CN109468376A - 急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒,属于基因检测技术领域。本发明采用核酸质谱技术建立一套用于高原反应相关基因检测方法,通过对基因检测结果的分析,利用模型计算高原反应患病风险,可针对高危人群进行高原反应防治知识普及,增加对高原反应重视;对特殊人群进行风险评估,筛选出高风险人群,对高风险人群进行密切关注;结合非遗传因素及家族史数据,尽早警示高原反应高危人群,尽量降低甚至避免高原反应后遗症的发生率及死亡率。本发明具有操作简单、准确率高、高通量、检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒,属于基因检测技术领域。
背景技术
高原反应(High Altitude Reaction),是指到达一定海拔高度后(一般指海拔高度在2700米以上),由于空气干燥、寒冷、紫外线强烈等的变化,身体因为不适应海拔高度而造成的气压差,含氧量少,而引发一些列症状和机能代谢变化的高原适应不全症。
高原反应按病程可分为急性、慢性两种。急性高原病(Acute High AltitudeDisease,AHAD),是指世居于平原的人进入海拔3000m以上高原地区,或原在高原地区居住到平原生活一段时间后重返高原时,机体对高原自然环境未适应的一系列急性缺氧反应。慢性高原病(Chronic High Altitude Disease,CHAD)又称Monge病,较少见,多数是由急性高原反应症状持续不消而演变来的。
2016年的一项研究调查表明,症状最轻的急性高原反应(acute mountainsickness,AMS)的发病率也会随着进入海拔高度的增加逐步上升。当平原地区的人急速进入高原时,由于对高原低氧等环境不适应,造成机体氧供应不足,氧的运输和利用受到阻碍,有些人员就会产生急性缺氧反应,缺氧可引起交感神经兴奋和儿茶酚胺释放,引起心率加快,同时,可使脑血流量显著增高。在缺氧环境下,血管内皮释放一氧化氮减少,导致肺血管收缩。持续的肺血管收缩可导致肺血管阻力增加,并由此导致高原性肺水肿等严重的致命性并发症。
研究发现,基因多态性与高原反应易感性有较高的相关性。比如ACE,AGT,eNOS,HIF-1α,EPAS1,VEGFA,EGLN1,HSP70等,但是现有的基因研究比较散乱,且高原反应的影响因素较为复杂,现有的基因检测技术荧光PCR法、荧光芯片法、Sanger测序、二代测序等,都存在一定的缺陷。比如荧光PCR法存在通量低、成本高的缺陷,Sanger测序和二代测序都存在操作繁琐、成本高的缺陷。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒及检测方法,采用核酸质谱技术建立一套用于高原反应相关基因检测方法,通过对基因检测结果的分析,利用模型计算高原反应患病风险,可针对高危人群进行高原反应防治知识普及,增加对高原反应重视;对特殊人群进行风险评估,筛选出高风险人群。
本发明第一个目的是提供一种急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒,包括对rs1801133、rs10193827、rs10206434、rs150877473、rs2275279、rs55981512、rs982414、rs6679627、rs4786504、rs1799983、rs10984811、rs41417552、rs7677143、rs17777329、rs1008438、rs1061581、rs1043618、rs1042718、rs4963516、rs749174、rs10941679、rs275651、rs6089953、rs2297441、rs6713088、rs843752、rs12615793、rs12615793、rs11896604、rs10929728、rs1801282、rs3025030、rs12406290、rs28358587、rs4309、rs199983、rs480902、rs1008438、rs1965708、rs480902、rs479200、rs699、rs6194、rs516651、rs1799983、rs3025030、rs1799983、rs1799983、rs1004467、rs3813865、rs3025030、rs130293、rs28357093、rs2010963、rs1799983、rs1562453、rs11549465、rs12097901、rs2790859、rs186996510、rs8066114、rs4461142、rs1799983、rs4762、rs1799998、rs1799983、rs1799983、rs1801282、rs5931057、rs7473282、rs5927307、rs12655827、rs7770302、rs1991872、rs2397218、rs5974802、rs11581271、rs938355、rs7969849、rs2592121、rs10949682、rs6122447、rs7359910、rs16890905、rs2017869、rs6137010、rs1064134、rs13129566、rs4072318、rs10932688、rs6715605、rs1059524、rs6531084、rs12471246、rs12649142、rs17052028、rs7774693、rs2037632、rs13264220、rs12684453、rs4333695、rs12240999、rs5025116、rs3009568、rs7898954、rs4572038、rs7926263、rs1454014、rs3019644、rs9570755、rs4906864、rs4984295、rs5000698、rs6110226、rs6138362、rs2688172和rs5971167位点进行核酸质谱检测的PCR反应试剂、SAP反应试剂和延伸反应试剂。
进一步地,所述的PCR反应试剂还包括蒸馏水、缓冲液、MgCl2、PCR正向引物、PCR反向引物、dNTP人源基因组DNA和DNA聚合酶。
进一步地,所述的SAP反应试剂包括蒸馏水、缓冲液、和虾碱磷酸酶。
进一步地,所述的延伸反应试剂包括蒸馏水、缓冲液、延伸引物、终止混合物、单碱基延伸酶。
进一步地,所述试剂盒用于检测急、慢性高原反应时,先采用OR值评估单核苷酸多态性与疾病的关联程度:ORA=(nA*ma)/(mA*na),其中,a为指定参考碱基,A为需分析碱基,n为病例组,m为对照组;然后采用WGRS算法评估多个位点与疾病之间的关系,WGRS用risk等位基因个数ci,ci∈(1),对取log后的risk等位基因的odd ratio,即进行加权来计算遗传风险wGRS:
本发明的第二个目的是提供一种急、慢性高原反应易感基因预警检测引物组,包括对rs1801133、rs10193827、rs10206434、rs150877473、rs2275279、rs55981512、rs982414、rs6679627、rs4786504、rs1799983、rs10984811、rs41417552、rs7677143、rs17777329、rs1008438、rs1061581、rs1043618、rs1042718、rs4963516、rs749174、rs10941679、rs275651、rs6089953、rs2297441、rs6713088、rs843752、rs12615793、rs12615793、rs11896604、rs10929728、rs1801282、rs3025030、rs12406290、rs28358587、rs4309、rs199983、rs480902、rs1008438、rs1965708、rs480902、rs479200、rs699、rs6194、rs516651、rs1799983、rs3025030、rs1799983、rs1799983、rs1004467、rs3813865、rs3025030、rs130293、rs28357093、rs2010963、rs1799983、rs1562453、rs11549465、rs12097901、rs2790859、rs186996510、rs8066114、rs4461142、rs1799983、rs4762、rs1799998、rs1799983、rs1799983、rs1801282、rs5931057、rs7473282、rs5927307、rs12655827、rs7770302、rs1991872、rs2397218、rs5974802、rs11581271、rs938355、rs7969849、rs2592121、rs10949682、rs6122447、rs7359910、rs16890905、rs2017869、rs6137010、rs1064134、rs13129566、rs4072318、rs10932688、rs6715605、rs1059524、rs6531084、rs12471246、rs12649142、rs17052028、rs7774693、rs2037632、rs13264220、rs12684453、rs4333695、rs12240999、rs5025116、rs3009568、rs7898954、rs4572038、rs7926263、rs1454014、rs3019644、rs9570755、rs4906864、rs4984295、rs5000698、rs6110226、rs6138362、rs2688172和rs5971167位点进行核酸质谱检测的PCR正向引物、反向引物和延伸引物。
本发明的第三个目的是提供一种急、慢性高原反应易感基因预警检测芯片,包括所述的引物组。
本发明的有益效果是:
本发明采用核酸质谱技术建立一套用于高原反应相关基因检测方法,通过对基因检测结果的分析,利用模型计算高原反应患病风险,可针对高危人群进行高原反应防治知识普及,增加对高原反应重视;对特殊人群进行风险评估,筛选出高风险人群,对高风险人群进行密切关注;结合非遗传因素及家族史数据,尽早警示高原反应高危人群,尽量降低甚至避免高原反应后遗症的发生率及死亡率。本发明具有操作简单、准确率高、高通量、检测成本低等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
关联研究队列需要分成病例组和健康对照组,研究的样本量越多越好,样本量尽量不要少于病例组2000人和健康对照组2000人。
1、病例组
按照高原反应的分类,可见病例组分为以下几种亚型,建议样本量如表1所示:
表1病例组分类及建议样本量
病理样本的其他要求:
1)对疾病的诊断需要参考统一的诊断标准;
2)各样本之间无血缘关系;
3)平时无糖尿病、肝病、肾病、高血压、心血管及呼吸系统疾病等疾病,身体健康的人群;
4)发病之前从未来过高原。
2、健康对照组
健康对照组需要与疾病组按照1:1的比例来搜集样本,因此,健康对照组需要2000人,见表2:
表2健康对照组样本量分布
健康对照组样本的其他要求
1)平时无糖尿病、肝病、肾病、高血压、心血管及呼吸系统疾病等疾病,身体健康的人群;
2)性别和年龄与病例组相匹配;
3)居住区域和海拔高度与病例组相匹配;
4)劳动强度与病例组相匹配;
5)达到高原后3个月左右未发生过相应的高原反应。
实施例1:
(1)引物设计与合成
针对表3中的96个基因多态位点,设计对应PCR扩增引物,以及特异性延伸引物,如表4所示。
其中,为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果,在每条PCR引物的5’端增加一定数目的碱基,如ACGTTGGATG,以增大每条PCR引物的分子量,从而超出质谱仪检测窗口。
表3高原反应相关的基因和位点
表4引物序列表
(2)将表4中的SNP位点根据孔位编号分为4组,各组中所含的各SNP位点的上下游引物混合,得到对应的4组扩增引物混合液;
(3)对应于上面扩增引物的分组方式,将单碱基延伸引物分为4组,分别得到4组单碱基引物的混合液;
(4)样本DNA的提取:参照核酸提取试剂盒厂家的说明书,对病例组和对照组的全血、唾液或者其他组织进行DNA的提取,DNA的浓度及纯度符合检测要求;
(5)以步骤(4)提取得到的DNA样本为模板,利用步骤(2)中的每组扩增引物混合分别进行PCR扩增,获得靶标位点的PCR产物;
(6)采用虾碱式磷酸酶(SAP反应液)消除步骤(5)反应体系中剩余dNTP;
(7)利用步骤(3)各组对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应,获得延伸产物;
(8)脱盐树脂纯化延伸产物;
(9)利用MassARRAY平台检测进行芯片点样、扫描,检测结果使用TYPER4.1软件进行分型并输出结果,通过质谱峰图来判断SNP位点的基因型。
其中,PCR反应体系及扩增程序如表5所示:
表5 PCR反应体系
PCR扩增程序:
SAP反应体系如表6所示:
表6 SAP反应体系
SAP反应程序:37℃40分钟,85℃5分钟,4℃恒温。
延伸反应体系及程序如表7所示:
表7延伸反应体系
延伸反应体系程序:
实施例2:风险评估分析方法
(1)OR值(odds ratio)又称比值比、优势比,主要指病例组中暴露人数与非暴露人数的比值除以对照组中暴露人数与非暴露人数的比值,是流行病学研究中病例对照研究中的一个常用指标。先采用OR值评估单核苷酸多态性与疾病的关联程度:ORA=(nA*ma)/(mA*na),其中,a为指定参考碱基,A为需分析碱基,n为病例组,m为对照组;ORA的计算表如表8所示:
表8碱基分布情况
ORA的计算:
ORA=(nA/mA)/(na/ma)=(nA*ma)/(mA*na)
解释:
风险型:ORA>1时,说明病例组的A的频率大于对照组的,即A有较高的发病危险;
保护型:ORA<1时,说明病例组的A的频率小于对照组的,即A有保护作用;
正常型:ORA=1时,通常作为参考的基因型。
(2)单个位点的OR值得到之后,采用WGRS算法评估多个位点与疾病之间的关系,WGRS用risk等位基因个数ci,ci∈(1),对取log后的risk等位基因的odd ratio,即进行加权来计算遗传风险wGRS:
通过随机模拟可以得到遗传风险的分布,根据分布并结合一些先验知识,如疾病的患病率,我们将表型结果分成五类:低风险(<0.6)、低于平均风险(<0.8)、平均风险(1左右)、高于平均风险(>1.2)和高风险(>2.3)。或者分为三类:平均风险、高于平均风险和高风险。
实施例3:
选取24例样本,参照核酸提取试剂盒厂家的说明书,对患者(受试者)的全血、唾液或者其他组织进行DNA的提取,DNA的浓度及纯度符合检测要求;其余按照实施例1的方法,对受试者进行检测,根据各位点的检测结果,对个体风险进行总体评估。采用本发明的试剂盒对24位受试者进行检测的结果显示,本发明的试剂盒的准确度为100%,灵敏度达到1ng/μl基因组DNA。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.一种急、慢性高原反应易感基因预警检测试剂盒,其特征在于,包括对rs1801133、rs10193827、rs10206434、rs150877473、rs2275279、rs55981512、rs982414、rs6679627、rs4786504、rs1799983、rs10984811、rs41417552、rs7677143、rs17777329、rs1008438、rs1061581、rs1043618、rs1042718、rs4963516、rs749174、rs10941679、rs275651、rs6089953、rs2297441、rs6713088、rs843752、rs12615793、rs12615793、rs11896604、rs10929728、rs1801282、rs3025030、rs12406290、rs28358587、rs4309、rs199983、rs480902、rs1008438、rs1965708、rs480902、rs479200、rs699、rs6194、rs516651、rs1799983、rs3025030、rs1799983、rs1799983、rs1004467、rs3813865、rs3025030、rs130293、rs28357093、rs2010963、rs1799983、rs1562453、rs11549465、rs12097901、rs2790859、rs186996510、rs8066114、rs4461142、rs1799983、rs4762、rs1799998、rs1799983、rs1799983、rs1801282、rs5931057、rs7473282、rs5927307、rs12655827、rs7770302、rs1991872、rs2397218、rs5974802、rs11581271、rs938355、rs7969849、rs2592121、rs10949682、rs6122447、rs7359910、rs16890905、rs2017869、rs6137010、rs1064134、rs13129566、rs4072318、rs10932688、rs6715605、rs1059524、rs6531084、rs12471246、rs12649142、rs17052028、rs7774693、rs2037632、rs13264220、rs12684453、rs4333695、rs12240999、rs5025116、rs3009568、rs7898954、rs4572038、rs7926263、rs1454014、rs3019644、rs9570755、rs4906864、rs4984295、rs5000698、rs6110226、rs6138362、rs2688172和rs5971167位点进行核酸质谱检测的PCR反应试剂、SAP反应试剂和延伸反应试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的PCR反应试剂包括蒸馏水、缓冲液、MgCl2、PCR正向引物、PCR反向引物、dNTP、人源基因组DNA和DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的SAP反应试剂包括蒸馏水、缓冲液和虾碱磷酸酶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的延伸反应试剂包括蒸馏水、缓冲液、延伸引物、终止混合物和单碱基延伸酶。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于检测急、慢性高原反应时,先采用OR值评估单核苷酸多态性与疾病的关联程度:ORA=(nA*ma)/(mA*na),其中,a为指定参考碱基,A为需分析碱基,n为病例组,m为对照组;然后采用WGRS算法评估多个位点与疾病之间的关系,WGRS用risk等位基因个数ci,ci∈(1),对取log后的risk等位基因的oddratio,即进行加权来计算遗传风险wGRS:
6.一种急、慢性高原反应易感基因预警检测引物组,其特征在于,包括对rs1801133、rs10193827、rs10206434、rs150877473、rs2275279、rs55981512、rs982414、rs6679627、rs4786504、rs1799983、rs10984811、rs41417552、rs7677143、rs17777329、rs1008438、rs1061581、rs1043618、rs1042718、rs4963516、rs749174、rs10941679、rs275651、rs6089953、rs2297441、rs6713088、rs843752、rs12615793、rs12615793、rs11896604、rs10929728、rs1801282、rs3025030、rs12406290、rs28358587、rs4309、rs199983、rs480902、rs1008438、rs1965708、rs480902、rs479200、rs699、rs6194、rs516651、rs1799983、rs3025030、rs1799983、rs1799983、rs1004467、rs3813865、rs3025030、rs130293、rs28357093、rs2010963、rs1799983、rs1562453、rs11549465、rs12097901、rs2790859、rs186996510、rs8066114、rs4461142、rs1799983、rs4762、rs1799998、rs1799983、rs1799983、rs1801282、rs5931057、rs7473282、rs5927307、rs12655827、rs7770302、rs1991872、rs2397218、rs5974802、rs11581271、rs938355、rs7969849、rs2592121、rs10949682、rs6122447、rs7359910、rs16890905、rs2017869、rs6137010、rs1064134、rs13129566、rs4072318、rs10932688、rs6715605、rs1059524、rs6531084、rs12471246、rs12649142、rs17052028、rs7774693、rs2037632、rs13264220、rs12684453、rs4333695、rs12240999、rs5025116、rs3009568、rs7898954、rs4572038、rs7926263、rs1454014、rs3019644、rs9570755、rs4906864、rs4984295、rs5000698、rs6110226、rs6138362、rs2688172和rs5971167位点进行核酸质谱检测的PCR正向引物、反向引物和延伸引物。
7.一种急、慢性高原反应易感基因预警检测芯片,其特征在于,包括权利要求6所述的引物组。
8.权利要求6所述的引物组在急、慢性高原反应易感基因预警检测中的应用。
9.权利要求7所述的芯片在急、慢性高原反应易感基因预警检测中的应用。
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