CN110235781A - 铁线莲Blekitny Aniol组织培养及再生体系建立 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及铁线莲观赏品种‘蓝天使’(‘Blekitny Aniol’)组织培养繁殖方法。包括以下步骤:(1)外植体的消毒;(2)带芽茎段诱导增殖培养;(3)愈伤组织分化培养;(4)组培苗生根培养(5)炼苗与移栽。本发明通过对‘蓝天使’的不同外植体诱导培养的方法进行了改进,解决了增殖系数低,分化率低,生根困难等问题,通过本方法培养出的‘蓝天使’组培苗很大程度上提高了增殖系数、分化率和生根率,成活率可达90%。
Description
技术领域:
本发明属于植物组织培养技术领域,设计一种培养方法,更具体的涉及一种铁线莲的观赏品种‘蓝天使’组织培养方法。
背景技术:
铁线莲隶属于毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis),多为木质藤本,少数为草本,是国际上著名的观赏花卉,铁线莲花型新颖,花色丰富,花量大,花期长,被誉为“藤本植物皇后”。还具有一定的抑制肿瘤活性作用,对清热解毒或祛风除湿具有显著疗效,具有很高的开发价值。
铁线莲观赏品种‘蓝天使’观赏价值高,但结实少、多为不可育种子,发芽率低,生产中通常采用扦插和压条繁殖,繁殖系数也较低,生长缓慢,难以满足市场要求。利用植物组织培养技术,不仅可以提高繁殖速度,还可保持植物优良的观赏特性。对于实现产业化开发具有重要的意义。前人对组织培养过程中出现的繁殖系数低,难以分化等问题还没有有效的方法,仍处在探索阶段。
发明内容:
针对目前技术中的不足,本发明的目的是提供一种可操作性强、重现性高且可以有效提高增殖系数、分化率和生根率的组织培养方法。
本发明采用的铁线莲组织培养方法,包含带芽茎段的腋芽诱导与增殖,茎段与叶片愈伤组织的诱导与分化,不定芽的生根与移栽,步骤如下:
(1)外植体选择与消毒过程;选取当年生长健壮的8-15cm嫩茎,茎叶分开,对外植体进行3-7min 的消毒处理,得到1cm的茎段、带芽茎段和1cm×1cm的叶片;
(2)侧芽诱导培养,将(1)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养,所述侧芽诱导培养基为在 MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;所述培养条件为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为 16h·d-1。
(3)愈伤组织诱导培养,将(1)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养;所述茎段愈伤组织诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1;叶片愈伤组织诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,2,4-二氯苯氧乙酸 (2.4-D)0.05mg·L-1;两种培养基蔗糖和琼脂含量一致,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;所述培养条件为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1。
(4)愈伤组织分化培养,将(3)中诱导的愈伤组织接入分化培养基;培养基配方为:在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.15mg·L-1,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;所述培养条件为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1。
(5)芽的继代增殖培养,将(1)和(4)中的芽接种至继代培养基,所述继代培养基配方:在1/2MS 培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;所述培养条件为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为 16h·d-1。
(6)生根培养过程中,将(5)中高2-3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,将蛭石作为支撑物每瓶40-50g, 20-25g·L-1蔗糖,并调节pH值为5.8-6.0;所述培养条件为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1。
(7)在(6)生根培养结束后,取出组培苗直接移植到基质中,在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿,保持空气湿度在80-90%,正常养护,移栽成活率可达90%。
与现有方法相比,本发明具有的有益效果在于:
1.本发明通过改进外植体消毒程序,对诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的配方改良,以提高繁殖效率,解决了铁线莲分化困难,增殖倍数低,不宜成活的问题,通过本方法培养出的铁线莲长势较好。
2.本发明采用蛭石替代琼脂作为生根阶段的支持物,有效解决了传统组织培养中透气性差,营养物质流动性小,难以吸收的问题,采用蛭石作为替代物,提高了组培苗的生根率和成活率,与琼脂相比,此无机基质省去了清洗根系的环节,不但简化了操作过程,也降低了成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步阐述本发明,这些实施例仅具有范例性质,而不对于本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应理解,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1
一种铁线莲组织培养方法,包括如下步骤:
(1)外植体预处理:选取当年生长健壮的10cm嫩茎,茎和叶分开,自来水冲去表面尘垢,在加洗洁精溶液浸泡10min后用流水漂洗15min,放入无菌瓶内;
(2)消毒:将(1)中处理的外植体在超净工作台上用75%酒精清洗10s后用无菌水冲洗3遍,然后将叶片在1%的NaClO溶液浸泡5min,茎段和带芽茎段浸泡7min,再次用无菌水冲洗3遍,将叶片切成约1cm×1cm,茎段和带芽茎段切成1cm;
(3侧芽诱导培养,将(2)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养,所述侧芽诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;培养条件均为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1;
(4)愈伤组织诱导培养,将(2)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养;其中茎段愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1;叶片愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D) 0.05mg·L-1;两种培养基蔗糖和琼脂含量一致,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值至5.8;
(5)愈伤组织分化培养,将(4)中诱导的愈伤组织接入分化培养基;培养基是在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.15mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;
(6)芽的继代增殖培养,将(3)和(5)中的芽接种至继代培养基,其中继代培养基是在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;
(7)生根培养,将(6)中高3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,将蛭石作为支撑物每瓶43g,25g·L-1蔗糖,并调节pH值为5.8;
(8)在(7)生根培养结束后,取出组培苗直接移植到基质中,在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿,正常养护。
实施例2
一种铁线莲组织培养方法,包括如下步骤:
(1)外植体预处理:选取当年生长健壮的8cm嫩茎,茎和叶分开,自来水冲去表面尘垢,在加洗洁精溶液浸泡8min后用流水漂洗13min,放入无菌瓶内;
(2)消毒:将(1)中处理的外植体在超净工作台上用75%酒精清洗10s后用无菌水冲洗3遍,然后将叶片在1%的NaClO溶液浸泡5min,茎段和带芽茎段浸泡6min,再次用无菌水冲洗3遍,将叶片切成约1cm×1cm,茎段和带芽茎段切成1cm;
(3)侧芽诱导培养,将(2)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养,所述侧芽诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.04mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;培养条件均为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1;
(4)愈伤组织诱导培养,将(2)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养;其中茎段愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1;叶片愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D) 0.1mg·L-1;两种培养基蔗糖和琼脂含量一致,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值至5.8;
(5)愈伤组织分化培养,将(4)中诱导的愈伤组织接入分化培养基;培养基是在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.12mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;
(6)芽的继代增殖培养,将(3)和(5)中的芽接种至继代培养基,其中继代培养基是在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;
(7)生根培养,将(6)中高3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.08mg·L-1,将蛭石作为支撑物每瓶43g,25g·L-1蔗糖,并调节pH值为5.8;
(8)在(7)生根培养结束后,取出组培苗直接移植到基质中,在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿,正常养护。
实施例3
一种铁线莲组织培养方法,包括如下步骤:
(1)外植体预处理:选取当年生长健壮的15cm嫩茎,茎和叶分开,自来水冲去表面尘垢,在加洗洁精溶液浸泡9min后用流水漂洗14min,放入无菌瓶内;
(2)消毒:将(1)中处理的外植体在超净工作台上用75%酒精清洗10s后用无菌水冲洗3遍,然后将叶片在1%的NaClO溶液浸泡4min,茎段和带芽茎段浸泡6min,再次用无菌水冲洗3遍,将叶片切成约1cm×1cm,茎段和带芽茎段切成1cm;
(3)侧芽诱导培养,将(2)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养,所述侧芽诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;培养条件均为:培养温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1;
(4)愈伤组织诱导培养,将(2)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养;其中茎段愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.03mg·L-1;叶片愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D) 0.08mg·L-1;两种培养基蔗糖和琼脂含量一致,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值至5.8;
(5)愈伤组织分化培养,将(4)中诱导的愈伤组织接入分化培养基;培养基是在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.13mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;
(6)芽的继代增殖培养,将(3)和(5)中的芽接种至继代培养基,其中继代培养基是在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1,25g·L-1蔗糖,6.5g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8;
(7)生根培养,将(6)中高3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.06mg·L-1,将蛭石作为支撑物每瓶43g,20g·L-1蔗糖,并调节pH值为5.8;
(8)在(7)生根培养结束后,取出组培苗直接移植到基质中,在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿,正常养护。
对比例1
本实施例的一种铁线莲组织培养方法,其培养基本步骤同实施例1,不同的是,分化培养基的配方是在 1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,生根培养基的支持物体为常规的琼脂6.5g·L-1。
对比上述实施例1-3的培养结果如下:
实施例1-3中,分化培养基的分化率在55%-63%,获得的不定芽数在8-10范围内,植株生长健壮,叶片浓绿,生根培养过程中,生根率为60-70%,移栽后的成活率均大于83%。
对比例1中,分化率为21%,获得的不定芽数为1-3范围内,增殖系数小,生根过程中,生根率为 65%,成活率80%,操作较为复杂。
由此可见,本发明的组织培养方法的改进,对铁线莲的增殖繁育结果有很大的影响,显著提高了铁线莲的分化率和生根率,可以为快速繁殖提供有效的技术支持,为满足市场需求提供了新途径。
上述是对本发明的具体实施例进行了描述,需要理解的是,本发明并不局限于上述实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说,在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改,所作的任何变化和更改,均在本发明保护范围之内。
Claims (3)
1.一种铁线莲观赏品种‘蓝天使’的组织培养方法,所述方法包括如下步骤:
(1)外植体选择与消毒过程;选取当年生长健壮的8-15cm嫩茎,茎叶分开,对外植体进行4-7min的消毒处理,得到1cm的茎段、带芽茎段和1cm×1cm的叶片;
(2)侧芽诱导培养,将(1)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养,所述侧芽诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;
(3)愈伤组织诱导培养,将(1)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养;所述茎段愈伤组织诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1;叶片愈伤组织诱导培养基配方:在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1,2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D)0.05mg·L-1;两种培养基蔗糖和琼脂含量一致,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;
(4)愈伤组织分化培养,将(3)中诱导的愈伤组织接入分化培养基;培养基配方为:在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.15mg·L-1,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;
(5)芽的继代增殖培养,将(1)和(4)中的芽接种至继代培养基,所述继代培养基配方:在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1,20-25g·L-1蔗糖,6-7g·L-1琼脂,并调节pH值为5.8-6.0;
(6)生根培养过程中,将(5)中高2-3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养,获得组培苗;所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1,将蛭石作为支撑物每瓶40-50g,20-25g·L-1蔗糖,并调节pH值为5.8-6.0;
(7)在(6)生根培养结束后,取出组培苗直接移植到基质中,在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿,保持空气湿度在80-90%,正常养护。
2.根据权利要求1所述的铁线莲组织培养方法,其特征为:选择外植体时,挑选当年生无病虫害的健壮嫩茎,然后进行预处理。消毒过程选择1%的NaClO溶液,叶片浸泡4-5min,茎段浸泡5-7min,后用无菌水冲洗3-5次。
3.根据权利要求1所述的铁线莲组织培养方法,其特征为:所述培养基pH值均为5.8-6.0,组织培养过程中培养条件均是温度为25±2℃,光照强度为2000lx,光周期为16h·d-1。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190917 |
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