CN110235781A - 铁线莲Blekitny Aniol组织培养及再生体系建立 - Google Patents

铁线莲Blekitny Aniol组织培养及再生体系建立 Download PDF

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Abstract

本发明涉及铁线莲观赏品种‘蓝天使’(‘Blekitny Aniol’)组织培养繁殖方法。包括以下步骤：(1)外植体的消毒；(2)带芽茎段诱导增殖培养；(3)愈伤组织分化培养；(4)组培苗生根培养(5)炼苗与移栽。本发明通过对‘蓝天使’的不同外植体诱导培养的方法进行了改进，解决了增殖系数低，分化率低，生根困难等问题，通过本方法培养出的‘蓝天使’组培苗很大程度上提高了增殖系数、分化率和生根率，成活率可达90％。

Description

铁线莲Blekitny Aniol组织培养及再生体系建立
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，设计一种培养方法，更具体的涉及一种铁线莲的观赏品种‘蓝天使’组织培养方法。
背景技术：
铁线莲隶属于毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis)，多为木质藤本，少数为草本，是国际上著名的观赏花卉，铁线莲花型新颖，花色丰富，花量大，花期长，被誉为“藤本植物皇后”。还具有一定的抑制肿瘤活性作用，对清热解毒或祛风除湿具有显著疗效，具有很高的开发价值。
铁线莲观赏品种‘蓝天使’观赏价值高，但结实少、多为不可育种子，发芽率低，生产中通常采用扦插和压条繁殖，繁殖系数也较低，生长缓慢，难以满足市场要求。利用植物组织培养技术，不仅可以提高繁殖速度，还可保持植物优良的观赏特性。对于实现产业化开发具有重要的意义。前人对组织培养过程中出现的繁殖系数低，难以分化等问题还没有有效的方法，仍处在探索阶段。
发明内容：
针对目前技术中的不足，本发明的目的是提供一种可操作性强、重现性高且可以有效提高增殖系数、分化率和生根率的组织培养方法。
本发明采用的铁线莲组织培养方法，包含带芽茎段的腋芽诱导与增殖，茎段与叶片愈伤组织的诱导与分化，不定芽的生根与移栽，步骤如下：
(1)外植体选择与消毒过程；选取当年生长健壮的8-15cm嫩茎，茎叶分开，对外植体进行3-7min 的消毒处理，得到1cm的茎段、带芽茎段和1cm×1cm的叶片；
(2)侧芽诱导培养，将(1)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养，所述侧芽诱导培养基为在 MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；所述培养条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为 16h·d-1。
(3)愈伤组织诱导培养，将(1)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养；所述茎段愈伤组织诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1；叶片愈伤组织诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，2,4-二氯苯氧乙酸 (2.4-D)0.05mg·L-1；两种培养基蔗糖和琼脂含量一致，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；所述培养条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1。
(4)愈伤组织分化培养，将(3)中诱导的愈伤组织接入分化培养基；培养基配方为：在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.15mg·L-1，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；所述培养条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1。
(5)芽的继代增殖培养，将(1)和(4)中的芽接种至继代培养基，所述继代培养基配方：在1/2MS 培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；所述培养条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为 16h·d-1。
(6)生根培养过程中，将(5)中高2-3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养，获得组培苗；所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，将蛭石作为支撑物每瓶40-50g， 20-25g·L-1蔗糖，并调节pH值为5.8-6.0；所述培养条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1。
(7)在(6)生根培养结束后，取出组培苗直接移植到基质中，在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿，保持空气湿度在80-90％，正常养护，移栽成活率可达90％。
与现有方法相比，本发明具有的有益效果在于：
1.本发明通过改进外植体消毒程序，对诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的配方改良，以提高繁殖效率，解决了铁线莲分化困难，增殖倍数低，不宜成活的问题，通过本方法培养出的铁线莲长势较好。
2.本发明采用蛭石替代琼脂作为生根阶段的支持物，有效解决了传统组织培养中透气性差，营养物质流动性小，难以吸收的问题，采用蛭石作为替代物，提高了组培苗的生根率和成活率，与琼脂相比，此无机基质省去了清洗根系的环节，不但简化了操作过程，也降低了成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，这些实施例仅具有范例性质，而不对于本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应理解，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1
一种铁线莲组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体预处理：选取当年生长健壮的10cm嫩茎，茎和叶分开，自来水冲去表面尘垢，在加洗洁精溶液浸泡10min后用流水漂洗15min，放入无菌瓶内；
(2)消毒：将(1)中处理的外植体在超净工作台上用75％酒精清洗10s后用无菌水冲洗3遍，然后将叶片在1％的NaClO溶液浸泡5min，茎段和带芽茎段浸泡7min，再次用无菌水冲洗3遍，将叶片切成约1cm×1cm，茎段和带芽茎段切成1cm；
(3侧芽诱导培养，将(2)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养，所述侧芽诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；培养条件均为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1；
(4)愈伤组织诱导培养，将(2)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养；其中茎段愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1；叶片愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D) 0.05mg·L-1；两种培养基蔗糖和琼脂含量一致，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值至5.8；
(5)愈伤组织分化培养，将(4)中诱导的愈伤组织接入分化培养基；培养基是在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.15mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；
(6)芽的继代增殖培养，将(3)和(5)中的芽接种至继代培养基，其中继代培养基是在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；
(7)生根培养，将(6)中高3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养，获得组培苗；所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，将蛭石作为支撑物每瓶43g,25g·L-1蔗糖，并调节pH值为5.8；
(8)在(7)生根培养结束后，取出组培苗直接移植到基质中，在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿，正常养护。
实施例2
一种铁线莲组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体预处理：选取当年生长健壮的8cm嫩茎，茎和叶分开，自来水冲去表面尘垢，在加洗洁精溶液浸泡8min后用流水漂洗13min，放入无菌瓶内；
(2)消毒：将(1)中处理的外植体在超净工作台上用75％酒精清洗10s后用无菌水冲洗3遍，然后将叶片在1％的NaClO溶液浸泡5min，茎段和带芽茎段浸泡6min，再次用无菌水冲洗3遍，将叶片切成约1cm×1cm，茎段和带芽茎段切成1cm；
(3)侧芽诱导培养，将(2)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养，所述侧芽诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.04mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；培养条件均为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1；
(4)愈伤组织诱导培养，将(2)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养；其中茎段愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1；叶片愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D) 0.1mg·L-1；两种培养基蔗糖和琼脂含量一致，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值至5.8；
(5)愈伤组织分化培养，将(4)中诱导的愈伤组织接入分化培养基；培养基是在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.12mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；
(6)芽的继代增殖培养，将(3)和(5)中的芽接种至继代培养基，其中继代培养基是在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；
(7)生根培养，将(6)中高3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养，获得组培苗；所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.08mg·L-1，将蛭石作为支撑物每瓶43g,25g·L-1蔗糖，并调节pH值为5.8；
(8)在(7)生根培养结束后，取出组培苗直接移植到基质中，在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿，正常养护。
实施例3
一种铁线莲组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体预处理：选取当年生长健壮的15cm嫩茎，茎和叶分开，自来水冲去表面尘垢，在加洗洁精溶液浸泡9min后用流水漂洗14min，放入无菌瓶内；
(2)消毒：将(1)中处理的外植体在超净工作台上用75％酒精清洗10s后用无菌水冲洗3遍，然后将叶片在1％的NaClO溶液浸泡4min，茎段和带芽茎段浸泡6min，再次用无菌水冲洗3遍，将叶片切成约1cm×1cm，茎段和带芽茎段切成1cm；
(3)侧芽诱导培养，将(2)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养，所述侧芽诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；培养条件均为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1；
(4)愈伤组织诱导培养，将(2)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养；其中茎段愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.03mg·L-1；叶片愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D) 0.08mg·L-1；两种培养基蔗糖和琼脂含量一致，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值至5.8；
(5)愈伤组织分化培养，将(4)中诱导的愈伤组织接入分化培养基；培养基是在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.13mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；
(6)芽的继代增殖培养，将(3)和(5)中的芽接种至继代培养基，其中继代培养基是在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1，25g·L-1蔗糖，6.5g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8；
(7)生根培养，将(6)中高3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养，获得组培苗；所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.06mg·L-1，将蛭石作为支撑物每瓶43g,20g·L-1蔗糖，并调节pH值为5.8；
(8)在(7)生根培养结束后，取出组培苗直接移植到基质中，在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿，正常养护。
对比例1
本实施例的一种铁线莲组织培养方法，其培养基本步骤同实施例1，不同的是，分化培养基的配方是在 1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，生根培养基的支持物体为常规的琼脂6.5g·L-1。
对比上述实施例1-3的培养结果如下：
实施例1-3中，分化培养基的分化率在55％-63％，获得的不定芽数在8-10范围内，植株生长健壮，叶片浓绿，生根培养过程中，生根率为60-70％，移栽后的成活率均大于83％。
对比例1中，分化率为21％，获得的不定芽数为1-3范围内，增殖系数小，生根过程中，生根率为 65％，成活率80％，操作较为复杂。
由此可见，本发明的组织培养方法的改进，对铁线莲的增殖繁育结果有很大的影响，显著提高了铁线莲的分化率和生根率，可以为快速繁殖提供有效的技术支持，为满足市场需求提供了新途径。
上述是对本发明的具体实施例进行了描述，需要理解的是，本发明并不局限于上述实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

Claims (3)

1.一种铁线莲观赏品种‘蓝天使’的组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体选择与消毒过程；选取当年生长健壮的8-15cm嫩茎，茎叶分开，对外植体进行4-7min的消毒处理，得到1cm的茎段、带芽茎段和1cm×1cm的叶片；
(2)侧芽诱导培养，将(1)中带芽茎段接种于侧芽诱导培养基进行培养，所述侧芽诱导培养基为在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；
(3)愈伤组织诱导培养，将(1)中叶片和茎段接种于愈伤组织诱导培养基进行培养；所述茎段愈伤组织诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.1mg·L-1；叶片愈伤组织诱导培养基配方：在MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg·L-1，2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D)0.05mg·L-1；两种培养基蔗糖和琼脂含量一致，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；
(4)愈伤组织分化培养，将(3)中诱导的愈伤组织接入分化培养基；培养基配方为：在1/2MS培养基中添加苯基噻二唑(TDZ)0.15mg·L-1，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；
(5)芽的继代增殖培养，将(1)和(4)中的芽接种至继代培养基，所述继代培养基配方：在1/2MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg·L-1，萘乙酸(NAA)0.01mg·L-1，20-25g·L-1蔗糖，6-7g·L-1琼脂，并调节pH值为5.8-6.0；
(6)生根培养过程中，将(5)中高2-3cm的组培苗接入生根培养基中进行诱导生根培养，获得组培苗；所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加萘乙酸(NAA)0.05mg·L-1，将蛭石作为支撑物每瓶40-50g，20-25g·L-1蔗糖，并调节pH值为5.8-6.0；
(7)在(6)生根培养结束后，取出组培苗直接移植到基质中，在苗上加盖一次性透明杯进行覆盖保湿，保持空气湿度在80-90％，正常养护。
2.根据权利要求1所述的铁线莲组织培养方法，其特征为：选择外植体时，挑选当年生无病虫害的健壮嫩茎，然后进行预处理。消毒过程选择1％的NaClO溶液，叶片浸泡4-5min，茎段浸泡5-7min，后用无菌水冲洗3-5次。
3.根据权利要求1所述的铁线莲组织培养方法，其特征为：所述培养基pH值均为5.8-6.0，组织培养过程中培养条件均是温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光周期为16h·d-1。
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