CN110234652A - 苯并咪唑衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可用于治疗蛋白激酶相关病症的苯并咪唑化合物。还涉及可用于治疗或预防一种或多种癌症，移植排斥症状的化合物。此外，还涉及通过本发明提供的化合物，调节蛋白激酶如CDK4和/或CDK6的活性的方法。

Description

苯并咪唑衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种用于抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的苯并咪唑化合物。具体而言，本发明提供了用作CDK4/6抑制剂的化合物及其药物组合物，以及治疗由CDK4/6介导的疾病如癌症的方法。
背景技术
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)介导细胞周期进程，调节从G1到S期和从G2到M期的转变。在整个细胞周期中通过后期修饰以及细胞周期蛋白和CDK抑制剂的表达严格控制CDK的活性。有四种增殖性CDKs：CDK1主要调节从G2到M期的转变，CDK2/4/6调节从G1到S期的转变。
细胞周期的进程是一个高度规范的过程。在没有适当的生长信号的情况下，包括视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的口袋蛋白家族可防止细胞进入DNA复制阶段(S期)。当有丝分裂原触发信号转导途径时，复制周期开始，导致D-细胞周期蛋白的细胞水平升高。相应地，D细胞周期蛋白激活可以磷酸化和灭活pRb的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)。
不受控制的细胞增殖是癌症的标志之一，pRb失活是使肿瘤细胞不经检测就进入细胞周期的关键事件。尽管一些肿瘤本身会删除pRb基因，但大多数会保留功能性pRb，而不是激活CDK4/6激酶的活性。消除CDK4/6激酶的活性会完全导致许多癌症类型如HR+乳腺癌，套细胞淋巴瘤，胶质母细胞瘤和鳞状细胞肺癌的肿瘤生长抑制。此外，正常成纤维细胞显示CDK4/6的缺失不受影响，这是由于不可缺失的CDK1的代偿作用。总之，这一证据表明CDK4/6的选择性抑制剂可能具有比CDK抑制剂更宽的治疗窗。
除了直接抗肿瘤作用外，研究发现CDK4/6抑制剂可治疗炎性疾病、骨病、代谢疾病、神经系统和神经退行性疾病，心血管疾病，过敏和哮喘，阿尔兹海默症和激素相关疾病。因此，在医药化学中人们已经付出了巨大的努力来找到有效的CDK4/6抑制剂作为治疗药物。
CDK1是细胞有丝分裂的关键调节因子，它是CDK家族中唯一启动有丝分裂开始的亚型。敲除小鼠CDK1基因的实验证明它对于动物细胞增殖是必需的[1]。鉴于CDK1在细胞增殖中的关键作用，抑制CDK1导致的毒性限制了很多泛CDK抑制剂成为药物，因此设计CDK4/6激酶为靶点的药物需要尽量的避免CDK1抑制活性。
CDK2结构和功能上与CDK1都有相关性，它与CDK4/6相比有更多的底物，可以磷酸化很多细胞周期相关蛋白，比如p27KIP1、RB、DNA复制相关因子、组蛋白合成、中心体复制等过程。与CDK4/6不同，CDK2不是受INK4调控，而是受其他的因子调控，这些因子通过结合到CDK2-cyclin复合物导致其失活。鉴于CDK2的重要生理功能，我们在设计CDK4/6的抑制剂时也应避免其抑制CDK2而造成的副作用。
除了常规调节细胞周期的CDK亚型如CDK4、6、2、1等分子，CDK家族还包括一些调节基因转录的亚型如CDK7、8、9，其中CDK7和9为主。CDK7和CDK9参与磷酸化RNA聚合酶II羧基末端结构域的磷酸化，从而调控基因转录[1]。第一代的CDK抑制剂大部分都是泛CDK抑制剂，而由于广泛的抑制而导致毒性问题没能够成药。比如临床研究最为透彻的夫拉平度，尽管它可以诱导细胞阻滞在G1和G2而导致肿瘤细胞增殖抑制，同时一定程度上它也会诱导细胞毒反应，极可能是通过了CDK7和CDK9介导的广泛的基因转录抑制，而因此导致了诸多毒性[2]。因此，在设计CDK4/6为靶点的药物时，应尽量避免CDK7/9的抑制。
目前，人们已经对很多CDK抑制剂进行了临床前评估和临床评估。鉴于上述依据，许多研究团队已开始发现CDK4/6选择性抑制剂，其中有熟知的Palbociclib(PD-0332991)，Ribociclib(LEE-011)和Abemaciclib(LY2835219)。然而，更有效、更具选择性以及安全性更好的CDK4/6抑制剂仍然是迫切需要的，以治疗细胞增殖性疾病如癌症。
参考文献：
[1].Uzma Asghar,Agnieszka K.Witkiewicz,Nicholas C.Turner,Et al.NatRev Drug Discov.2015,14(2):130-146.
[2].Prithviraj Bose,Gary L Simmons,Steven Grant.Expert Opin InvestigDrugs.2013,22(6):723-738.
发明内容
本发明涉及一种作为CDK4/6抑制剂和用于治疗由CDK4/6介导的疾病的苯并咪唑化合物。本发明的化合物具有式(I)的通式结构。本发明提供式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体，多晶型物、溶剂化物、其药学上可接受的盐或其药物前体，
其中，环A为芳基或杂芳基；
Z选自CH2、NH、O或S；
R1分别独立地选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氨基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、杂环基-(CH2)m-、芳基-C1-6烷基-、杂芳基-C1-6烷基-、-NR12R13、-NR12-C1-6亚烷基-NR12R13、或杂环基-C(O)-，其中C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、杂环基-(CH2)m-、芳基-C1-6烷基-、杂芳基-C1-6烷基-或杂环基-C(O)-是各自未取代或者被至少一个选自卤素、羟基、C1-8烷基、C3-8环烷基、杂环基、-NR12R13或-(CH2)t-OH的取代基取代；
R2和R3各自独立地选自氢、羟基、氰基、硝基、氨基、卤素、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；其中C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基或杂环基是各自未取代或者被至少一个选自卤素、羟基、C1-8烷基、C3-8环烷基或杂环基的取代基取代；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-8烷基、芳基、杂芳基、杂环基或C3-8环烷基；其中C1-8烷基、芳基、杂芳基、杂环基或C3-8环烷基是各自未取代或者被至少一个选自卤素、羟基、C1-8烷基、C3-8环烷基或杂环基的取代基取代；
m为0、1、2、3或4；
n为0、1、2、3或4；
t为0、1、2、3或4。
一些实施方式中，式(I)中的Z为CH2。
一些实施方式中，式(I)中的Z为O。
一些实施方式中，式(I)中的环A为包含1或2个N杂原子的6元杂芳基，例如为吡啶基、嘧啶基、哒嗪基等。
其他实施方式中，式(I)中的环A为
一些实施方式中，式(I)中的R1为杂环基-(CH2)m-，或被C1-8烷基、NR12R13、4-6元杂环基、C3-6环烷基或-(CH2)t-OH取代的杂环基-(CH2)m-。
其他实施方式中，式(I)中的R1为5-6元杂环基-CH2-，或被C1-3烷基、-N(CH3)2、-N(CH2CH2OH)CH3、-CH2OH、-CH2CH2OH或羟基取代的5-6元杂环基-CH2-。
其他实施方式中，式(I)中的R1为6元杂环基-CH2-，或者被甲基或乙基取代的6元杂环基-CH2-。
一些实施方式中，式(I)中的R1为杂环基或被C1-8烷基、NR12R13、4-6元杂环基、C3-6环烷基或-(CH2)t-OH取代的杂环基。
其他实施方式中，式(I)中的R1为5-6元杂环基，或被C1-3烷基、-N(CH3)2、-N(CH2CH2OH)CH3、-CH2OH,-CH2CH2OH或OH取代的5-6元杂环基。
其他实施方式中，式(I)中的R1为6元杂环基，或者被甲基或乙基取代的6元杂环基。
一些实施方式中，式(I)中的R1为6元杂环基-C(O)-，或者被C1-3烷基取代的6元杂环基-C(O)-。
其他实施方式中，式(I)中的R1为被甲基取代的6元杂环基-C(O)-。
一些实施方式中，式(I)中的杂环基含一个或两个N或O的杂原子作为环原子。
一些实施方式中，式(I)中的杂环基含一个或两个N杂原子作为环原子。
一些实施方式中，式(I)中R1为-NR12-C1-3亚烷基-NR12R13。
一些实施方式中，式(I)中R12和R13各自独立为H、-(CH2)t-OH或者C1-3烷基。
优选地，R12和R13各自独立地为OH、-CH2CH2OH、甲基或乙基。
其他实施方式中，式(I)中R1为
一些实施方式中，式(I)中m是1。
一些实施方式中，式(I)中n是1。
一些实施方式中，式(I)中t是0、1或2。
一些实施方式中，式(I)中R2和R3各自独立地为H、羟基、卤素、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷氧基。
其他实施方式中，式(I)中的R2和R3各自独立地为H、羟基、氟、氯、甲基、乙基、CF3、-OCH3或-OCF3。
其他实施方式中，式(I)中的R2和R3都为F。
本发明进一步提供了一些关于式(I)所示化合物的优选的技术方案，所述化合物是：
1)4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
2)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
3)5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
4)5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)嘧啶-2-胺；
5)5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶-2-基)嘧啶-2-胺；
6)N-(5-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)甲基)嘧啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
7)N-(5-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
8)N-(5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4，5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
9)(2-((5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮；
10)(6-((5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮；
11)N5-(2-(二乙基氨基)乙基)-N2-(5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-基)-N5-甲基吡啶-2,5-二胺；
12)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-胺；
13)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-5-甲基嘧啶-2-胺；
14)5-氯-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
15)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
16)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
17)N-(5-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
18)N-(5-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
19)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
20)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
21)N-(5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)哒嗪-3-胺；
22)6-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-N-(5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)哒嗪-3-胺；
23)(1-(6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)甲醇；
24)(1-((6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)甲基)吡咯烷-3-基)甲醇；
25)N-(5-(4-环丙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
26)N-(5-((4-环丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
27)2-((1-((6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)(甲基)氨基)乙醇；
28)1-(6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]恶嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)-3-甲基吡咯烷-3-醇；
29)1-((6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]恶嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)甲基)-3-甲基吡咯烷-3-醇；
30)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-((4-(氧杂环丁基-3-基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
31)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(4-(氧杂环丁基-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
32)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
33)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-((4'-甲基-[1,1'-双哌嗪]-4-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
34)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-((4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺。
出乎意料的是，在生物活性方面，式(I)中，旋光度为(-)的对映异构体优于其相应的旋光度为(+)的对映异构体。例如，化合物2(N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺)，旋光度为(-)的对映异构体比其旋光度为(+)的对映异构体更有效。
除非另有说明，本发明“(-)”表示旋光度为负值；“(+)”表示旋光度为正值。本发明所述化合物可以是旋光度为(-)的化合物和/或旋光度为(+)的对映异构体。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效治疗剂量的式(I)化合物或其治疗上可接受的盐和药学上可接受的辅料。
在一些实施例中，所述化合物与所述辅料的重量比约为0.001-10。
本发明进一步提供了本发明的化合物，其药学上可接受的盐或上述提及的药物组合物在制备药物中的应用。
在一些实施例中，所述药物应用为治疗癌症，例如结肠癌、直肠癌、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞食管癌、脂肪肉瘤、T细胞淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌、脑癌或肺癌。
在一些实施例中，所述药物为CDK抑制剂，优选CDK4和/或CDK6抑制剂。
本发明提供了一种治疗受试者癌症的方法，包括向治疗对象施用治疗有效量的本发明化合物，其药学上可接受的盐或上述药物组合物。特别地，所述癌症选自结肠癌、直肠癌、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞食管癌、脂肪肉瘤、T细胞淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌、脑癌或肺癌。
本发明进一步提供了一种给患者治疗由CDK，如CDK4和/或CDK6介导的疾病的方法，包括向治疗对象施用治疗有效量的本发明化合物、其药学上可接受的盐或上述药物组合物。
上述结构通式中使用的一般化学术语具有通常的含义。例如，除非另有说明，本文所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。优选的卤素基团包括氟、氯和溴。
在本文中，除非另有说明，“烷基”包括直链或支链的一价饱和烃基。例如，烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、3-(2-甲基)丁基、2-戊基、2-甲基丁基、新戊基、正己基、2-己基、2-甲基戊基等。类似的，“C1-8烷基”中的“C1-8”是指包含有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链或支链形式排列的基团。
烯基和炔基包括直链或支链的烯基和炔基。同样地，“C2-8烯基”和“C2-8炔基”是指含有2、3、4、5、6、7或者8个碳原子以直链或支链形式排列的烯基或炔基。
“烷氧基”是指前述的直链或支链烷基的氧醚形式，即-O-烷基。
在本文中，“一”、“一个”、“该”、“至少一个”和“一个或多个”可互换使用。因此，例如，包含“一种”药学上可接受的赋形剂的组合物可以被解释为表示该组合物包括“一种或多种”药学上可接受的赋形剂。
术语“芳基”，在本文中，除非另有说明，是指未取代或取代的包括碳环的原子的单环或稠环芳香基团。优选芳基为6到10元的单环或双环的芳香环基团。优选为苯基、萘基。最优选为苯基。
术语“杂环基”，在本文中，除非另有说明，是指由碳原子和1-3个选自N、O或S的杂原子组成的未取代或取代的3-8元稳定饱和单环系统，其中氮或硫杂原子可以选择性地被氧化，并且氮杂原子可以选择性地被季铵化。该杂环基可以被连接到任何的杂原子或碳原子上以形成稳定的结构。这些杂环基的实例包括但不限于氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧代哌嗪基、氧代哌啶基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢咪唑基、四氢噻唑基、四氢恶唑基、四氢吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜基和四氢恶二唑基。
术语“杂芳基”，在本文中，除非另有说明，是指未取代或取代的稳定的五元或六元单环芳族环系统或未取代或取代的九元或十元苯并稠合杂芳族环系统或双环杂芳族环系统，其由碳原子和1-4个选自N、O或S的杂原子组成，并且其中所述氮或硫杂原子可以选择性地被氧化，所述氮杂原子可以选择性地被季铵化。杂芳基可以连接在任何杂原子或碳原子上以形成稳定的结构。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、呋喃基、咪唑基、异恶唑基、恶唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、吡啶基、哒嗪基、吲哚基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并异恶唑基、苯并噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基腺嘌呤、喹啉基或异喹啉基。
术语“环烷基”是指具有3-12个碳原子的环状饱和烷基链，例如，环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
术语“取代的”是指基团中的一个或多个氢原子分别被相同的或者不同的取代基所取代。典型的取代基包括但不限于卤素(F、Cl、Br或I)、C1-8烷基、C3-12环烷基、-OR1、-SR1、＝O、＝S、-C(O)R1、-C(S)R1、＝NR1、-C(O)OR1、-C(S)OR1、-NR1R2、-C(O)NR1R2、氰基、硝基、-S(O)2R1、-O-S(O2)OR1、-O-S(O)2R1、-OP(O)(OR1)(OR2)；其中R1和R2独立地选自-H，C1-6烷基，C1-6卤代烷基。在一些实施例中，取代基独立地选自包含-F、-Cl、-Br、-I、-OH、三氟甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、-SCH3、-SC2H5、甲醛基、-C(OCH3)、氰基、硝基、-CF3、-OCF3、氨基、二甲基氨基、甲硫基、磺酰基和乙酰基的基团。
取代烷基的实例包括但不限于2-氨基乙基、2-羟乙基、五氯乙基、三氟甲基、甲氧基甲基、五氟乙基和哌嗪基甲基。
取代烷氧基的实例包括但不限于氨基甲氧基、三氟甲氧基、2-二乙基氨基乙氧基、2-乙氧基羰基乙氧基、3-羟基丙氧基。
术语“药学上可接受的盐”是指从药学上可接受的无毒的碱或酸制备的盐。当本发明提供的化合物是酸时，可以从药学上可接受的无毒的碱，包括无机碱和有机碱，方便地制得其相应的盐。从无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜(高价和低价)、三价铁、亚铁、锂、镁、锰(高价和低价)、钾、钠、锌之类的盐。特别优选铵、钙、镁、钾和钠的盐。药学上可接受的能够衍生成盐的无毒有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺，也包括环胺及含有取代基的胺，如天然存在的和合成的含取代基的胺。能够成盐的其他药学上可接受的无毒有机碱，包括离子交换树脂以及精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N',N'-二苄乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲胺基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡萄糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸，甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
当本发明提供的化合物是碱时，可以从药学上可接受的无毒的酸，包括无机酸和有机酸，方便制得其相应的盐。这样的酸包括，如，醋酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸等。较优地，柠檬酸、氢溴酸、甲酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。更优地，甲酸和盐酸。由于式(I)所示化合物将作为药物应用，较优地，使用一定纯度，例如，至少为60％纯度，比较合适的纯度为至少75％，特别合适地纯度为至少98％(％是重量比)。
本发明的化合物也可以药学上可接受的盐的形式存在。为了药物应用，本发明化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。药学上可接受的盐的形式包括药学上可接受的酸/阴离子或碱/阳离子盐。药学上可接受的酸/阴离子盐一般以碱性氮与无机酸或有机酸质子化的形式存在。典型的有机或无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸、草酸、扑酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己胺磺酸、水杨酸、糖精酸或三氟乙酸。药学上可接受的碱/阳离子盐，包括但不限于，铝盐、钙盐、氯普鲁卡因盐、胆碱、二乙醇胺盐、乙二胺、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐和锌盐。
本发明化合物的药物前体包含在本发明的保护范围内。通常，所述药物前体是指很容易在体内转化成所需化合物的功能性衍生物。例如，本申请化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐或其它衍生物，其在向受体施用后能够直接或间接地提供本申请的化合物或其具有药学活性的代谢物或残基。特别优选的衍生物或前药是在施用于患者时可以提高本申请化合物生物利用度的那些化合物(例如，可以使口服的化合物更易于被吸收到血液中)，或者促进母体化合物向生物器官或作用位点(例如脑部或淋巴系统)递送的那些化合物。因此，本发明提供的治疗方法中的术语“给药”是指施用能治疗不同疾病的本发明公开的化合物，或虽未明确公开但对受试者给药后能够在体内转化为本发明公开的化合物的化合物。有关选择和制备合适药物前体衍生物的常规方法，已记载在例如《药物前体设计》(Design of Prodrugs,ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985)这类书中。
显然的，一个分子中任何取代基或特定位置的变量的定义是独立于分子中其他位置的。很容易理解，本领域普通技术人员可以通过现有技术手段及本发明中所述的方法来选择本发明中的化合物的取代基或取代形式，以获得化学上稳定且易于合成的化合物。
本发明所述化合物可能含有一个或多个不对称中心，并可能由此产生非对映异构体和光学异构体。本发明包括所有可能的非对映异构体及其外消旋混合物、其基本上纯的拆分对映异构体、所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。
我们发现，本发明化合物的光学纯(-)对映异构体是更有效的CDK4/6抑制剂。本发明包括了治疗受试对象的由CDK4/6介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试对象施用一定量的(-)对映异构体或其药学上可接受的盐，基本上不含(+)对映异构体，所述量是指足以减轻疾病，但不足以引起不良反应的量。
术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指相对于(+)对映异构体，该组合物含有更大比例或百分比的(-)对映异构体，所述百分比为基于混合物的总量。在一个实施方案中，术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指该组合物含有至少60％重量的(-)对映异构体和40％或更少重量的(+)对映异构体。在一个优选的实施方案中，术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指该组合物含有至少70％重量的(-)对映异构体和30％或更少重量的(+)对映异构体。在另一个实施方案中，术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指该组合物含有至少80％重量的(-)对映异构体和20％或更少重量的(+)对映异构体。进一步地，术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指该组合物包含至少90％重量的(-)对映异构体和10％或更少重量的(+)对映异构体。更进一步地，术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指该组合物含有至少95％重量的(-)对映异构体和5％或更少重量的(+)对映异构体。更进一步地，术语“基本上不含其(+)对映异构体”是指该组合物含有至少99％重量的(-)对映异构体和1％或更少重量的(+)对映异构体。
上述式(I)没有确切定义该化合物某一位置的立体结构。本发明包括式(I)所示化合物的所有立体异构体及其药学上可接受的盐。进一步地，立体异构体的混合物及分离出的特定的立体异构体也包括在本发明中。制备此类化合物的合成过程中，或使用本领域普通技术人员公知的外消旋化或差向异构化的过程中，制得的产品可以是立体异构体的混合物。
当式(I)所示化合物存在互变异构体时，除非特别声明，本发明包括任何可能的互变异构体和其药学上可接受的盐，及它们的混合物。
当式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐存在溶剂化物或多晶型时，本发明包括任何可能的溶剂化物和多晶型。形成溶剂化物的溶剂类型没有特别的限定，只要该溶剂是药理学上可以接受的。例如，水、乙醇、丙醇、丙酮等类似的溶剂都可以采用。
术语“组合物”，在本文中，是指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接地由指定量的各指定成分的组合生产的任何产品。因此，含有本发明的化合物作为活性成分的药物组合物以及制备本发明化合物的方法也是本发明的一部分。此外，化合物的一些结晶形式可以多晶型存在，并且此多晶型包括在本发明中。另外，一些化合物可以与水(即水合物)或常见的有机溶剂形成溶剂化物，并且此类溶剂化物也落入本发明的范围内。
本发明提供的药物组合物包括作为活性组分的式(I)所示化合物(或其药学上可接受的盐)、一种药学上可接受的赋形剂及其他可选的治疗组分或辅料。尽管任何给定的情况下，最适合的活性组分给药方式取决于接受给药的特定的主体、主体性质和病情严重程度，但是本发明的药物组合物包括适于口腔、直肠、局部和不经肠道(包括皮下给药、肌肉注射、静脉给药)给药的药物组合物。本发明的药物组合物可以方便地以本领域公知的单位剂型存在和药学领域公知的任何制备方法制备。
实际上，根据常规的药物混合技术，本发明式(I)所示化合物，或药物前体，或代谢物，或药学上可接受的盐，可以作为活性组分，与药物载体混合成药物组合物。所述药物载体可以采取各种各样的形式，这取决于期望采用的给药方式，例如，口服或注射(包括静脉注射)。因此，本发明的药物组合物可以采用适于口服给药的独立单元，如包含预定剂量的活性组分的胶囊剂、扁囊剂或片剂。进一步地，本发明的药物组合物可采用粉末、颗粒、溶液、水性悬浮液、非水液体、水包油型乳液，或油包水型乳液形式。另外，除了上述提到的常见的剂型，式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，也可以通过控释的方式和/或输送装置给药。本发明的药物组合物可以采用任何制药学上的方法制备。一般情况下，这种方法包括使活性组分和组成一个或多个必要成分的载体缔合的步骤。一般情况下，所述药物组合物经由活性组分与液体载体或精细分割的固体载体或两者的混合物经过统一的密切的混合制得。另外，该产品可以方便地制备成所需要的外观。
因此，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体和式(I)所示化合物或其立体异构体、互变异构体，多晶型物、溶剂化物、其药学上可接受的盐、其药物前体。式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，与其他一种或多种具有治疗活性的化合物的联合用药也包括在本发明的药物组合物中。
本发明采用的药物载体可以是，例如，固体载体、液体载体或气体载体。固体载体，包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸。液体载体，包括糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体，包括二氧化碳和氮气。制备药物口服制剂时，可以使用任何制药学上方便的介质。例如，水、乙二醇、油类、醇类、增味剂、防腐剂、着色剂等可用于口服的液体制剂如悬浮剂、酏剂和溶液剂；而载体，如淀粉类、糖类、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等可用于口服的固体制剂如散剂、胶囊剂和片剂。考虑到易于施用，口服制剂首选片剂和胶囊，在此应用固体药学载体。可选地，片剂包衣可使用标准的水制剂或非水制剂技术。
含有本发明化合物或药物组合物的片剂可通过压缩或模塑成型，可选地，可以与一种或多种辅助组分或辅药一起制成片剂。活性组分以自由流动的形式如粉末或颗粒，与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合，在适当的机器中，通过压缩可以制得压缩片。用一种惰性液体稀释剂浸湿粉末状的化合物或药物组合物，然后在适当的机器中，通过模塑可以制得模塑片。较优地，每个片剂含有大约0.05mg到5g的活性组分，每个扁囊剂或胶囊剂含有大约0.05mg到5g的活性组分。例如，拟用于人类口服给药的配方包含约0.5mg到约5g的活性组分，与合适且方便计量的辅助材料复合，该辅助材料约占药物组合物总量的5％至95％。单位剂型一般包含约1mg到约2g的活性组分，典型的是25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1000mg。
本发明提供的适用于胃肠外给药的药物组合物可将活性组分加入水中制备成水溶液或悬浮液。可以包含适当的表面活性剂如羟丙基纤维素。在甘油、液态聚乙二醇，及其在油中的混合物，也可以制得分散体系。进一步地，防腐剂也可以包含在本发明的药物组合物中用于防止有害的微生物生长。
本发明提供适用于注射的药物组合物，包括无菌水溶液或分散体系。进一步地，上述药物组合物可以制备成无菌粉末形式以用于即时配制无菌注射液或分散液。无论如何，最终的注射形式必须是无菌的，且为了易于注射，必须是易于流动的。此外，所述药物组合物在制备和储存过程中必须稳定。因此，优选地，所述药物组合物要在抗微生物如细菌和真菌污染的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)、植物油及其适当的混合物。
本发明提供的药物组合物可以是适于局部用药的形式，例如，气溶胶、乳剂、软膏、洗液、撒粉或其他类似的剂型。进一步地，本发明提供的药物组合物可以采用适于经皮给药设备使用的形式。利用本发明式(I)所示化合物，或其药学上可接受的盐，通过常规的加工方法，可以制备这些制剂。作为一个例子，乳剂或软膏通过加入约5wt％到10wt％的亲水性材料和水，制得具有预期一致性的乳剂或软膏。
本发明提供的药物组合物，可以以固体为载体，适用于直肠给药的形式。单位剂量的栓剂是最典型的剂型。适当的辅料包括本领域常用的可可脂和其他材料。栓剂可以方便地制备，首先药物组合物与软化或熔化的辅料混合，然后冷却和模具成型而制得。
除了上述提到的辅料组分外，上述制剂配方还可以包括，适当的，一种或多种附加的辅料组分，如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂和防腐剂(包括抗氧化剂)等。进一步地，其他的辅药还可以包括调节药物与血液等渗压的促渗剂。包含式(I)所示化合物，或其药学上可接受的盐的药物组合物，可以制备成粉剂或浓缩液的形式。
一般情况下，治疗上述所示的状况或不适，药物的剂量水平约为每天0.01mg/kg体重到150mg/kg体重，或者每个病人每天0.5mg到7g。例如，炎症、癌症、牛皮癣、过敏/哮喘、免疫系统的疾病和不适、中枢神经系统(CNS)的疾病和不适，有效治疗的药物剂量水平为每天0.01mg/kg体重到50mg/kg体重，或者每个病人每天0.5mg到3.5g。
但是，可以理解，可能需要比上述那些更低或更高的剂量。任何特定病人的具体剂量水平和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、综合健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物联用的情况和接受治疗的特定疾病的严重程度。
具体实施方式
应当理解，以上一般描述和以下详细描述仅是示例性和解释性的，并不旨在限制所要求保护的任何主题。除非另有明确说明，本发明所有的部分和百分数均以重量计算，所有的温度均为摄氏度。本文所述的化合物可以从市售获得或可通过以下使用市售的原料和试剂的常规方法合成。实施例中使用了下列缩略语：
ATP：三磷酸腺苷；
Boc2O：二碳酸二叔丁酯；
con-H2SO4：浓硫酸；
Crk：CT10(鸡肿瘤逆转录病毒10)；
DCM：二氯甲烷；
DEA：二乙胺；
DEAD：偶氮二羧酸二乙酯；
DIEA：N,N-二异丙基乙胺；
DMEM：杜尔贝科改良伊格尔培养基；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
DMA：N,N-二甲基乙酰胺；
DMAP：4-N,N-二甲氨基吡啶；
DMSO：二甲基亚砜；
DTT：二硫苏糖醇；
EA：乙酸乙酯；
EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺；
EDTA：乙二胺四乙酸；
EtOH：乙醇；
FBS：胎牛血清；
GSR：谷胱甘肽巯基转移酶；
HATU：O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
Hex：正已烷；
h or hr：小时；
IPA：异丙醇
KOAc：醋酸钾；
KTB：叔丁醇钾；
MeOH：甲醇；
min：分钟；
MsCl：甲基磺酰氯；
MTS：5-[3-(羧基甲氧基)苯基]-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓内盐；NaBH4：硼氢化钠；
NaBH(OAc)3：三乙酰氧基硼氢化钠；
P(Cy)3：三环己基膦；
Pd2(dba)3：三二亚苄基丙酮二钯；
Pd(dppf)Cl2：1,1'-双(二苯膦基)二茂铁合氯化钯；
Pd(OAc)2：乙酸钯；
PE：石油醚；
PMS：吩嗪硫酸甲酯；
POCl3：三氯氧磷；
P/S：青霉素/链霉素溶液；
RT或rt：室温；
SDS：十二烷基硫酸钠；
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳；
TBAB：四丁基溴化铵；
TEA：三乙胺；
THF：四氢呋喃；
TLC：薄层色谱法；
Tol：甲苯。
制备1
5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-胺(中间体M1)
依次加入1-甲基哌嗪(1.180g)和K2CO3(2.720g)至含5-溴-2-硝基吡啶(2.010g)的DMSO(20mL)溶液中。将反应液在82℃油浴中搅拌15小时。加入水(50mL)，用DCM(20mL×8)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到1.940g 1-甲基-4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪。
在室温下，氢气中，加入Pd/C(0.194g)至含有1-甲基-4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪(1.940g)的THF(25mL)溶液中，室温下搅拌2小时。过滤收集滤液，然后浓缩，得到1.480g 5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-胺。MS(ES+):m/z＝193.1(M+H)+。
基本上按照5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-胺(本发明中指的是中间体M1)所述，使用相应的哌嗪衍生物制备以下中间体(如表1所示)。
表1
制备4
6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-胺(中间体M4)
在0℃冰浴中，将NaBH4(1.220g)加入到含5-溴吡啶甲醛(2.010g)的甲醇(30mL)溶液中，加入NaBH4后，除去水浴，自然温热到室温。室温下搅拌2小时后，反应混合物用0℃水(50mL)淬灭。用EA(50mL×2)萃取，将合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得到1.940g(5-溴吡啶-2-基)甲醇。
将含(5-溴吡啶-2-基)甲醇(1.940g)的THF(20mL)溶液放置在冰浴中冷却至0℃，然后滴加甲基磺酰氯(1.780g)至溶液中。加完甲基磺酰氯后，除去冰浴，自然温热至室温。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物用水(50mL)淬灭。用EA(50mL×2)萃取，将合并的有机相用饱和NaCl溶液(50mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得到2.75g粗产物(5-溴吡啶-2-基)甲基甲磺酸酯。
依次加入K2CO3(2.870g)和1-甲基哌嗪(1.560g)至含(5-溴吡啶-2-基)甲基甲磺酸酯(2.750g)的乙腈(30mL)溶液中，在油浴中加热至50℃，反应2小时。然后冷却至室温，加水，用EA(50mL×3)萃取，合并的有机相用饱和NaCl溶液(50mL)洗涤，无水Na2SO4干燥,浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到2.010g 1-((5-溴吡啶-2-基)甲基)-4-甲基哌嗪。
-78℃，在氨中，加甲醇(20mL)至100mL密封管中，然后依次加入1-((5-溴吡啶-2-基)甲基)-4-甲基哌嗪(1.000g)和氧化亚铜(0.532g)至溶液体积升至30mL。取出外浴，自然温热至室温，然后加热到70℃反应12小时。过滤收集滤液，然后浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝15/1)纯化，得到0.730g的6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-胺。MS(ES+):m/z＝207.2(M+H)+。
基本上按照6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-胺(本发明中指的是中间体M4)所述方法，使用相应的哌嗪衍生物制备以下中间体(如表2所示)。
表2
制备7
5-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-胺(中间体M7)
在0℃冰浴下，加入NaBH4(1.640g)至含2-溴-5-甲酰基吡啶(2.010g)的THF(20mL)溶液中，加入NaBH4后，除去冰浴，自然温热至室温。室温下搅拌2小时后，反应混合物用水(50mL)淬灭，用EA(50mL×2)萃取，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝5/1)纯化，得到1.900g(6-溴吡啶-3-基)甲醇。
将含(6-溴吡啶-3-基)甲醇(1.000g)的DCM(10mL)溶液在冰浴中冷却至0℃，逐滴加到亚硫酰氯(1.260g)中，加完后除去冰浴，搅拌2小时使溶液自然温热至室温，直接浓缩，得到1.050g 2-溴-5-(氯甲基)吡啶。
加入N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.586g)和K2CO3(1.160g)至含2-溴-5-(氯甲基)吡啶(0.853g)的乙腈溶液(10mL)。加水(30mL)，用EA(50mL×3)萃取，合并有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到0.730g 1-((6-溴吡啶-3-基)甲基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺。
在-78℃下，在氨气中加入甲醇(20mL)至100mL密封管中，然后依次加入1-((6-溴吡啶-3-基)甲基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.350g)和氧化亚铜(0.168g)至溶液体积升至30mL。除去外浴，自然温热至室温，然后加热至70℃，反应12小时。过滤收集滤液，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到0.260g 5-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-胺。MS(ES+):m/z＝235.2(M+H)+。
基本上按照5-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-胺(本发明中指的是中间体M7)所述方法，使用相应的哌啶衍生物制备以下中间体(如表3所示)。
表3
制备11
5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶-2-胺盐酸盐(中间体M11)
加入氨水(25％)(1.200g)至含2-氯嘧啶-5-甲醛(0.500g)的THF(50mL)中,搅拌12小时。加入水(80mL)，用DCM(80mL×8)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩，得到0.540g粗品2-氨基嘧啶-5-甲醛。
依次加入Boc2O(2.817g)、三乙胺(1.310g)和DMAP(0.054g)至含2-氨基嘧啶-5-甲醛(0.540g)的THF(30mL)溶液中，搅拌2小时。加水，用EA(50mL×2)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥,浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝5/1)纯化，得到0.514g化合物MH2-12。
依次加入1-甲基哌嗪(0.109g)和无水硫酸镁(0.216g)至含MH2-12(0.290g)的DCM(10mL)溶液中，搅拌2小时，加入三乙酰氧基硼氢化钠后在室温下反应3小时，将反应混合物用水(20mL)淬灭。用DCM(20mL×3)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩，并经柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到0.350g化合物MH2-13。
室温下，将含MH2-13(0.350g)的DCM溶液置于氯化氢气体中反应2小时。将反应混合物浓缩，得到0.210g 5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶-2-胺盐酸盐。MS(ES+):m/z＝244.1(M+H)+。
基本上按照5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶-2-胺盐酸盐(本发明中指的是中间体M11)所述方法，使用哌啶衍生物代替哌嗪衍生物制备以下中间体(如表4所示)。
表4
制备13
(2-氨基嘧啶-5-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(中间体M13)
加入硫酸氢钾(1.810g)至含MH2-12(0.315g)的丙酮(10mL)和水(3mL)混合溶液中，并在室温下搅拌2小时。加水(20mL)，用DCM(25mL×3)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥,浓缩，得到0.290g化合物MH8-01。
依次加入HATU(0.488g)和DIEA(0.221g)至含MH8-01(0.290g)的DCM(10mL)溶液中，室温下搅拌1h，然后加入1-甲基哌嗪(0.105g)反应2小时。加水(20mL)，用DCM(20mL×3)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝50/1)纯化，得到0.250g化合物MH8-02。
室温下，将含MH8-02(0.150g)的DCM(10mL)溶液置于氯化氢气体中反应2小时，用Na2CO3调节pH至8～9，所得水溶液用混合溶剂(DCM/MeOH＝10/1)(20mL×5)萃取。合并的有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩，得到0.060g(2-氨基嘧啶-5-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮。MS(ES+):m/z＝223.1(M+H)+。
基本上按照(2-氨基嘧啶-5-基)-(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(本发明中指的是中间体M13)所述方法，使用吡啶衍生物代替嘧啶衍生物制备以下中间体(如表5所示)。
表5
制备15
N5-(2-(二乙氨基)乙基)-N5-甲基吡啶-2,5-二胺(中间体M15)
依次次加入N,N-二乙基-N'-甲基乙二胺(0.305g)和K2CO3(0.679g)于含2-硝基-5-溴吡啶(0.500g)的乙腈(10mL)溶液中。将反应液置于82℃的油浴中搅拌15小时。加水(50mL)，用DCM(80mL×3)萃取，合并的有机相用无水Na2SO4干燥,浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到0.400g 1-甲基-4-(6-硝基吡啶-3-基)-哌嗪。
加入Pd/C(0.040g)至含1-甲基-4-(6-硝基吡啶-3-基)-哌嗪的THF(15mL)溶液中，在常温下，氢气中搅拌2小时。过滤收集滤液，浓缩，得到0.350g N5-(2-(二乙氨基)乙基)-N5-甲基吡啶-2,5-二胺。MS(ES+):m/z＝223.2(M+H)+。
基本上按照N5-(2-(二乙氨基)乙基)-N5-甲基吡啶-2,5-二胺(本发明中指的是中间体M15)所述方法，使用N1,N1-二乙基-N2,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺代替N,N-二乙基-N'-甲基乙二胺制备以下中间体(如表6所示)。
表6
制备17
6-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)哒嗪-3-胺(中间体M17)
加入三氯异氰脲酸(0.189g)至含3-氯-6-甲基哒嗪(0.208g)的氯仿溶液(10mL)中,油浴加热至60℃，持续12小时。冷却至室温，过滤收集滤液，浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝10/1)纯化，得到0.201g 3-氯-6-(氯甲基)哒嗪。
将K2CO3(0.578g)、KI(0.070g)和N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.322g)依次加入到含3-氯-6-(氯甲基)哒嗪(0.340g)的DMF溶液(15mL)中，油浴加热到50℃并持续1小时。冷却至室温，加入DCM(50mL)，用饱和NaCl溶液洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到0.370g 1-((6-氯哒嗪-3-基)甲基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺。
在-78℃下，氨气中将甲醇(20mL)加入到100mL密封管中，然后依次加入1-((6-氯哒嗪-3-基)甲基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.370g)和氧化亚铜(0.532g)至溶液体积升至30mL。除去外浴，自然温热至室温，然后加热至70℃，反应12小时。过滤收集滤液，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝15/1)纯化，得到0.230g 6-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)哒嗪-3-胺。MS(ES+):m/z＝236.2(M+H)+。
基本上按照6-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)哒嗪-3-胺(本发明中指的是中间体M17)所述方法，使用哌嗪衍生物代替哌啶衍生物制备以下中间体(如表7所示)。
表7
实施例1化合物1的合成
1.化合物1-01
将2-甲基环戊酮(5.200g)、盐酸羟胺(9.200g)和三乙胺(16.080g)的无水乙醇(70mL)溶液混合物放置在85℃油浴中搅拌过夜。然后，将反应液浓缩，残余物用EA冲洗。过滤，收集滤液，浓缩，得到5.820g粗品化合物1-01。
2.化合物1-02
将粗化合物1-01(5.820g)溶于硫酸溶液(浓H2SO4:H2O＝20mL:5mL)中，所得混合物在90℃油浴下搅拌90min，加水(10mL)，用Na2CO3调节pH至8～9，得到的水溶液用DCM(20mL×5)萃取，合并的有机相用Na2SO4干燥，减压浓缩，得到4.110g粗品化合物1-02。
3.化合物1-03
将粗品化合物1-02(4.110g)和4-溴-2,6-二氟苯胺(3.780g)溶于甲苯(40mL)中，加入POCl3(4.180g)，油浴加热，温度到达110℃时加入TEA(2.770g)，保持油浴110℃反应20min。体系蒸发掉一部分甲苯，用Na2CO3调节pH至8～9，用EA萃取，合并的有机相用饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到6.550g粗品化合物1-03。
4.化合物1-04
将粗品化合物1-03(6.100g)和叔丁醇钾(4.520g)溶于DMF(60mL)中，在油浴100℃下搅拌20min，用300mL的EA萃取，将合并的有机相用饱和NaCl冲洗(120mL×3)，并用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝1/5)纯化，得到0.705g化合物1-04-A和1.500g粗化合物1-04-C。
5.化合物1-05
将粗品化合物1-04-C(0.957g)、双戊酰二硼(1.290g)、三环己基膦(0.047g)和乙酸钯(0.038g)加入到DMSO(20mL)中，氮气保护下，在90℃的油浴中反应1h。用EA(60mL)萃取，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤(30mL×3)，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到2.290g粗品化合物1-05。
6.化合物1-06
将粗品化合物1-05(2.290g)、2,4-二氯嘧啶(0.755g)、K2CO3(1.400g)和Pd(dppf)Cl2·DCM(0.138g)置于1,4-二氧六环(30mL)中，加水(3mL)，在氮气下，60℃的油浴中反应2小时。反应混合物用EA(30mL×2)萃取，合并有机相，用饱和NaCl溶液(30mL×1)洗涤，无水Na2SO4干燥,浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝1/1)纯化，得到0.927g化合物1-06。
7.化合物1
将化合物1-06(0.400g)、中间体M1(0.291g)、Cs2CO3(0.822g)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(0.017g)和Pd2(dba)3(0.027g)加入到1,4-二氧六环(12mL)中，在氮气保护下，110℃的油浴中反应1小时后在110℃下继续微波反应0.5h。反应混合物加水(10mL)，用DCM(20mL×3)萃取，合并的有机相用饱和NaCl溶液(30mL×1)洗涤，并用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝20/1)纯化，所得固体用甲基叔丁基醚(10mL)、正己烷(10mL)洗涤，得到0.290g化合物1。MS(ES+):m/z＝473.2(M+H)+。
H-NMR(CDCl3):δ8.498-8.511(d,1H,CH),8.373-8.396(d,1H,CH),8.167(s,1H,CH),8.040-8.047(d,1H,CH),7.963(s,1H,CH),7.631-7.660(d,1H,CH),7.346-7.660(dd,1H,CH),7.177-7.190(d,1H,CH),4.687-4.719(m,1H,CH),3.190-3.10(m,4H,CH2),2.651-2.675(m,4H,CH2),2.999-3.024(m,1H,CH2),2.403(s,3H,CH3),2.337-2.356(m,1H,CH2),2.267-2.357(m,1H,CH2),2.219-2.248(m,1H,CH2),2.010-2.056(m,2H,CH2)1.602-1.618(d,3H,CH3)。
实施例1-1化合物1-06的手性分离
分离异构体，例如分离对映异构体的技术是在本领域技术范围内的，描述于Eliel,E.L.；Wilen,S.H.；Mander,L.N.《有机化合物的立体化学》,Wiley Interscience,NY,1994。例如，通过使用手性柱的高效液相色谱法，化合物1、2或15可被分离成高对映异构体过量(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。在一些实施方案中，将实施例1的粗品化合物1-06直接在手性柱上纯化以得到对映异构体富集的化合物。
手性HPLC条件：
实施例1-2化合物1a和化合物1b的制备
在上述条件下，用手性柱纯化粗品化合物1-06，得到化合物1-06-A和化合物1-06-B。
基本上，按照实施例1的步骤7所述方法，使用化合物1-06-A和化合物1-06-B，分别制备出化合物1a和化合物1b。
进一步地，在Rudolf旋光仪上测定如下所示化合物的旋光度，每个化合物重复测定3次。条件：
结果：
实施例2化合物2的合成
1.化合物1-01
将2-甲基环戊酮(5.200g)、盐酸羟胺(9.200g)和三乙胺(16.080g)的无水乙醇溶液混合物(70mL)放置在85℃的油浴中搅拌过夜。然后，将反应液浓缩，残余物用EA冲洗。过滤，收集滤液，浓缩，得到5.820g粗品化合物1-01。
2.化合物1-02
将粗品化合物1-01(5.820g)溶于硫酸溶液(浓H2SO4:H2O＝20mL:5mL)中，90℃的油浴下搅拌90min，加水(10mL)，用Na2CO3调节pH至8～9，用DCM(20mL×5)萃取，合并的有机相用Na2SO4干燥，减压浓缩，得到4.110g粗品化合物1-02。
3.化合物1-03
将粗品化合物1-02(4.110g)和4-溴-2,6-二氟苯胺(3.780g)溶于甲苯(40mL)中，加入POCl3(4.180g)，油浴加热，当温度达到110℃时加入TEA(2.77g)，得到的混合物在110℃下反应20min。体系蒸发掉一部分甲苯，用Na2CO3调节pH至8～9，用EA萃取，合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到6.550g粗品化合物1-03。
4.化合物1-04
将粗品化合物1-03(6.100g)和叔丁醇钾(4.520g)溶于DMF(60mL)中，在100℃的油浴下搅拌20min，然后用300mL的EA萃取，将合并的有机相用饱和NaCl溶液(120mL×3)洗涤，并用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝1/5)纯化，得到0.705g化合物1-04-A和1.500g粗品化合物1-04-C。
5.化合物1-05
将粗品化合物1-04-C(0.200g)、双戊酰二硼(0.270g)、三环己基膦(0.039g)和乙酸钯(0.031g)加入到DMSO(5mL)中，在氮气保护下，90℃的油浴中反应1h。用EA(50mL)萃取，合并的有机相用饱和NaCl溶液(20mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到0.398g粗品化合物1-05。
6.化合物2-01
将粗品化合物1-05(0.398g)、2,4-二氯嘧啶(0.304g)、K2CO3(0.502g)和Pd(dppf)Cl2·DCM(0.050g)加入至1,4-二氧六环(10mL)溶液中，加水(1mL)，在氮气保护下，60℃的油浴中反应80min。向反应混合物中加水(10mL)，用EA(20mL×2)萃取，合并的有机相用饱和NaCl溶液(20mL×1)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，通过柱色谱(PE/EA＝1/1)纯化，得到0.165g化合物2-01。
7.化合物2
将化合物2-01(0.030g)、中间体M5(0.025g)、Cs2CO3(0.067g)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(0.005g)和Pd2(dba)3(0.005g)加入到1,4-二氧六环(2mL)中，在氮气保护下，110℃的油浴中搅拌3.5h。将所得混合物中加入到20mL的混合溶剂(DCM/MeOH)中，过滤，浓缩，通过柱色谱(DCM/MeOH＝8/1)纯化，所得固体用1,4-二氧六环(5mL)洗涤，得到0.024g化合物2。MS(ES+):m/z＝519.3(M+H)+。
H-NMR(CDCl3):δ8.587(s,1H,NH),8.448-8.457(d,1H,CH),8.383-8.405(d,1H,CH),8.280-8.286(d,1H,CH),8.009-8.013(d,1H,CH),7.804-7.837(dd,1H,CH),7.6867.714(dd,1H,CH),4.681-4.728(m,1H,CH),3.532(s,2H,CH2),3.189-3.256(m,1H,CH2),3.008-3.091(m,1H,CH2),2.654(s,8H,CH2),2.571-2.608(m,2H,CH2),2.226-2.299(m,1H,CH2),2.111-2.15(m,1H,CH2),2.012-2.053(m,2H,CH2),1.596-1.612(d,3H,CH3),1.174-1.210(t,3H,CH3)。
实施例2-1化合物2-01的手性分离
在本实施方案中，直接在如下条件的手性柱上纯化实施例2中的粗品化合物2-01，得到化合物2-01-A和化合物2-01-B。
手性HPLC条件：
实施例2-2化合物2a和化合物2b的制备
在上述条件下，通过手性柱纯化粗品化合物2-01，得到化合物2-01-A和化合物2-01-B。
基本按照实施例2的步骤7所述方法，使用化合物2-01-A和化合物2-01-B，分别制备化合物2a和化合物2b。
进一步地，在Rudolf旋光仪上测定如下所示的化合物的旋光度，每个化合物重复测定3次。
条件：
结果：
基本按照实施例2所述方法，使用相应的中间体制备以下实施例(如表8所示)。其中每种化合物的两种对映异构体在手性柱上分离，然后按实施例2-2所述方法测定其旋光度。
表8
实施例15化合物15b的合成
1.化合物15-01
将5-甲基吗啉-3-酮的(-)对映异构体(0.200g)和4-溴-2,6-二氟苯胺(0.210g)溶于甲苯(20mL)中，加入POCl3(0.510g)，在油浴中加热，当温度达到110℃时加入TEA(0.210g)，所得混合物在110℃下反应40min。体系蒸发掉一部分甲苯，加入20mL水后用碳酸钠调节pH为8～9。用EA(20mL×2)萃取，用饱和NaCl溶液(20mL×1)洗涤合并的有机相，用无水Na2SO4干燥，浓缩得到0.280g化合物15-01。
2.化合物15-02
将粗品化合物15-01(0.275g)溶于DMF(5mL)中，加入叔丁醇钾(0.482g)，在70℃的油浴中搅拌反应30min。反应混合物用EA(20mL×3)萃取，用饱和NaCl溶液(30mL×4)洗涤合并的有机相，用无水Na2SO4干燥，浓缩，通过色谱柱(PE/EA＝5/1)纯化，得到0.260g化合物15-02。
3.化合物15-03
将化合物15-02(0.260g)、双戊酰二硼(0.320g)、三环己基膦(0.050g)、醋酸钯(0.040g)加入到DMSO(6mL)中，在氮气保护下，90℃的油浴中搅拌反应50min。所得混合物用EA(20mL×2)萃取，用饱和NaCl溶液(10mL×3)洗涤合并的有机相，用无水Na2SO4干燥，浓缩得到0.258g化合物15-03。
4.化合物15-04
将粗品化合物15-03(0.120g)、2,4-二氯-5-氟嘧啶(0.060g)、K2CO3(0.099g)和Pd(dppf)Cl2·DCM(0.012g)加入到1,4-二氧六环(10mL)和水(1mL)中，氮气保护下，在60℃的油浴中搅拌反应1h。所得混合物用EA(20ml×2)萃取，合并的有机相用饱和NaCl溶液(20ml×1)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，通过制备HPLC(DCM/MeOH＝30/1)纯化，得到0.052g化合物15-04的(-)对映异构体。
5.化合物15b
将化合物15-04的(-)对映异构体(0.020g)、中间体M1(0.017g)、Cs2CO3(0.056g)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(0.005g)和Pd2(dba)3(0.005g)加入到1,4-二氧六环(2mL)中，氮气流下，在110℃下，微波反应1.5小时。所得混合物加入20mL混合溶剂(DCM/MeOH＝10/1)中，过滤，收集滤液，浓缩，通过制备HPLC(DCM/MeOH＝20/1)纯化，所得固体用正己烷(10mL)洗涤，得到0.014g化合物15b。MS(ES+):m/z＝493.2(M+H)+。
H-NMR(CDCl3):δ8.409-8.418(d,1H,CH),8.211-8.288(m,2H,CH),8.070-8.077(d,1H,CH),8.019-8.023(d,1H,CH),7.833-7.868(m,1H,CH),5.118-5.158(d,1H,CH2),4.912-5.002(d,1H,CH2),4.522-4.584(m,1H,CH),4.111-4.168(m,1H,CH2),4.039-4.075(m,1H,CH2),3.249-3.275(m,4H,CH2),2.724-2.748(m,4H,CH2),2.462(s,3H,CH3),1.662-1.678(d,3H,CH3)。
实施例15-1化合物15a和化合物15的制备
化合物15a和化合物15b是对映异构体，基本上，使用5-甲基吗啉-3-酮的(+)对映异构体作为起始原料，基本按照实施例15所述方法制备化合物15a。
在另一个实施方案中，使用粗品5-甲基吗啉-3-酮作为起始原料，最终得到包含化合物15a和化合物15b的粗品化合物15。
进一步地，在Rudolf旋光仪上测定如下所示化合物的旋光度，每个化合物重复测定3次。.条件：
结果：
基本上按实施例15所述方法，使用相应的中间体和5-甲基吗啉-3-酮的(+)和/或(-)对映异构体作为起始原料制备以下实施例(见表9)，按实施例15-1所述方法测定其旋光度。
表9
对比实施例
基本上按照实施例1，2或15所述方法，使用相应的中间体制备以下对比实施例。例如，按照实施例2的制备方法，使用替代制备如下的对比实施例8,9和10(如表10所示)。又例如，按照实施例1的方法，使用替代制备如下的对比实施例7。
表10
在上表中，对比实施例3b和4b基本上按照实施例15所述方法合成，然后按照实施例15-1所述方法测定其旋光度。对比实施例3b和4b的旋光度都为负值。
药理实验
以下测定的结果证明了本文示例的化合物可用作特异性CDK4/6抑制剂和抗癌剂。在本文中，“IC50”是指产生50％的最大抑制反应时药物的浓度。
为了便于说明，以下通用结构如下所示。出乎意料的是，我们发现“R”对生物活性，选择性和安全性有重要的影响。
实验1通过细胞增殖实验比较不同的取代基
通过MTS细胞活力测定法测定试验化合物对体外增殖的影响。
细胞的培养
在培养物中扩增人结肠直肠癌细胞(colo-205)(colo-205在含有12％FBS，1％P/S和1％L-谷氨酰胺的DMEM培养基中生长)。
MTS细胞活力测定：
1.密度为4×103个细胞/孔的96孔板的种子细胞生长24小时；
2.向细胞中加入不同浓度的实验化合物；
3.曝露培养7天；
4.按照细胞增殖测定试剂盒(Promega)中的说明准备试剂；
5.更换到最终体积为100μl/孔的无血清培养基。准备一套具有培养基的孔仅用于消除背景；
6.向每个孔中加入含有PMS的20μl MTS溶液(MTS的最终浓度为0.33mg/mL)；
7.在潮湿的5％二氧化碳气氛中，37℃下培养1～4小时；
8.使用VICTORTMX5读板仪(PerkinElmer)记录490nm处的吸光度.
所有实验点在三个孔中建立，所有实验重复至少三次。通过使用软件(Graphpadprism 6)从剂量-响应曲线计算IC50值，结果示于表11中。
表11
如表11所示，上述实施例化合物在该模型中显示抗肿瘤活性，因此证明本发明的示例化合物对Rb+肿瘤具有更强的体内活性。与已知化合物LY2835219(Abemaciclib)相比，本发明化合物，如实施例1或2的化合物对Rb+肿瘤具有更强的抑制作用。与对比实施例1(以下简称Com.EX.1；R为螺环)和对比实施例2(以下简称Com.EX.2；R为H)相比，本发明的化合物，如实施例1或2的化合物(R为甲基)具有对Rb+肿瘤更有效的抑制作用。
上述示例化合物还表明，当R不是H或螺环而是甲基时，在该模型中具有更强的生物活性。从上述结果可以看出，取代基的类型对抑制Rb+肿瘤有显著影响。
实验2通过安全性试验比较不同的取代基
根据体重变化以及是否有死亡发生，测定上述所选制备化合物的安全性，步骤如下所示。测试化合物在合适设备中制备，并通过给BALB/c鼠(22-23g)灌胃给药。体重和死亡率作为毒性的一般测量值。在治疗过程中，将治疗组与对照组比较，每周计算两次体重减轻量(体重变化百分比)。在这些模型中，当剂量为200mg/kg(qd)时，化合物2和16显示几乎没有体重下降。但在相同剂量下，对比实施例，例如，对比实施例3b和4b能够引起更多的体重下降，甚至在治疗2周后，每组(6只小鼠)中死亡率高达4和5只。
结果见表12。“*”表示“体重降低少于5％”；“**”表示“体重降低大于5％并且小于10％”；“***”表示“体重降低大于10％而且小于30％”；“****”表示“体重降低大于30％”。“+”表示“死亡发生”；“-”表示“无死亡发生”。
表12
样品 体重 观察
LY2835219 * -
实施例2b * -
实施例16b * -
对比实施例3b *** +
对比实施例4b *** +
出乎意料地，我们发现对比实施例3b(R是异丙基)或对比实施例4b(R是乙基)的毒副作用更大。然而，本发明的实施例化合物，如化合物2b或者16b(R是甲基)的安全性更好，从而证明取代基的类型对安全性也有显著影响。
实验3通过CDK激酶测定法分析取代基数量的影响
为了证明化合物对CDK激酶(CDK2/CycA2，CDK4/CycD3，CDK6/cycD3)表现出亲和力，进行CDK激酶的测定。
反应缓冲液制备如下：CDK2、6的激酶碱缓冲液(50mM HEPES，pH7.5；0.0015％Brij-35；10mM MgCl2；2mM DTT)；CDK4的激酶碱基缓冲液(20mM HEPES，pH7.5；0.01％Triton X-100；10mM MgCl2；2mM DTT)；停止缓冲液(100mM HEPES，pH7.5；0.015％Brij-35；0.2％涂层试剂#3；50mM EDTA)
酶反应方案：
1)采用100％DMSO将化合物稀释到反应最终所需的最高浓度的50倍。将100μL该化合物的稀释液转移至96孔板的孔中。然后，在下一个孔中，按30μL的上述稀释液用60μL的100％DMSO稀释的比例依次稀释化合物共10个浓度。在相同的96孔板上，将100μL 100％DMSO溶液加入到两个空孔中，作为无化合物对照和无酶对照。这张板记为源板。
2)分别将10μL各浓度化合物从源板中转移到包含90μL激酶缓冲液的新的96孔板中以制备中间板。
3)从96孔板的中间板中对应孔转移5μL化合物溶液到对应的384孔板中。
4)将10μL 2.5×酶溶液加入到384孔实验板的每个孔中。
5)室温孵育10分钟。
6)加入10μL2.5×底物溶液，该底物溶液通过在激酶基缓冲液中加入荧光素标记肽和ATP制备。酶和底物的反应浓度如下表所示(表13)：
表13
酶 酶(nM) ATP(μM) 肽 肽浓度(μM)
CDK2 10 30 P18 3
CDK4 10 280 P8 3
CDK6 15 800 P8 3
7)在28℃孵育特定的时间
8)加入25μL终止缓冲液终止反应。
9)收集Caliper上的数据。然后将转换值转换为抑制值。
抑制率＝(最大值-转换值)/(最大值-最小值)*100
“最大值”为DMSO对照值；“最小值”为无激酶对照孔值。
10)使用XLFit优化版本4.3.1中的百分比抑制曲线拟合来获得IC50值。方程是：
Y＝最小抑制率+(最大抑制率-最小抑制率)/(1+(IC50/X)^斜率)。其中，Y表示抑制百分数(％)；X表示待测化合物的浓度。
结果用IC50值表示，如表14所示。
表14
如上表所示，我们可以看到甲基的数量对选择性有着非常重要的影响。出乎意料地，如表14所示，本发明的实施例化合物在上述CDK2激酶抑制测定中显示IC50>0.3μΜ，而在CDK4/6激酶抑制测定中显示IC50≤0.04μΜ。这表明本发明的实施例化合物是CDK4/6激酶活性更具选择性的抑制剂。因此，与已知化合物LY2835219和对比实施例，例如对比实施例5或对比实施例6(R为两个甲基)相比，所示例化合物(R为一个甲基)是更有特异性的CDK4/6抑制剂。
实验4取代基位置的作用
根据本发明的生物学测定步骤，测定如上所述制备的所选化合物。结果如下表所示。
表15
进一步地，头对头地比较了实施例2及对比实施例8、9或10的活性，结果如下表16所示。“++++”代表“IC50值＜0.2μΜ”；“+++”代表“IC50值为0.2μΜ～1.0μΜ”；“++”代表“IC50值为1.0μΜ～2.0μΜ”；“+”代表“IC50值＞2.0μΜ”.
表16
如上表15和16所示，我们可以看到取代基位置也对生物活性起重要作用。取代基位置变化产生的对生物活性的影响是非常难以预料到的。
如上述结果所示，我们可以知道该6元杂环的“R”对生物活性，选择性和安全性具有关键影响。出乎意料的是，当在所述6元杂环中有且仅有一个甲基时，至少可获得如下效果：
①更好的生物活性；
②选择性好；和
③副作用低。
实验5旋光性的影响
根据测试3(CDK激酶测定)描述的生物学测定步骤，测定如上所述制备的所选化合物。结果如下表所示。
表16
如上表所示，我们可以看到在抑制CDK4/6活性方面，化合物1b、2b、15b、16b分别比化合物1a、2a、15a、16a更有效，由此可见，本发明化合物的(-)对映异构体比(+)对映异构体更具优势。
在一些实例中，本申请公开的化合物是以某种高对映体过量存在的形式给药，例如可以是旋光度为负值的异构体(-)或旋光度为正值的异构体(+)。在一实例中，具有负旋光度，例如-35.394°(c＝3.0mg/mL，乙醇溶液中)的化合物1b的对映异构体比具有+30.325°(c＝3.0mg/mL,EtOH)正旋光度的对映异构体(化合物1a)，在抑制CDK4/6酶上具有更高的活性。另一实例中，具有负旋光度例如-32.036°(c＝4.0mg/mL，DCM)的化合物2b的对映异构体，对CDK4/6酶的活性比具有+38.088(c＝4.0mg/mL，DCM)正旋光度的对映异构体具有更高的活性。在另一实例中，具有负旋光度，例如，-28.929°(c＝4.6mg/mL，DCM/MeOH＝1:1)的化合物15b的对映体比其具有+32.829°(c＝4.6mg/mL，DCM/MeOH＝1:1)正旋光度的对映异构体，在抑制CDK4/6酶上具有更高活性。
因此，在一些实例中，对治疗对象施用具有(-)旋光度的高光学纯度对映异构体的化合物以治疗疾病是有利的。令人意外地，本发明的化合物，包括但不限于化合物1b、2b或者15b，该类旋光度为(-)的对映异构体，对于治疗受试者由CDK4/6介导的疾病是更有效的药物。
实验6在分子水平对CDK激酶其他亚型的抑制活性以及选择性试验
以本发明代表性化合物2b为受试化合物，并与阳性对照药LY2835219(Abemaciclib)比较两者在分子水平对CDK激酶的抑制活性以及选择特异性的高低。
本方法的作用机制如式(II)所示，激酶催化蛋白质底物磷酸化，使反应体系中放射性同位素33P标记的ATP(γ-33P-ATP)上的33P标记到蛋白质底物上，将反应体系点在P81离子交换滤膜上，用0.75％磷酸缓冲液充分洗涤滤膜，则有放射活性的磷酸化底物留在滤膜上，通过记录底物蛋白质放射性标记的强度反映激酶的活性。
用Prism4Software(GraphPad)处理数据，曲线拟合公式为：
Y＝最小抑制率+(最大抑制率-最小抑制率)/(1+10^((LogIC50-X)*斜率))；其中，Y表示抑制百分数(％)；X表示待测化合物浓度的对数。
结果：通过对多种CDK激酶的筛选，发现本发明代表性化合物2，化合物2a和化合物2b抑制CDK1/2/7/9的IC50大于0.4μM，是CDK4/6的几十甚至上千倍。(见表17)。
表17 CDK激酶抑制活性
结论：在分子水平上，本发明代表性化合物2和化合物2b对CDK4/6表现出很强的抑制作用，对CDK1/2/7/9抑制作用极弱，表明化合物2和化合物2b是一个具有极优选择性的CDK4/6激酶抑制剂。化合物2a对CDK4表现出较强的抑制作用，对CDK6的抑制作用稍弱，对CDK1/2/7/9抑制作用极弱，表明化合物2a是个具有极高选择性的CDK4激酶抑制剂，具有良好选择性的CDK6激酶抑制剂。此外，本发明代表性化合物在CDK1/2/9和CDK4/6之间的选择性均明显高于LY2835219(Abemaciclib)。
实验7 JeKo-1异种移植瘤动物模型的肿瘤抑制实验
JeKo-1细胞培养在含20％胎牛血清的RPMI 1640培养液中。收集指数生长期的JeKo-1细胞，PBS重悬至适合浓度用于NOD/SCID小鼠皮下肿瘤接种。70只雌性小鼠右侧皮下接种5×106个JeKo-1细胞，细胞重悬在PBS和matrigel(1:1)中。待肿瘤平均体积134mm3时，根据肿瘤大小随机分组开始给药。其中48只分入实验组内，其余22只为分组剩余小鼠。肿瘤体积计算公式为：长径×短径2/2。实验分为溶剂对照组、测试药代表性化合物2b(10mg/kg)、测试药代表性化合物2b(25mg/kg)、测试药代表性化合物2b(50mg/kg)、测试药代表性化合物2b(100mg/kg)，共6组，每组8只小鼠，均为口服灌胃给药，分组后每天给药一次，连续给药19天。根据相对肿瘤增长抑制率TGI进行疗效评价。
计算公式如下：TGI(％)＝(C-T)/C×100％(C和T分别为溶剂对照组平均肿瘤重量和治疗组平均肿瘤重量)。TGI(％)值越大，说明药效越好；反之亦然。
结果：化合物2b显示出良好的抗肿瘤活性。
表18代表性化合物2b对JeKo-1异种移植瘤模型的抑瘤药效评价
注：
a:p值为治疗组与溶剂对照组肿瘤体积的比较分析。
因此，在一些情况下，向受试者给药具有负旋光对映体的高对映异构体的化合物1、2或15以治疗疾病是有益的。出乎意料的是，本发明化合物的光学纯(-)对映异构体(包括但不限于化合物1b、2b或15b)是治疗受试者中由CDK4/6介导的疾病的更有效的药物。
本发明已经描述了多个实施例。然而，应当理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。其他实施例在权利要求书中。

Claims (41)

1.式(I)的化合物或立体异构体、互变异构体，多晶型物、溶剂化物、其药学上可接受的盐或其药物前体，
其中，
环A为芳基或杂芳基；
Z选自CH2、NH、O或S；
R1分别独立地选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氨基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、杂环基-(CH2)m-、芳基-C1-6烷基-、杂芳基-C1-6烷基-、NR12R13、NR12-C1-6亚烷基-NR12R13、或杂环基-C(O)-，其中C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、杂环基-(CH2)m-、芳基-C1-6烷基、杂芳基-C1-6烷基或杂环基-C(O)-是各自未取代或者被至少一个选自卤素、C1-8烷基、C3-8环烷基、杂环基、NR12R13、(CH2)t-OH的取代基取代；
R2和R3各自独立地选自氢、羟基、氰基、硝基、氨基、卤素、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；其中C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8环烷基、芳基、杂芳基或杂环基是各自未取代或者被至少一个选自卤素、羟基、C1-8烷基、C3-8环烷基或杂环基的取代基取代；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-8烷基、芳基、杂芳基、杂环基或C3-8环烷基；其中C1-8烷基、芳基、杂芳基、杂环基或C3-8环烷基是各自未取代或者被至少一个选自卤素、羟基、C1-8烷基、C3-8环烷基或杂环基的取代基取代；
m为0、1、2、3或4；
n为0、1、2、3或4；
t为0、1、2、3或4。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，Z为CH2。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，Z为O。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物,其特征在于，环A为含一个或两个N杂原子的6元杂芳基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物,其特征在于，环A为吡啶基、嘧啶基、哒嗪基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的化合物,其特征在于，环A为
7.根据权利要求1-6任一项所述的化合物,其特征在于，R1为杂环基-(CH2)m-、或被C1-8烷基、NR12R13、4-6元杂环、C3-6环烷基或-(CH2)t-OH取代的杂环-(CH2)m-。
8.根据权利要求1-7任一项所述的化合物，其特征在于，R1为5-6元杂环基-CH2-，或被C1-3烷基、-N(CH3)2、-N(CH2CH2OH)CH3、-CH2OH、-CH2CH2OH或羟基取代的5-6元杂环基-CH2-。
9.根据权利要求1-8任一项所述的化合物，其特征在于，R1为6元杂环基-CH2-，或者被甲基或乙基取代的6元杂环基-CH2-。
10.根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其特征在于，R1为杂环基或被C1-8烷基、NR12R13、4-6元杂环基、C3-6环烷基或-(CH2)t-OH取代的杂环基。
11.根据权利要求1-6或10任一项所述的化合物，其特征在于，R1为5-6元杂环基，或被C1-3烷基、-N(CH3)2、-N(CH2CH2OH)CH3、-CH2OH,-CH2CH2OH或OH取代的5-6元杂环基。
12.根据权利要求1-6，10或11任一项所述的化合物，其特征在于，R1为6元杂环基，或者被甲基或乙基取代的6元杂环基。
13.根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其特征在于，R1为6元杂环基-C(O)-，或者被C1-3烷基取代的6元杂环基-C(O)-。
14.根据权利要求1-6或13任一项所述的化合物，其特征在于，R1为被甲基取代的6元杂环基-C(O)-。
15.根据权利要求1-14任一项所述的化合物，其特征在于，所述杂环基含一个或两个N或O的杂原子作为环原子。
16.根据权利要求1-14任一项所述的化合物，其特征在于，所述杂环基含一个或两个N杂原子作为环原子。
17.根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其特征在于，R1为NR12-C1-3亚烷基-NR12R13。
18.根据权利要求1-17任一项所述的化合物，其特征在于，R12和R13各自独立为H、-(CH2)t-OH或者C1-3烷基。
19.根据权利要求1-18任一项所述的化合物，其特征在于，R12和R13各自独立地为OH、CH2CH2OH、甲基或乙基。
20.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为
21.根据权利要求1-20中任一项所述的化合物，其特征在于，m为1。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，其特征在于，n为1。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的化合物，其特征在于，t为0、1或2。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的化合物，其特征在于，R2和R3各自独立地为氢、羟基、卤素、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷氧基。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的化合物，其特征在于，R2和R3各自独立地为氢、羟基、氟、氯、甲基、乙基、CF3、OCH3或OCF3。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的化合物，其特征在于，R2和R3都为F。
27.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是：
1)4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
2)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
3)5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
4)5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)嘧啶-2-胺；
5)5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-N-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶-2-基)嘧啶-2-胺；
6)N-(5-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)甲基)嘧啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
7)N-(5-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
8)N-(5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4，5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
9)(2-((5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮；
10)(6-((5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮；
11)N5-(2-(二乙基氨基)乙基)-N2-(5-氟-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-基)-N5-甲基吡啶-2,5-二胺；
12)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-胺；
13)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)-5-甲基嘧啶-2-胺；
14)5-氯-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(6-氟-1-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)嘧啶-2-胺；
15)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
16)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
17)N-(5-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
18)N-(5-((4-(二甲氨基)哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
19)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
20)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
21)N-(5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)哒嗪-3-胺；
22)6-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-N-(5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)哒嗪-3-胺；
23)(1-(6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)甲醇；
24)(1-((6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)甲基)吡咯烷-3-基)甲醇；
25)N-(5-(4-环丙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
26)N-(5-((4-环丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
27)2-((1-((6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)(甲基)氨基)乙醇；
28)1-(6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]恶嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)-3-甲基吡咯烷-3-醇；
29)1-((6-((5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]恶嗪-7-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)甲基)-3-甲基吡咯烷-3-醇；
30)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-((4-(氧杂环丁基-3-基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
31)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-(4-(氧杂环丁基-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
32)N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(9-氟-4-甲基-1,2,3,4-四氢苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡嗪-7-基)嘧啶-2-胺；
33)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-((4'-甲基-[1,1'-双哌嗪]-4-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺；
34)5-氟-4-(9-氟-4-甲基-3,4-二氢-1H-苯并[4,5]咪唑并[2,1-c][1,4]嗪-7-基)-N-(5-((4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺。
28.根据权利要求1-27任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物为化合物的(-)对映异构体。
29.根据权利要求1-27任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物为化合物的(+)对映异构体。
30.一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1-29中任一项所述的化合物和药学上可接受的辅料。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物与所述辅料的比重在约0.001至约10的范围内。
32.权利要求30或31所述的药物组合物或权利要求1-29中任一项所述的化合物在制备药物中的应用。
33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗或预防癌症。
34.根据权利要求33所述的应用，其特征在于，所述的癌症选自结肠癌、直肠癌、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞食管癌、脂肪肉瘤、T细胞淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌、脑癌或肺癌。
35.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，所述药物用作CDK抑制剂。
36.根据权利要求35所述的应用，其特征在于，所述药物用作CDK4和/或CDK6抑制剂。
37.一种治疗CDK介导的疾病的方法，其特征在于，向治疗对象施用治如权利要求1-29中任一项的化合物或权利要求30-31中任一项的药物组合物。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述的CDK为CDK4和/或CDK6。
39.如权利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述CDK介导的疾病为癌症。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述癌症是结肠癌、直肠癌、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞食管癌、脂肪肉瘤、T细胞淋巴瘤黑色素瘤、胰腺癌、脑癌或肺癌。
41.如权利要求37-40任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗对象为人类。
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