因实验显著性检验表及方差分析见表7。
表7析因实验显著性检验表及方差分析
Adj SS：调整后的离差平方和；Adj MS：调整后的均方差；F：综合评分；P<0.01， 结果极显著；0.01<P<0.05，结果显著。
利用MINITAB软件对析因实验结果进行分析，由表7可知，结果 显示煎煮料液比P值为<0.05，表明煎煮料液比对实验结果影响显著； 煎煮温度、煎煮时间P值>0.05，说明它们对实验结果影响不显著。 复相关系数为：94.72％，说明该模型可以对94.72％的实验结果进 行解释，可以用此模型对实验进行分析和预测。
(6)实验因素的交互作用分析：
实验因素之间交互作用的响应面立体分析图如图5-7所示。如图 5所示，时间和温度对黄酮含量影响；如图6所示，料液比和温度对 黄酮含量的影响；如图7所示，料液比和时间对黄酮含量的影响。
(7)结论
用软件对提取条件进行优化，得到最佳提取工艺为:煎煮温度为 90℃，煎煮时间为54min，煎煮料液比为1：43。

Claims (5)

1.一种从苦槠果粉中提取黄酮的煎煮方法，其特征在于，包括如下步骤：
①黄酮标准曲线建立
称取20mg干燥至恒重的芦丁，置于小烧杯中，用60％乙醇使之溶解，再移至100mL容量瓶内定容，即为0.2mg/mL芦丁标准品溶液；精密吸取一定量的标准品溶液，分别置于10mL容量瓶中，加入乙醇，再加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液4mL，用乙醇定容至10mL，放置15min，在波长510nm处测吸光度；以浓度c对吸光度A作标准曲线，得回归方程，计算总黄酮得率；
②煎煮温度对苦槠粉中总黄酮含量的影响研究
称取苦槠粉，按料液比1：40g/ml加水，分为多份试样并维持60min，使苦槠粉中的总黄酮浸出；煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣；所得滤液再用高速离心机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液；测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据，求得总黄酮得率最高的最适温度；
③煎煮料液比对苦槠粉中总黄酮含量的影响研究
称取苦槠粉，按试样比例加水，按照②中得出最适温度加热并维持50min；使苦槠粉中的总黄酮浸出；煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣；所得滤液再用高速离心机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液；测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据，求得总黄酮得率最高的最适料液比；
④煎煮时间对苦槠粉中总黄酮含量的影响研究
称取苦槠粉分为多份，按③中最适料液比加水，对应分为不同的多份试样，按②中最适温度加热并分别维持一定时间，使苦槠粉中的总黄酮浸出；煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣；所得滤液再用高速离心机4000r/min离心15min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液；测定吸光度，根据标准曲线计算得总黄酮含量，记录数据为T1、T2、T3、T4、T5；
⑤最佳煎煮方法的研究
结合响应面分析，通过析因实验筛选，采用Box-Benhnken中心组合辅助优化提取条件，最后得出最优的煎煮工艺参数为：料液比为1：43的时候，煎煮温度为90℃，煎煮时间54min，获得最佳黄酮提取效果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述①中一定量的标准品溶液分别是0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，依次加入乙醇5.0，4.5，4.0，3.0，2.0，1.0，0mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤②中称取的多份苦槠粉为5份，分为试样一、试样二、试样三、试样四、试样五；试样一加热至80℃，试样二加热至85℃，试样三加热至90℃，试样四加热至95℃，试样五加热至100℃；记录数据C1、C2、C3、C4、C5。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤③对应试样一、试样二、试样三、试样四、试样五，分别按料液比1：30g/ml、1：35g/ml、1：40g/ml、1：45g/ml、1:50g/ml加水，记录数据为V1、V2、V3、V4、V5。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述④中多份为5份，各5g，对应分为试样一、试样二、试样三、试样四、试样五，按②中最适温度加热并分别维持的一定为30min、40min、50min、60min、70min，对应记录的数据为记录数据为T1、T2、T3、T4、T5。
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