CN110172517A - 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒 - Google Patents

用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110172517A
CN110172517A CN201910328705.9A CN201910328705A CN110172517A CN 110172517 A CN110172517 A CN 110172517A CN 201910328705 A CN201910328705 A CN 201910328705A CN 110172517 A CN110172517 A CN 110172517A
Authority
CN
China
Prior art keywords
egln1
amplimer
kit
plasmid
reference substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910328705.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李霞
张云峰
滕祥云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nantong University
Original Assignee
Nantong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nantong University filed Critical Nantong University
Priority to CN201910328705.9A priority Critical patent/CN110172517A/zh
Publication of CN110172517A publication Critical patent/CN110172517A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物及测序引物，所述反向扩增引物的5’端进行生物素标记；所述试剂盒包括正向扩增引物、含有反向扩增引物的PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶及阳性对照品。本发明提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适用突变分析。

Description

用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒
技术领域
本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒。
背景技术
随着西部大开发和旅游的兴起，人类平原与高原地区的交流正日益频繁，越来越多的人由平原地区进入高原。但是，当人类从平原地区进入高原环境时面临着低压低氧、低温及强烈的紫外线等各类挑战，而容易患上急性高原病(AHAD，acute high-altitudedisease)。有很多人群还将会受到头疼、入睡困难、眩晕/头晕、胃肠道症状、虚弱/疲劳的综合征急性轻症高原病(AMS，acute mountain sickness，)的影响，还有的人甚至会患上急性重症高原病，如高原肺水肿(HAPE，high altitude pulmonary edema，)和高原脑水肿(HACE，high altitude cerebraledema)。
Egl Nine Homolog1(EGLN1)，又被称为PHD2，是脯氨酸羟化酶家族的一个成员，其在缺氧诱导因子的羟基化调解中起着重要的作用，被认为是细胞的“氧感受器”。EGLN1的降低可引起缺氧诱导因子-1(HIF-1a)在组织内蓄积，使得HIF-la诱导一系列低氧反应基因的转录对缺氧反应的细胞进行调控，如EPO(促红细胞生成素)、血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合成酶和糖酵解酶类等，从而提高细胞对缺氧环境的耐受。氧分压正常时，细胞内的EGLN家族催化HIF-1a的两个关键氨基酸残基Pro402和Pro564发生羟基化反应，此反应需要O2作为底物，只有这样才能实现EGLN家族的氧分压感知功能。羟基化后的HIF-1a与p VNL蛋白结合，然后经泛素-蛋白酶途径被降解。但是，当氧浓度<6％时，EGLN家族羟基化HIF-1a反应受阻，导致HIF-1a大量聚集，并与细胞内的HIF-1β结合后进入细胞核，调节与缺氧有关的基因的表达而使细胞适应低氧环境，如通过上调血管内皮生长因子(VEGF)来促进血管新生，增加红细胞生成素(EPO)的合成从而促进红细胞生成，增加糖酵解和葡萄糖转运使得ATP生成增多等；同时调节EGLN1和EGLN3，使其起负反馈作用，形成低氧反应调节环路。研究表明，PHD1、PHD2、PHD3都可抑制HIF-la的活性，但PHD2的作用可能更明显。低氧预适应能够通过抑制PHDs的活性而减少HIF-1a的降解来达到其保护作用。进一步研究证明，敲除大鼠PHD2基因有致命的危险，但敲除PHD1和PHD3则没有明显的影响，这表明PHD2是重要的脯氨酸羟化酶。
大量研究证实，EGLN1基因上有两个SNP(rs479200和rs480902)与高原低氧耐受有重大关联，其中rs479200 CC基因型和rs480902TT基因型具有更强的低氧耐受能力。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测EGLN1基因分型的产品。
目前，我们自主开发设计了基于焦磷酸测序技术检测EGLN1基因分型的引物对及试剂盒，填补了国内用于检测国人低氧耐受能力相关基因多态性的试剂盒产品的空白，具有显著的社会意义。
发明内容
为了解决上述方法检测人低氧耐受能力相关EGLN1基因多态性过程中存在检测结果准确性不高、检测周期长、操作繁琐及难以满足临床检验要求的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、特异性高、检测周期短、成本低、定量并有效满足临床检验要求的检测人低氧耐受能力相关EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902的基因多态性的引物对及试剂盒；采用PCR结合焦磷酸测序技术来实现。
本发明提供了一种用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对，所述人低氧耐受能力相关基因检测的多态性位点为EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902，所述引物对为焦磷酸测序引物对，其包括：
EGLN1 RS479200正向扩增引物：5’-TGTAAGGGCAGGGGAAGGAA-3’(SEQID NO.1)；
EGLN1 RS479200反向扩增引物：5’-GAGGGCAGTTCACTGAGTGTTAG-3’(SEQID NO.2)；
EGLN1 RS479200测序引物：5’-GGACTTTTATTATTGCTTGT-3’(SEQID NO.3)；
EGLN1 RS480902正向扩增引物：5’-CATGCCAGACCTACTGATTCAGA-3’(SEQID NO.4)；
EGLN1 RS480902反向扩增引物：5’-GGGTGTGAGTGGTATGTGAGAA-3’(SEQID NO.5)；
EGLN1 RS480902测序引物：5’-AAGTGATCTCCCAGTGAC-3’(SEQID NO.6)；
其中，所述EGLN1 RS479200反向扩增引物和EGLN1 RS480902反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
本发明还提供了一种用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的试剂盒，所述人低氧耐受能力相关基因检测的多态性位点为EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902，所述试剂盒包括：
PCR反应液1，所述PCR反应液1含有EGLN1 RS479200正向扩增引物：5’-TGTAAGGGCAGGGGAAGGAA-3’；
PCR反应液2，所述PCR反应液2含有EGLN1 RS480902正向扩增引物：5’-CATGCCAGACCTACTGATTCAGA-3’；
EGLN1 RS479200反向扩增引物：5’-GAGGGCAGTTCACTGAGTGTTAG-3’；
EGLN1 RS480902反向扩增引物：5’-GGGTGTGAGTGGTATGTGAGAA-3’；
EGLN1 RS479200测序引物：5’-GGACTTTTATTATTGCTT GT-3’；
EGLN1 RS480902测序引物：5’-AAGTGATCTCCCAGTGAC-3’；
其中，所述EGLN1 RS479200反向扩增引物和EGLN1 RS480902反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：EGLN1RS479200阳性对照品1，其为插有SEQID NO.7所示核苷酸序列的EGLN1 RS479200野生纯合子质粒；
所述SEQID NO.7所示核苷酸序列如下:
AGATCTTCTACACCCTTTAGGATCTAAGCTAAGTCTGCTTCCCAGATATCCTCCCGAACTCTGAATGTCCTTTGATCTCTCTTTTCTCAAAAACCTTTTATACCTTTTATTCCCAAATTATCTTCTCTAGAAATCTGTAAGGGCAGGGGAAGGAAAGGTTTTATACTATTCTGTCTTCGGCAGAGGACTTTTATTATTGCTTGTTACGTACAGTATTAGTCATATCTTGCTAACACTCAGTGAACTGCCCTCAGCTGATCCTCTGCCCTGTACCTCACCTCTGCTTTACCACCTTTCCATCCGATTTCTAAAACTGTAGTGGGACTTTTTAAAAAGTGTGTGAGAGTTTTAATCCTGTTGTGGTAAACTCGCCTTTCTTTGCTTGCTATACTGTTTCTAGTCCCTATTTTCCAGATAAAAATAGCCCAGGTCAGCATGGCTTGCACTATTTTTAACTCCAGGTACTAGGAGAAAGGTTTGCTCTAAAGGTGAAATGAAG；
EGLN1 RS479200阳性对照品2，其为所述EGLN1 RS479200野生纯合子质粒与插有SEQI D NO.8所示核苷酸序列的EGLN1 RS479200突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
所述SEQID NO.8所示核苷酸序列如下:
AGATCTTCTACACCCTTTAGGATCTAAGCTAAGTCTGCTTCCCAGATATCCTCCCGAACTCTGAATGTCCTTTGATCTCTCTTTTCTCAAAAACCTTTTATACCTTTTATTCCCAAATTATCTTCTCTAGAAATCTGTAAGGGCAGGGGAAGGAAAGGTTTTATACTATTCTGTCTTCGGCAGAGGACTTTTATTATTGCTTGTTATGTACAGTATTAGTCATATCTTGCTAACACTCAGTGAACTGCCCTCAGCTGATCCTCTGCCCTGTACCTCACCTCTGCTTTACCACCTTTCCATCCGATTTCTAAAACTGTAGTGGGACTTTTTAAAAAGTGTGTGAGAGTTTTAATCCTGTTGTGGTAAACTCGCCTTTCTTTGCTTGCTATACTGTTTCTAGTCCCTATTTTCCAGATAAAAATAGCCCAGGTCAGCATGGCTTGCACTATTTTTAACTCCAGGTACTAGGAGAAAGGTTTGCTCTAAAGGTGAAATGAAG；
EGLN1 RS479200阳性对照品3，其为插有SEQID NO.8所示核苷酸序列的EGLN1RS479200突变纯合子质粒；
EGLN1 RS480902阳性对照品1，其为插有SEQID NO.9所示核苷酸序列的EGLN1RS480902野生纯合子质粒；
所述SEQID NO.9所示核苷酸序列如下:
GATCTAATACAGCAATCTAATGACGCCAGTGTATTTCCCTTGAAATTTAAAAATATTCCATGGCACCCTTGCAAGTTAGCTACAGTGCTCTGGGATACATCGATGAACAATTTGGGATACTGAGTTCAGGTGGCTGTCAGAACGGCAGCATCCCCATTGCTTGGGAGGTTGTTGGAAATGTAGAATCTGGGCATCCATGCCAGACCTACTGATTCAGAATCTCCACTTTAACAAGATCTCCAAGTGATCTCCCAGTGACTCACAGACACATTAATGTAGACCAGAAGTGCTGGTCTAAGGTCCCTGCTTACGTTTTCTCACATACCACTCACACCCAACGCACCGCTTTCTGACTTTGCTCCCACAACTCCAGTGAAATTACCCCAGGAAAAGTCCCAAATTACCCCACTCCTTTAAAAAGAAAAAAAAAAAAGGCAATAAATGTCTTTTAGTTCCAATCCTAATTAACCCTCTCTATAGTGTTTGGTACTATTCAT；
EGLN1 RS480902阳性对照品2，其为所述EGLN1 RS480902野生纯合子质粒与插有SEQID NO.10所示核苷酸序列的EGLN1 RS480902突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
所述SEQID NO.10所示核苷酸序列如下:
GATCTAATACAGCAATCTAATGACGCCAGTGTATTTCCCTTGAAATTTAAAAATATTCCATGGCACCCTTGCAAGTTAGCTACAGTGCTCTGGGATACATCGATGAACAATTTGGGATACTGAGTTCAGGTGGCTGTCAGAACGGCAGCATCCCCATTGCTTGGGAGGTTGTTGGAAATGTAGAATCTGGGCATCCATGCCAGACCTACTGATTCAGAATCTCCACTTTAACAAGATCTCCAAGTGATCTCCCAGTGACTCATAGACACATTAATGTAGACCAGAAGTGCTGGTCTAAGGTCCCTGCTTACGTTTTCTCACATACCACTCACACCCAACGCACCGCTTTCTGACTTTGCTCCCACAACTCCAGTGAAATTACCCCAGGAAAAGTCCCAAATTACCCCACTCCTTTAAAAAGAAAAAAAAAAAAGGCAATAAATGTCTTTTAGTTCCAATCCTAATTAACCCTCTCTATAGTGTTTGGTACTATTCAT；
EGLN1 RS480902阳性对照品3，其为插有SEQID NO.10所示核苷酸序列的EGLN1RS480902突变纯合子质粒；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述EGLN1 RS479200阳性对照品2中所述EGLN1RS479200突变纯合子质粒和所述EGLN1RS479200野生纯合子质粒的数量比为1:1；所述EGLN1 RS480902阳性对照品2中所述EGLN1 RS480902突变纯合子质粒和所述EGLN1RS480902野生纯合子质粒的数量比为1:1。
在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：空白对照品，所述空白对照品为灭菌纯化水。
所述PCR反应液还含有其他组份，分别为常规的10×PCR Buffer、dNTPS和H2O，各组分按常规体积比配置(10×PCRBuffer、dNTPs、H2O及PCR反应液中反向扩增引物的体积比为5:3.375:37.5:1)。
所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于焦磷酸测序法检测EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性的试剂中的应用。
本发明还提供了如上所述的试剂盒在制备用于焦磷酸测序法检测EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性的试剂中的应用。
相较于现有技术，本发明提供的用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用焦磷酸测序法技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
二、通过利用焦磷酸测序法技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品和阳性对照品，使得所述试剂盒在检测EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性时，可以更好的确保检测结果的准确性。
附图说明
图1为临床样品EGLN1 RS479200野生型的焦磷酸测序图；
图2为临床样品EGLN1 RS479200突变杂合型的焦磷酸测序图；
图3为临床样品EGLN1 RS479200突变纯合型的焦磷酸测序图；
图4为临床样品EGLN1 RS480902野生型的焦磷酸测序图；
图5为临床样品EGLN1 RS480902突变杂合型的焦磷酸测序图；
图6为临床样品EGLN1 RS480902突变纯合型的焦磷酸测序图；
图7为临床EGLN1 RS479200空白对照品的焦磷酸测序图；
图8为临床EGLN1 RS480902空白对照品的焦磷酸测序图；
图9至图10为EGLN1 RS479200多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图9的测序结果不准确，只有图10的测序结果真实可靠；
图11至图12为EGLN1 RS480902多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图11的测序结果不准确，只有图12的测序结果真实可靠。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：试剂盒的制备(30测试/盒)
1、引物和探针的设计与合成
针对人EGLN1基因检测的多态性位点EGLN1 RS479200和EGLN1RS480902，选择特异的突变位点，使用PyroMark Assay Design2.0软件，设计引物；其中正向扩增引物、反向扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中EGLN1 RS479200和EGLN1RS480902反向扩增引物的5’为生物素标记。
表1.突变位点与类型
突变位点 碱基改变
EGLN1(RS479200) C>T
EGLN1(RS480902) C>T
扩增序列如表2：
表2.特异性扩增引物及引物序列
2、PCR反应液组成
表3.PCR反应液1组成
表4.PCR反应液2组成
原料名称 体积(μL) 30测试/盒(μL)
10×PCR Buffer 5 150
dATP(100mM) 0.075 2.25
dTTP(100mM) 0.0375 1.125
dCTP(100mM) 0.075 2.25
dGTP(100mM) 0.075 2.25
dUTP(100mM) 0.075 2.25
EGLN1 RS480902-F(5～10μM) 1 30
EGLN1 RS480902-R(5～10μM) 1 30
H2O 37.5 1117.5
总体积 47.25μL 1417.5
由于针对两个检测位点进行扩增，所以有2种不同的PCR反应液，分别对EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902位点进行检测。
3、酶混合液的组成
表5.酶混合液的组成
原料名称 体积(μL) 30测试/盒(μL)
Taq酶 1 30
UNG酶 0.5 15
总体积 1.5 45
4、测序引物的组成
表6.测序引物的组成
原料名称 体积(μL) 30测试/盒(μL)
EGLN1 RS479200测序引物 1.2 36
EGLN1 RS480902测序引物 1.2 36
5、阳性对照品的组成
表7.阳性对照品的组成
原料名称 体积(μL) 30测试/盒(μL)
EGLN1 RS479200阳性对照品1 1 30
EGLN1 RS479200阳性对照品2 1 30
EGLN1 RS479200阳性对照品3 1 30
EGLN1 RS480902阳性对照品1 1 30
EGLN1 RS480902阳性对照品2 1 30
EGLN1 RS480902阳性对照品3 1 30
6、空白对照品的组成
表8.空白对照品的组成
实施例2：试剂盒的使用
1、样品检测
溶解引物干粉(引物溶解后有效期为1个月)。按照模板数配制体系：取PCR反应液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq DNA聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照品或阳性对照品为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。
EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902体系各主要成分如下：
表9.EGLN1 RS479200体系各主要成分
表10.EGLN1 RS480902体系各主要成分
该体系反应程序如下：
表11.PCR反应程序
扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验PCR结果，以进行下一步程序。
2、焦磷酸测序
按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的MIX中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。
3、结果判断
EGLN1 RS479200的DNA测序峰值图中，C的频率≥90％，T的频率≤10％，即认为EGLN1 RS479200野生型；40％≤C的频率≤60％，40％≤T的频率≤60％，即认为EGLN1RS479200突变杂合型；T的频率≥90％，C的频率≤10％，即认为EGLN1 RS479200突变纯合型；
EGLN1 RS480902的DNA测序峰值图中，C的频率≥90％，T的频率≤10％，即认为EGLN1 RS480902野生型；40％≤C的频率≤60％，40％≤T的频率≤60％，即认为EGLN1RS480902突变杂合型；T的频率≥90％，C的频率≤10％，即认为EGLN1 RS480902突变纯合型；
若结果显示为红色，quality分析结果为Failed或者N/A，即认为结果无效或者是未检出，如空白对照。
4、质控标准
(1)EGLN1 RS479200对照质控品判断结果如下：
EGLN1 RS479200阳性对照品1：结果显示蓝色，quality分析结果为Passed，C的频率≥90％，T的频率≤10％；
EGLN1 RS479200阳性对照品2：结果显示蓝色，quality分析结果为Passed，40％≤C的频率≤60％，40％≤T的频率≤60％；
EGLN1 RS479200阳性对照品3：结果显示蓝色，quality分析结果为Passed，T的频率≥90％，C的频率≤10％；
空白对照：结果显示为红色，quality分析结果为Failed或者N/A。
以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
(2)EGLN1 RS480902对照质控品判断结果如下：
EGLN1 RS480902阳性对照品1：结果显示蓝色，quality分析结果为Passed，C的频率≥90％，T的频率≤10％；
EGLN1 RS480902阳性对照品2：结果显示蓝色，quality分析结果为Passed，40％≤C的频率≤60％，40％≤T的频率≤60％；
EGLN1 RS480902阳性对照品3：结果显示蓝色，quality分析结果为Passed，T的频率≥90％，C的频率≤10％；
空白对照：结果显示为红色，quality分析结果为Failed或者N/A。
以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
5、结果报告：
结果如图1、图2、图3、图4、图5及图6所示，样品结果的判断标准如下：
表12.报告样品检测结果
样本检测结果 报告结果
EGLN1 RS479200(C≥90％，T≤10％) 野生型
EGLN1 RS479200(40％≤C≤60％，40％≤T≤60％) 突变杂合型
EGLN1 RS479200(C≤10％，T≥90％) 突变纯合型
EGLN1 RS480902(C≥90％，T≤10％) 野生型
EGLN1 RS480902(40％≤C≤60％，40％≤T≤60％) 突变杂合型
EGLN1 RS480902(C≤10％，T≥90％) 突变纯合型
图1显示的是临床样品检测结果中EGLN1 RS479200的野生型，图2显示的是临床样品检测结果中EGLN1 RS479200的突变杂合型，图3显示的是临床样品检测结果中EGLN1RS479200的突变纯合型；图4显示的是临床样品检测结果中EGLN1 RS480902的野生型，图5显示的是临床样品检测结果中EGLN1 RS480902的突变杂合型，图6显示的是临床样品检测结果中EGLN1 RS480902的突变纯合型，图7和图8分别显示的是临床检测结果中EGLN1RS479200和EGLN1RS480902的空白对照品的焦磷酸测序图，图9至图10显示的是设计的EGLN1 RS479200多组引物的焦磷酸测序效果图，其中图10的引物为最佳，是我们产品中选定的引物；图11至图12显示的是设计的EGLN1 RS480902多组引物的焦磷酸测序效果图，其中图12的引物为最佳，是我们产品中选定的引物。
本发明提供的用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒具有以下有益效果：
一、通过利用焦磷酸测序法技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
二、通过利用焦磷酸测序法技术重新设计并优化了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测EGLN1RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；
三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品和阳性对照品，使得所述试剂盒在检测EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902基因多态性时，可以更好的确保检测结果的准确性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 南通大学
<120> 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaagggca ggggaaggaa 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcagtt cactgagtgt tag 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacttttat tattgcttgt 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgccagac ctactgattc aga 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggtgtgagt ggtatgtgag aa 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagtgatctc ccagtgac 18
<210> 7
<211> 499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatcttcta caccctttag gatctaagct aagtctgctt cccagatatc ctcccgaact 60
ctgaatgtcc tttgatctct cttttctcaa aaacctttta taccttttat tcccaaatta 120
tcttctctag aaatctgtaa gggcagggga aggaaaggtt ttatactatt ctgtcttcgg 180
cagaggactt ttattattgc ttgttacgta cagtattagt catatcttgc taacactcag 240
tgaactgccc tcagctgatc ctctgccctg tacctcacct ctgctttacc acctttccat 300
ccgatttcta aaactgtagt gggacttttt aaaaagtgtg tgagagtttt aatcctgttg 360
tggtaaactc gcctttcttt gcttgctata ctgtttctag tccctatttt ccagataaaa 420
atagcccagg tcagcatggc ttgcactatt tttaactcca ggtactagga gaaaggtttg 480
ctctaaaggt gaaatgaag 499
<210> 8
<211> 499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatcttcta caccctttag gatctaagct aagtctgctt cccagatatc ctcccgaact 60
ctgaatgtcc tttgatctct cttttctcaa aaacctttta taccttttat tcccaaatta 120
tcttctctag aaatctgtaa gggcagggga aggaaaggtt ttatactatt ctgtcttcgg 180
cagaggactt ttattattgc ttgttatgta cagtattagt catatcttgc taacactcag 240
tgaactgccc tcagctgatc ctctgccctg tacctcacct ctgctttacc acctttccat 300
ccgatttcta aaactgtagt gggacttttt aaaaagtgtg tgagagtttt aatcctgttg 360
tggtaaactc gcctttcttt gcttgctata ctgtttctag tccctatttt ccagataaaa 420
atagcccagg tcagcatggc ttgcactatt tttaactcca ggtactagga gaaaggtttg 480
ctctaaaggt gaaatgaag 499
<210> 9
<211> 497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatctaatac agcaatctaa tgacgccagt gtatttccct tgaaatttaa aaatattcca 60
tggcaccctt gcaagttagc tacagtgctc tgggatacat cgatgaacaa tttgggatac 120
tgagttcagg tggctgtcag aacggcagca tccccattgc ttgggaggtt gttggaaatg 180
tagaatctgg gcatccatgc cagacctact gattcagaat ctccacttta acaagatctc 240
caagtgatct cccagtgact cacagacaca ttaatgtaga ccagaagtgc tggtctaagg 300
tccctgctta cgttttctca cataccactc acacccaacg caccgctttc tgactttgct 360
cccacaactc cagtgaaatt accccaggaa aagtcccaaa ttaccccact cctttaaaaa 420
gaaaaaaaaa aaaggcaata aatgtctttt agttccaatc ctaattaacc ctctctatag 480
tgtttggtac tattcat 497
<210> 10
<211> 497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatctaatac agcaatctaa tgacgccagt gtatttccct tgaaatttaa aaatattcca 60
tggcaccctt gcaagttagc tacagtgctc tgggatacat cgatgaacaa tttgggatac 120
tgagttcagg tggctgtcag aacggcagca tccccattgc ttgggaggtt gttggaaatg 180
tagaatctgg gcatccatgc cagacctact gattcagaat ctccacttta acaagatctc 240
caagtgatct cccagtgact catagacaca ttaatgtaga ccagaagtgc tggtctaagg 300
tccctgctta cgttttctca cataccactc acacccaacg caccgctttc tgactttgct 360
cccacaactc cagtgaaatt accccaggaa aagtcccaaa ttaccccact cctttaaaaa 420
gaaaaaaaaa aaaggcaata aatgtctttt agttccaatc ctaattaacc ctctctatag 480
tgtttggtac tattcat 497

Claims (7)

1.一种用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对，其特征在于，所述人低氧耐受能力相关基因检测的多态性位点为EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902，所述引物对为焦磷酸测序引物对，其包括：
EGLN1 RS479200正向扩增引物：5’-TGTAAGGGCAGGGGA AGGAA-3’；
EGLN1 RS479200反向扩增引物：5’-GAGGGCAGTTCACTGA GTGTTAG-3’；
EGLN1 RS479200测序引物：5’-GGACTTTTATTATTGCTTG T-3’；
EGLN1 RS480902正向扩增引物：5’-CATGCCAGACCTACT GATTCAGA-3’；
EGLN1 RS480902反向扩增引物：5’-GGGTGTGAGTGGTAT GTGAGAA-3’；
EGLN1 RS480902测序引物：5’-AAGTGATCTCCCAGTGA C-3’；
其中，所述EGLN1 RS479200反向扩增引物和EGLN1 RS480902反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
2.一种用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述人低氧耐受能力相关基因检测的多态性位点为EGLN1 RS479200和EGLN1 RS480902，所述试剂盒包括：
PCR反应液1，所述PCR反应液1含有EGLN1 RS479200正向扩增引物：5’-TGTAAGGGCAGGGGAAGGAA-3’；
PCR反应液2，所述PCR反应液2含有EGLN1 RS480902正向扩增引物：5’-CATGCCAGACCTACTGATTCAGA-3’；
EGLN1 RS479200反向扩增引物：5’-GAGGGCAGTTCACTGA GTGTTAG-3’；
EGLN1 RS480902反向扩增引物：5’-GGGTGTGAGTGGTAT GTGAGAA-3’；
EGLN1 RS479200测序引物：5’-GGACTTTTATTATTGCTT GT-3’；
EGLN1 RS480902测序引物：5’-AAGTGATCTCCCAGTGAC-3’；
其中，所述EGLN1 RS479200反向扩增引物和EGLN1 RS480902反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：EGLN1 RS479200阳性对照品1，其为插有SEQID NO.7所示核苷酸序列的EGLN1 RS479200野生纯合子质粒；
EGLN1 RS479200阳性对照品2，其为所述EGLN1 RS479200野生纯合子质粒与插有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的EGLN1 RS479200突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
EGLN1 RS479200阳性对照品3，其为插有SEQID NO.8所示核苷酸序列的EGLN1RS479200突变纯合子质粒；
EGLN1 RS480902阳性对照品1，其为插有SEQID NO.9所示核苷酸序列的EGLN1RS480902野生纯合子质粒；
EGLN1 RS480902阳性对照品2，其为所述EGLN1 RS480902野生纯合子质粒与插有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的EGLN1 RS480902突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
EGLN1 RS480902阳性对照品3，其为插有SEQID NO.10所示核苷酸序列的EGLN1RS480902突变纯合子质粒；
其中，质粒载体为pMD18-T质粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述EGLN1 RS479200阳性对照品2中所述EGLN1 RS479200突变纯合子质粒和所述EGLN1 RS479200野生纯合子质粒的数量比为1:1；所述EGLN1 RS480902阳性对照品2中所述EGLN1 RS480902突变纯合子质粒和所述EGLN1RS480902野生纯合子质粒的数量比为1:1。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括空白对照品，所述空白对照品为灭菌纯化水。
6.权利要求1所述的引物对在制备用于焦磷酸测序法检测EGLN1 RS479200和EGLN1RS480902基因多态性的试剂中的应用。
7.权利要求2所述的试剂盒在制备用于焦磷酸测序法检测EGLN1 RS479200和EGLN1RS480902基因多态性的试剂中的应用。
CN201910328705.9A 2019-04-23 2019-04-23 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒 Pending CN110172517A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910328705.9A CN110172517A (zh) 2019-04-23 2019-04-23 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910328705.9A CN110172517A (zh) 2019-04-23 2019-04-23 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110172517A true CN110172517A (zh) 2019-08-27

Family

ID=67689884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910328705.9A Pending CN110172517A (zh) 2019-04-23 2019-04-23 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110172517A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154569A (zh) * 2015-05-14 2015-12-16 长沙三济生物科技有限公司 焦磷酸测序法检测vkorc1基因分型的引物对及试剂盒
CN105154568A (zh) * 2015-05-14 2015-12-16 长沙三济生物科技有限公司 焦磷酸测序法检测cyp3a4基因分型的引物对及试剂盒
CN109468376A (zh) * 2018-12-29 2019-03-15 青海省人民医院 急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154569A (zh) * 2015-05-14 2015-12-16 长沙三济生物科技有限公司 焦磷酸测序法检测vkorc1基因分型的引物对及试剂盒
CN105154568A (zh) * 2015-05-14 2015-12-16 长沙三济生物科技有限公司 焦磷酸测序法检测cyp3a4基因分型的引物对及试剂盒
CN109468376A (zh) * 2018-12-29 2019-03-15 青海省人民医院 急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOSHIKI YASUKOCHI等: "Association of EGLN1 genetic polymorphisms with SpO2 responses to acute hypobaric hypoxia in a Japanese cohort", <JOURNAL OF PHYSIOLOGICAL ANTHROPOLOGY> *
吕坡等: "EGLN1基因rs479200和rs480902位点多态性与藏族人群高原低氧适应关系的研究", 《中国解剖学会2013年年会论文文摘汇编》 *
陈芃等: "EGLN1基因多态性位点rs479200、rs2790870与高原肺水肿的关系", 《基础医学研究》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104630368B (zh) 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒
CN103436631B (zh) 一种检测cyp3a5基因多态性的试剂盒及方法
CN108048563A (zh) 一种基于snp位点对人营养素缺乏风险评估的方法
CN107488711B (zh) 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
CN105002275A (zh) 人类mthfr和mtrr基因多态性检测引物和试剂盒
CN107841537A (zh) 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法
CN107119107A (zh) 一种检测人类cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒
CN107460235A (zh) 一种基于ARMS‑PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒
CN106636441B (zh) 一种检测aldh2基因突变的探针及其应用和试剂盒
CN110408685A (zh) 用于检测人mthfr基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN105803075A (zh) 一种α-地中海贫血基因检测试剂盒
CN109182501A (zh) 一种叶酸代谢基因多态性检测引物及试剂盒
CN111118138A (zh) 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN101622363B (zh) 用于检测jak2基因的突变的探针及其用途
CN105154568A (zh) 焦磷酸测序法检测cyp3a4基因分型的引物对及试剂盒
CN104293932A (zh) 一种基于实时荧光pcr检测hla-b*5801等位基因的方法
CN106591485B (zh) 一种检测aldh2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒
CN110172517A (zh) 用于检测人低氧耐受能力相关基因多态性的引物对及试剂盒
CN103757094B (zh) 一种基于荧光pcr检测tyms基因多态性的方法
CN115044682B (zh) 与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用
CN109371113A (zh) 一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用
CN110272988A (zh) 人类mthfr基因多态性检测试剂盒
CN106636365B (zh) 用于检测agtr1基因的a1166c多态性位点的核酸、试剂盒及方法
CN109295206A (zh) 一种同时快速检测mthfr及mtrr基因多态性的试剂盒及方法
CN110004215A (zh) 人类mthfr基因多态性检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190827