KR102543982B1 - Cpa3 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CPA3 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 본 발명의 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법은 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자, 바람직하게는 CPA3 유전자 상의 프로모터 부위 내의 cg13424229의 메틸화 수준을 측정하여 비만, 소아비만, 천식 및 제2형 당뇨병의 발병 여부를 조기에 높은 정확도로 예측 또는 진단할 수 있다.

Description

CPA3 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법{Method for providing information of prediction and diagnosis of obesity related disease using methylation level of CPA3 gene}
본 발명은 CPA3 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
비만(obesity)는 인체에 지방이 과도하게 축적되는 질병이다. 세계 보건 기구(World Health Organization, WHO)는 체질량 지수(body mass index, BMI)가 30 이상인 경우를 비만이라고 정의하고, 대한 비만학회에서는 BMI가 25 이상인 경우를 비만으로 정의한다. 비만은 유전체, 후성유전체, 환경 및 개개인의 생활 습관 등을 포함한 다양한 요소들에 의해 결정되는 복합 질환이며, 또한, 비만은 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 대사질환 및 염증과 관련된 위험 요소이다.
지난 수십 년 동안의 생활습관 변화로 인해 2015년 약 7억 명 이상의 비만 환자가 발생한 것으로 보고되었고, 대한 비만학회의 보고에 따르면 한국의 경우 비만 유병율이 2009년 29.7%에서 2015년 32.4%로 증가하였다. 또한, 2015년 대비 2030년의 비만 유병율은 약 1.5배 정도 증가할 것으로 예상되며, 비만은 제2형 당뇨병, 고혈압 및 고지혈증 등과 함께 한국의 사회경제 비용을 증가시키는 중요 요인이 될 것으로 예측된다.
최근, 전장유전체연관성분석법(Genome-wide association study, GWAS) 및 폭발적으로 증가한 유전체 정보 등에 힘입어 약 500개 이상의 비만 연관 유전마커(유전변이(variant) 및 유전좌위(loci))가 발굴되었다. 그러나, 전장유전체연관성분석법으로 발굴된 공통유전변이들은 비만의 유전적 구조(genetic architecture)를 약 20% 정도 밖에 설명하지 못하고 있으며, 밝혀지지 않은 나머지 80%의 상당 부분은 후성유전체, 환경 및 생활습관 등 비유전적 요인(non-genetic factor)의 영향일 것으로 보고되었다.
비유전적 요인인 후성유전체를 다루는 학문인 후성유전학(epigenetics)은 DNA의 염기서열이 변화하지 않는 상태에서 이루어지는 유전자 발현의 조절인 후생유전적 유전자 발현 조절을 연구하는 학문이다. 인간의 유전체에는 CpG라는 이중 염기서열이 다량으로 존재하고 있고, 이중 약 70%에 이르는 CpG의 사이토신 염기에는 메틸기(-CH3)가 결합되어 있는데 이를 DNA 메틸화(DNA methylation)라고 부른다. 이러한 DNA 메틸화 현상은 유전체의 각종 반복 서열 등에서 흔히 관찰되며, 이는 유전체의 안정성 유지 등에 중요한 역할을 한다. 한편 각종 유전자의 상단 5' 조절 부위에 CpG가 밀집된 독특한 영역이 존재하는데 이를 CpG 섬(CpG island)이라고 하며, 이 경우 CpG의 사이토신은 대부분 메틸기가 결합되어 있지 않다. 그러나 경우에 따라서 시토신 메틸화가 발생하며 이 부위의 뉴클레오솜의 히스톤 분자들과의 교감을 통해 크로마틴의 구조에 변화를 이끌어 결국 유전자 발현에 영향을 주게 된다.
후성유전체 연구에서 주로 다루어지는 DNA 메틸화는 유전자 발현과 표현형에 영향을 주는 중요 조절자(key regulator)로 알려져 있다. 유전적, 환경적 또는 생활습관 등의 변화로 인해 DNA 메틸화가 변화되고, 이에 따라 다양한 만성질환에 대한 병인(pathogenesis)과 관련된 것으로 보고되었다. 따라서, DNA 메틸화 연구를 통해 기존 비만 연관 GWAS 연구를 통해 설명하지 못하는 한계를 일부 충족할 수 있는 방법으로 주목받고 있다.
최근 메틸화 정보를 이용한 전장에피지놈연관성분석(Epigenome-wide association study, EWAS)이 수행되고 있으나 이에는 몇 가지 한계가 존재하는 것으로 보고되었다. 먼저, 대부분의 연구는 코호트 참여자로부터 얻은 혈액 시료를 이용한 연관성 연구로 기존의 EWAS 연구에서 수행하였던 샘플 크기에 비해 규모가 커졌으나, 수십만 명 이상의 정보를 이용하는 GWAS 연구에 비해 샘플 크기가 상대적으로 작아서, 단일 EWAS 연구만으로는 만성질환 변이 발굴 연구에 한계가 존재한다는 점이다. 두 번째로는, 코호트에서 정의한 환자군과 병원 환자의 메틸화 차이가 존재할 수 있으며, 각 조직 별로도 메틸화 상태가 서로 다를 수 있어 여러 정보들을 종합적으로 고려하여 분석해야 할 필요가 생긴다. 마지막으로, 유의한 연관성을 갖는 메틸화 마커가 유전자 발현에 영향을 미치지 않을 수도 있으므로 유전자 발현 (전사체)정보와의 연계 분석이 필요하다는 한계점이 존재한다.
이에 본 발명자들은 기존 분석의 한계를 극복하기 위해, 기존에 주로 수행되는 코호트 시료를 이용한 메틸화 마커 발굴 및 재현성 검증 뿐만 아니라 병원 시료를 이용한 마커 재검증, 동일인 시료를 이용한 메틸레이션-전사체 분석 및 소아비만 정보를 이용한 연령별 연관성 분석 등 다단계 검증방법을 수행함으로써, 실제로 유전자에 영향을 미치는 신뢰도 높은 메틸화 마커(CPA3 유전자 상의 cg13424229)를 발굴하였고, 상기 메틸화 마커와 비만 관련 질환(비만, 소아비만, 제2형 당뇨병 및 천식 등) 간의 연관성을 입증하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 전세계적으로 급속도로 증가하는 질병인 비만 및 이와 관련된 질병의 발병 여부를 높은 정확도로 진단하기 위해, CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 관련 질환의 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 관련 질환의 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법은 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자, 바람직하게는 CPA3 유전자 상의 프로모터 부위 내의 cg13424229의 메틸화 수준을 측정하여 비만, 소아비만, 천식 및 제2형 당뇨병의 발병 여부를 조기에 높은 정확도로 예측 또는 진단할 수 있다.
도 1은 비만과 연관된 메틸화 마커를 발굴하기 위한 다단계 분석에서 각 단계별 메틸화 상태의 방향성이 일치한 38개 유전자 상의 48개의 CpG 유전자 지역(과메틸화된 지역 22개, 저메틸화된 지역 26개)을 나타낸 도이다.
도 2는 상기 다단계 분석으로 발굴된 48개의 CpG 유전자 지역의 지방조직에서의 메틸화 변화와 유전자 발현 변화와의 관련성 여부, 지방조직과 혈액에서의 메틸화 변화 공통 여부 및 성인과 소아비만에서의 메틸화 변화 공통 여부에 따른 밴다이어그램을 나타낸 도이다.
도 3은 상기 다단계 분석에서 비만군 및 정상군 사이의 메틸화 차이를 나타낸 볼케이노 플롯(volcano plot)을 나타낸 도이다. 원형의 프로브는 48개의 DMPs(differentially methylated patterns)를 나타내고, 그 중 파란 원은 DMP 및 DEGs(differentially expressed genes) 간의 상관 관계를 보여주는 22개의 프로브를 나타내며, 붉은 채워진 원은 혈액 및 지방 조직 샘플에서 메틸화 변화가 동일한 7개의 프로브를 나타낸다.
도 4는 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자의 프로모터 지역에 위치한 cg13424229의 유전자위를 도식화한 도이다.
도 5는 지방 세포의 분화에 따른 CPA3 유전자의 발현 정도를 확인하기 위해, 21개의 지방전구세포(pre-adipocyte) 및 26개의 지방세포(adipocyte)에서의 CPA3 유전자의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 6는 지방세포(adipocyte), 췌도세포(pancreatic islet) 및 신장세포(kidney cells)에 대해 히스톤 단백질 ChIP-seq 데이터를 활용하여 DNA 크로마틴 상태를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 공용데이터베이스(Gene Expression Omnibus, GEO)를 이용하여 인간 및 마우스에서의 CPA3 발현 정도 및 비만 사이의 연관성을 확인한 도이다.
도 8은 GEO를 이용하여 인간 및 마우스에서의 CPA3 발현 정도 및 제2형 당뇨병 사이의 연관성을 확인한 도이다.
도 9는 GEO를 이용하여 인간 및 마우스에서의 CPA3 발현 정도 및 천식 사이의 연관성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 단계 (a)는 분리된 생물학적 시료로부터 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계이다.
상기 CPA3 유전자의 프로모터는 CpG 섬(island)을 포함하는 서열로서, 이는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 cg13424229일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 cg13424229는 UCSC Genome Browser Human GRCh37/hg19 DNA 서열에서 3번 염색체의 148,581,813 ~ 148,581,861 위치의 염기이다.
상기 메틸화는 게놈 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 프로모터 부위의 특정 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미하고, 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.
포유동물 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.
상기 생물학적 시료는 비만 관련 질환 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 지방 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 혈액 또는 지방 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비만 관련 질환은 비만, 소아비만, 천식, 당뇨 및 제2형 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있고, 바람직하게는 상기 비만 관련 질환은 비만일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은 메틸화 DNA 면역침강법(methylation DNA immunoprecipitation), DNA 메틸화 마이크로어레이(DNA methylation microarray), 중아황산염 시퀀싱(bisulfite sequencing), 코브라(COBRA; combined bisulfite restriction analysis), 실시간 메틸화 특이적 중합효소연쇄반응(real-time methylation specific PCR) 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (a)는 SREBF1(sterol regulatory element-binding transcription factor 1) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 SREBF1 유전자 프로모터 CpG 부위는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 cg11024682일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 cg11024682는 CSC Genome Browser Human GRCh37/hg19 DNA 서열에서 17번 염색체의 17,730,070 ~ 17,730,118 위치의 염기이다.
본 발명의 비만 관련 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 단계 (b)는 상기 검출된 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계이다.
상기 단계 (b)는 상기 검출된 메틸화 수준이 정상 대조군의 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준보다 낮은 경우 비만 관련 질환으로 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위가 저메틸화된 경우, CPA3 유전자 프로모터에 결합하는 전사인자(transcription factor)인 GABA1의 결합이 증가하여 CPA3의 발현량이 상승할 수 있고, 비만 관련 질환의 발병율이 증가할 수 있다.
상기 단계 (b)는 상기 측정된 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 SREBF1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 상기 검출된 메틸화 수준이 정상 대조군의 SREBF1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준보다 높은 경우 비만 관련 질환으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 관련 질환의 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
상기 CPA3 유전자의 프로모터는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다
상기 제제는 DNA 메틸화 여부를 검출하기 위한 특이적 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비만 관련 질환은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 관련 질환의 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
상기 CPA3 유전자의 프로모터는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 제제는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 비만 관련 질환은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서,
제 1단계에서 비만군 및 대조군 사이에 차이가 있는 메틸화 영역을 분석하여 비만 연관 메틸화 후보 마커를 발굴하고, 제 2단계 및 제 3단계에서 상기 후보 마커의 재현성을 검증한 결과, 비만군 및 대조군 간에 총 142개의 CpG 영역이 상이하게 메틸화된 지역(differential methylation patterns, DMPs)으로 확인되었다(표 2 참조). 제 1단계의 비만군에서 111개의 유전자 상의 상기 142개의 DMP 중 67개의 CpG 영역(45개의 유전자)은 저메틸화되고, 75개의 CpG 영역(66개의 유전자)은 과메틸화된 것으로 나타났다. 또한, 상기 비만군에서 유전자 본체 또는 3' UTR에 위치한 59개의 DMP 중 28개는 저메틸화, 31개는 과메틸화된 것을 확인하였고, 전사 개시 시점(transcription start site, TSS) 또는 5' UTR에 위치한 52개의 DMP 중 17개는 저메틸화, 35개는 과메틸화된 것을 확인하였다. 상기 142개의 DMP 중에서 38개의 유전자 상의 48개의 DMP가 각 단계별 메틸화 상태의 방향성이 일치하였다(표 3 및 도 1 참조). 또한, 각 단계에서 상기 48개의 DMP 중 22개의 DMP는 과메틸화되었고, 나머지 26개의 DMP는 저메틸화되었음을 확인하였다.
또한, 상기 75명의 참여자 동일인의 지방 시료를 이용하여 DNA 메틸화 정보 및 유전자 발현 정보를 분석한 결과, 111개의 CpG 영역의 DNA 메틸화가 113개의 유전자 발현과 상관 관계가 있음을 확인하였다(57개: 양의 상관 관계, 59개: 음의 상관 관계). 이 중 17개의 CpG 영역은 상기 제 1단계 내지 제 3단계의 비만군 및 대조군 간의 혈중 DNA 메틸화 차이와 비교하여 유의하고 일관된 차이가 있음을 확인하였고, 17개의 CpG 영역 중 FAM125A, CPA3, BTN3A3, ATF3 및 IL1RAP은 각각 전사 조절을 위해 전사 개시 부위(transcription start site)인 TSS1500 및 TSS200에 위치하는 것을 확인하였다.
상기 실시예 1-2에서 혈액 시료를 이용하여 다단계 분석한 비만 연관 메틸화 정보와 상기 실시예 2에서 지방 시료를 이용하여 분석한 비만 연관 메틸화 정보에서 메틸화 상태의 일관성을 갖는 메틸화 후보 마커를 확인한 결과, 상기 실시예 1-2에서 각 단계별 메틸화 상태의 방향성이 일치하는 48개의 DMP 중에서 24개의 CpG 지역이 유전자 발현과 상관 관계 있음을 확인하였고, 14개의 CpG 지역은 지방 시료 및 혈액 시료에서 유의적으로 메틸화 상태가 일관적인 것이 확인되었으며, 상기 24개의 CpG 지역과 14개의 CpG 지역 중 중복되는 CpG 지역은 7개의 비만 연관 DMP, 즉 SCD 유전자의 cg16744911, ABCG1 유전자의 cg06500161, BTN3A3 유전자의 cg1269795, ATF3 유전자의 cg14234394, RCAN2 유전자의 cg18706511, LRBA 유전자의 cg13279894 및 CPA3 유전자의 cg13424229인 것으로 확인되었다(도 2 및 3 참조).
또한, 상기 실시예 1 내지 3에서 발굴한 메틸화 후보 마커의 소아비만에 대한 영향력을 검증하기 위해, 한국소아청소년코호트연구(Korean Child-Adolescent Cohort Study, KoCAS)의 참여자 중 소아비만군 94명의 메틸화 정보를 분석하여, 기발굴한 메틸화 후보 마커와 대조한 결과, 32개의 CpG 영역이 유의적으로 과메틸화(16개)되거나 저메틸화(16개)된 것을 확인하였고, 소아비만 특이적인 DMP 중에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 cg13424229(p = 0.04, CPA3) 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 cg11024682(p = 0.02, SREBF1)만이 상기 실시예 1 내지 3의 다단계 분석, 유전자 발현 분석 및 지방조직 기반 분석 등의 결과와 일치하는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 47개의 지방조직 샘플(21개의 지방전구세포와 26개의 지방세포)에서의 CPA3 발현량을 분석한 결과, 지방세포에서의 CPA3 유전자의 발현량은 지방전구세포의 CPA3 유전자의 발현량과 비교하여 더 높은 것을 확인하였고(도 5 참조), 크로마틴 상태 분석 결과, 췌도세포에서 CPA3 유전자의 프로모터 부위는 녹색 계열 즉, 현재 활발하게 전사(transcription)되고 있는 반면, 지방세포에서는 CPA3 유전자 전체가 회색계열로 표현되어 강하게 조절 억제(repression)되고 있는 것이 확인되었고(도 6 참조), 공용데이터베이스(GEO)에서 다운받은 유전자 발현 결과를 통해, 인간 및 마우스에서 비만과 CPA3 유전자와의 뚜렷한 상관성이 있음을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 독립적으로 선정한 약 2,300명의 참여자 정보를 이용하여 제2형 당뇨병과 CPA3 유전자의 전사시작부위에 위치한 cg13424229의 연관성 분석을 수행한 결과, reference-free 방법인 ReFACTor와 reference-based 방법인 RefbaseEWAS 두 방법 모두에서 유의한 결과를 확인하였고(표 4 참조), GEO에서 다운받은 정보를 이용하여 제2형 당뇨병 발병 여부에 따른 CPA3 유전자의 발현 정도를 분석한 결과, 제2형 당뇨병 환자에서 CPA3의 발현이 상승하는 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, GEO에서 다운받은 정보를 이용하여 천식의 차도에 따른 CPA3 유전자의 발현 정도를 분석한 결과, 악화된 천식 환자에서 CPA3의 발현이 상승하는 것을 확인하였다(도 9 참조).
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 비만 관련 메틸화 후보 마커 발굴을 위한 다단계 분석
<1-1> 참여자 데이터 수집
비만과 연관된 신뢰도 높은 메틸화 마커를 발굴하기 위한 총 3단계의 메틸화 정보 분석을 수행하기 위해, 코호트 시료 및 병원 시료 데이터를 수집하였다.
구체적으로, 비만과 연관된 메틸화 후보 마커 발굴을 위한 제 1단계는 한국인유전체역학조사사업(Korean Genome and Epidemiology Study, KoGES)의 대규모 한국인 코호트(Health Examinees Study, HEXA) 참여자 중 체질량지수(Body Mass Index, BMI)>30kg/m2인 200명의 비만군 및 BMI<23kg/m2의 250명의 대조군의 메틸화 정보를 수집하였고, 상기 제 1단계에서 발굴된 후보 마커의 재현성을 검증하기 위한 제 2단계는 KoGES의 지역사회 기반 코호트(Ansan and Ansung Study, AAS) 참여자를 대상으로 BMI>27kg/m2인 133명의 비만군 및 BMI<23kg/m2의 240명의 대조군의 혈액 기반 메틸화 정보를 수집하였으며, 상기 후보 마커의 재검증 및 메틸화 차이에 따른 유전자 발현 차이를 검증하기 위한 제 3단계는, 서울 아산 병원(Asan Medical Center, AMC)에서 BMI>27kg/m2인 29명의 비만군 및 BMI<23kg/m2의 46명의 대조군의 혈액 기반 메틸화 정보를 수집하였다(표 1).
Figure 112020140171965-pat00001
<1-2> 각 단계에서의 메틸화 정보 분석
상기 실시예 1-1에서 수집한 각 단계의 참여자 데이터를 이용하여 메틸화 정보 분석을 수행하였다.
구체적으로, 메틸화 정보 분석은 Infinium EPIC chip(Illumina, CA, USA)를 이용한 Illumina HumanMethylation EPIC array를 통하여 수행되었다. 분석 과정에서 etection p-value가 0.01 이상이고, 낮은 표준편차값을 보이는 프로브는 제외하였고, 분석을 위한 raw data인 IDAT(Illumina intensity date) 파일은 Bioconductor의 Minfi 및 EnMix R 패키지를 이용하여 데이터 변환하여 사용하였다. 또한, background correction 및 dyebias adjustment와 같은 전처리 과정을 수행하였고, 각 샘플간의 차이를 정규화하기 위해 BMIQ(between-sample bias with probe-type bias)를 사용하였다. 상기 EnMix R 패키지의 PCRplot 패키지를 사용하여 슬라이드 및 어레이 사이의 배치오류(technical batch)를 추정하여 보정하였고, Minfi 패키지의 estimateCellCounts2 함수를 사용하여 세포 조성(blood-cell count) 보정을 수행하였다. 각 메틸화 수준을 의미하는 베타 값은 메틸화-비메틸화된 프로브 intenstiy 비율로 계산하였고, 이를 이용하여 정규화된 값인 M 값(log2(베타 값/(1-베타 값))을 계산하였다.
제 1단계에서 비만군 및 대조군 사이에 차이가 있는 메틸화 영역을 분석하여 비만 연관 메틸화 후보 마커를 발굴하고, 제 2단계 및 제 3단계에서 상기 후보 마커의 재현성을 검증한 결과, 비만군 및 대조군 간에 총 142개의 CpG 영역이 상이하게 메틸화된 지역(differential methylation patterns, DMPs)으로 확인되었다(표 2). 제 1단계의 비만군에서 111개의 유전자 상의 상기 142개의 DMP 중 67개의 CpG 영역(45개의 유전자)은 저메틸화되고, 75개의 CpG 영역(66개의 유전자)은 과메틸화된 것으로 나타났다. 또한, 상기 비만군에서 유전자 본체 또는 3' UTR에 위치한 59개의 DMP 중 28개는 저메틸화, 31개는 과메틸화된 것을 확인하였고, 전사 개시 시점(transcription start site, TSS) 또는 5' UTR에 위치한 52개의 DMP 중 17개는 저메틸화, 35개는 과메틸화된 것을 확인하였다.
Figure 112020140171965-pat00002
Figure 112020140171965-pat00003
Figure 112020140171965-pat00004
Figure 112020140171965-pat00005
Figure 112020140171965-pat00006
상기 142개의 DMP 중에서 38개의 유전자 상의 48개의 DMP가 각 단계별 메틸화 상태의 방향성이 일치하였다(표 3 및 도 1). 또한, 각 단계에서 상기 48개의 DMP 중 22개의 DMP는 과메틸화되었고, 나머지 26개의 DMP는 저메틸화되었음을 확인하였다.
Figure 112020140171965-pat00007
<실시예 2> DNA 메틸화 및 유전자 발현 간의 상관 관계 확인
DNA 메틸화 및 유전자 발현 간의 상관 관계를 확인하기 위해, 상기 실시예 1-1의 제 3단계의 75명의 참여자 동일인의 지방 시료를 이용하여 비만 조직 기반 DNA 메틸화 정보 및 유전자 발현 정보 분석을 수행하였다.
구체적으로, DNA 메틸화 정보 분석은 상기 실시예 1-2에 개시된 DNA 메틸화 정보 분석 방법을 수행하였고, 유전자 발현 정보 분석의 경우 Illumina 사의 HT-12 v4 expression array를 이용하여 조직으로부터 RNA를 추출하여 유전자 발현 정보를 생산한 후, Illumina의 분석 소프트웨어인 GenomeStudio를 이용하여 분석하였다. 분석 과정에서 detection p-value 값이 0.01 이상인 마커는 제거하였고, quantile normalization 방법을 이용하여 정규화하였다. 또한, t-test 분석 방법을 이용하여 비만군 및 정상군 간의 유전자 발현 차이를 계산하였고, R 패키지의 cor함수를 이용하여 메틸화 차이에 따른 유전자 발현 차이의 상관 관계를 계산하였으며, corrplot을 이용하여 시각화하였다.
상기 75명의 참여자 동일인의 지방 시료를 이용하여 DNA 메틸화 정보 및 유전자 발현 정보를 분석한 결과, 111개의 CpG 영역의 DNA 메틸화가 113개의 유전자 발현과 상관 관계가 있음을 확인하였다(57개: 양의 상관 관계, 59개: 음의 상관 관계). 이 중 17개의 CpG 영역은 상기 제 1단계 내지 제 3단계의 비만군 및 대조군 간의 혈중 DNA 메틸화 차이와 비교하여 유의하고 일관된 차이가 있음을 확인하였고, 17개의 CpG 영역 중 FAM125A, CPA3, BTN3A3, ATF3 및 IL1RAP은 각각 전사 조절을 위해 전사 개시 부위(transcription start site)인 TSS1500 및 TSS200에 위치하는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 혈액 및 지방 시료 기반 메틸화 상태 비교
발굴된 메틸화 후보 마커의 신뢰도를 높히기 위해, 상기 실시예 1-2에서 혈액 시료를 이용하여 다단계 분석한 비만 연관 메틸화 정보와 상기 실시예 2에서 지방 시료를 이용하여 분석한 비만 연관 메틸화 정보에서 메틸화 상태의 일관성을 갖는 메틸화 후보 마커를 확인하였다.
그 결과, 상기 실시예 1-2에서 각 단계별 메틸화 상태의 방향성이 일치하는 48개의 DMP 중에서 24개의 CpG 지역이 유전자 발현과 상관 관계 있음을 확인하였고, 14개의 CpG 지역은 지방 시료 및 혈액 시료에서 유의적으로 메틸화 상태가 일관적인 것이 확인되었으며, 상기 24개의 CpG 지역과 14개의 CpG 지역 중 중복되는 CpG 지역은 7개의 비만 연관 DMP, 즉 SCD 유전자의 cg16744911, ABCG1 유전자의 cg06500161, BTN3A3 유전자의 cg1269795, ATF3 유전자의 cg14234394, RCAN2 유전자의 cg18706511, LRBA 유전자의 cg13279894 및 CPA3 유전자의 cg13424229인 것으로 확인되었다(도 2 및 3).
<실시예 4> 소아비만에 대한 메틸화 후보 마커의 영향력 검증
상기 실시예 1 내지 3에서 발굴한 메틸화 후보 마커의 소아비만에 대한 영향력을 검증하기 위해, 한국소아청소년코호트연구(Korean Child-Adolescent Cohort Study, KoCAS)의 참여자 중 소아비만군 94명의 메틸화 정보를 분석하여, 기발굴한 메틸화 후보 마커와 대조하였다. 메틸화 정보 분석 방법은 상기 실시예 1-2에 개시된 DNA 메틸화 정보 분석 방법으로 수행하였다.
소아비만군 94명의 메틸화 정보를 분석한 결과, 32개의 CpG 영역이 유의적으로 과메틸화(16개)되거나 저메틸화(16개)된 것을 확인하였고, 소아비만 특이적인 DMP 중에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 cg13424229(p = 0.04, CPA3) 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 cg11024682(p = 0.02, SREBF1)만이 상기 실시예 1 내지 3의 다단계 분석, 유전자 발현 분석 및 지방조직 기반 분석 등의 결과와 일치하는 것을 확인하였다(도 2).
SREBF1 유전자의 본체에 위치한 cg11024682는 소아 및 성인 코호트의 비만군에서 과메틸화되었고, CPA3 유전자의 프로모터 영역인 TSS1500에 위치한 cg13424229는 비만군에서 저메틸화되는 것으로 나타났다. SREBF1 유전자의 본체 부분에 위치한 cg11024682는 비만과의 연관성이 기보고된 지역인 반면, CPA3 유전자의 전사 개시 시점로부터 약 1,500bp 떨어진 지역에 위치한 cg13424229는 비만과의 연관성이 보고되지 않은 지역으로, 본 발명자들은 CPA3 유전자의 cg13424229를 비만 관련 질환에 대한 메틸화 마커로 선정하였다.
<실시예 5> 비만에 대한 메틸화 마커의 영향력 검증
<5-1> 지방조직 분화 상태별 CPA3 유전자의 발현량 분석
UCSC genome browser에서 CPA3 유전자 상의 cg13424229가 위치한 지역을 분석한 결과(도 4), 이 지역은 전사인자(transciption factor)인 GATA1의 결합부위로 알려져 있어, 메틸화 변화에 따른 전사인자 결합의 변화가 야기될 수도 있다는 점에 착안하여, 신규로 발굴한 메틸화 마커인 CPA3 유전자 상의 cg13424229가 비만과 연관성이 있는지 확인하기 위해, 47개의 지방조직 샘플(21개의 지방전구세포 및 26개의 지방세포)에서의 CPA3 유전자의 발현양을 측정하였다.
구체적으로, 지방 조직 및 정제된 세포(지방전구세포 및 지방세포)의 전체 RNA는 RNeasy Lipid tissue kit(Qiagen, Hilden, Germany) 및 RNeasy Micro kit(Qiagen, Hilden Germany)를 이용하여 추출하였고, 상이하게 발현된 유전자(differentially expressed genes(DEGs)를 확인하기 위해 HT-12 v4 expression array(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 지방 조직의 mRNA 샘플(n = 75)에서 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다. Detection p-value가 0.01 이상인 프로브는 제거하였고, GenomeStudio 소프트웨어(Illumina, CA, USA)를 사용하여 quantile normalization 방법을 적용하였다. 비만군 및 정상군을 비교하기 위해, two sample t-test를 수행하였다. 상기 정제된 세포는 TruSeq (Stranded) mRNA Sample Preparation Kit를 사용하여 cDNA 라이브러리로 준비하였고, HiSeq platform(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 시퀀싱하였다. 샘플의 정렬되지 않은 원시 시퀀싱 리드(raw sequencing reads)는 전처리되었고, 전처리된 리드는 STAR aligner를 사용하여 human reference genome hg19에 정렬되었다. 그 후 리드 카운트의 유전자 발현 추정치를 계산하였고, RSEM 1.3.0(https://deweylab.github.io/RSEM)을 사용하여 비만군 및 정상군 샘플을 비교하였다.
47개의 지방조직 샘플(21개의 지방전구세포와 26개의 지방세포)에서의 CPA3 발현량을 분석한 결과, 지방세포에서의 CPA3 유전자의 발현량은 지방전구세포의 CPA3 유전자의 발현량과 비교하여 더 높은 것을 확인하였고(도 5), 이는 지방 분화에 따라 신규 메틸화 마커인 CPA3 유전자 상의 cg13424229가 저메틸화되어 있음을 시사한다.
<5-2> ChIP-sequencing을 이용한 조직별 염색질 상태 분석
지방세포(adipocyte), 췌도세포(pancreatic islet) 및 신장세포(kidney cell) 내의 염색질 상태를 분석하기 위해, ChIP-sequencing(Chromatin ImmunoPrecipitation followed by sequencing, ChIP-seq)을 이용하였다. ChIP-sequencing은 특정 단백질이 유전체 상에 붙는 위치를 캡처하는 기술로, 본 발명에서는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위 또는 인핸서 부위 등과 상호작용하는 단백질인 히스톤 단백질이 유전체 상에 결합한 위치를 캡처하여 조절부위 (binding site)를 확인하였다. 히스톤 단백질은 유전자의 프로모터 부위와 상호작용하는 H3K4me3(유전자 발현 혹은 프로모터 활성화 담당), H3K27me3(유전자 발현 혹은 프로모터 비활성화 담당), H3K4me1(인핸서 부위와 상호작용), H3K27ac(유전자의 프로모터 부위 또는 인핸서 부위와 상호작용하여 유전자의 활성화를 담당) 및 H3K36me3(유전자 몸체와 상호작용) 등 총 5개의 히스톤 단백질을 대상으로 ChIP-sequencing을 수행하였다.
구체적으로, ChIP-sequencing용 라이브러리는 Illumina 사의 표준 프로토콜에 따라 구성되었으며, Illumina 사의 Hiseq 2500 platform을 이용하여 정보를 생산하였다. ChiP-sequencing의 리드들은 samtools와 Picard를 이용하여 전처리를 수행하였고, ChromHMM 등을 이용하여 3개의 지방세포, 4개의 췌도세포 및 5개의 신장세포 샘플의 조직별 크로마틴 상태를 분석하였다. 각 샘플의 크로마틴 상태는 Roadmap Epigenomics Consortium에서 제안한 'Expanded 18-state model'에 따라 구분하였다. 각 히스톤 단백질의 유전체상의 위치 및 시퀀싱 양(단백질의 결합 정도)들의 조합에 따라 각 유전체(크로마틴) 상태를 분류하고, 이를 자동화하는 도구인 ChromHMM을 이용하여 크로마틴의 상태를 분석하였다.
크로마틴 상태 분석 결과, 췌도세포에서 CPA3 유전자의 프로모터 부위는 녹색 계열 즉, 현재 활발하게 전사(transcription)되고 있는 반면, 지방세포에서는 CPA3 유전자 전체가 회색계열로 표현되어 강하게 조절 억제(repression)되고 있는 것이 확인되었다(도 6).
<5-3> 공용데이터베이스를 이용한 지방세포의 CPA3 유전자 발현 분석
추가적으로, 지방세포 내에서 CPA3 유전자 발현량을 측정하기 위해, GEO Profiles(Gene Expression Omnibus, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles)에서 사람 19명의(대조군 10명, 비만군 9명) 지방세포의 유전자 발현량을 Affymetrix Human Genome U95A Array로 측정하여 공개한 유전자 발현량 프로파일 데이터(GDS3601)에서 CPA 유전자 발현량 값을 profile_data.txt 형태로 제공받아, R-language의 시각화 라이브러리인 ggplot2 패키지에서 제공하는 박스 플롯으로 대조군 및 비만군의 CPA3 유전자 발현량 값을 가시화하여 그 차이를 비교하였다.
위와 동일한 방법으로 마우스 14마리의 지방세포의 유전자 발현량을 Affymetrix Murine Genome U74A Version 2 Array로 측정하여 공개한 유전자 발현량 프로파일 데이터(GDS2743)에서 CPA3 유전자 발현량 값을 제공받아 지방전구세포와 지방세포 상태일 때 CPA3 유전자 발현량 값 차이를 ggplot2의 박스 플롯으로 가시화하여 차이를 비교하였다.
공용데이터베이스(GEO)에서 다운받은 유전자 발현 결과를 통해, 인간 및 마우스에서 비만과 CPA3 유전자와의 뚜렷한 상관성이 있음을 확인하였다(도 7).
<실시예 6> 제2형 당뇨병에 대한 메틸화 마커의 영향력 검증
<6-1> 제2형 당뇨병 및 CPA3 유전자 사이의 연관성 분석
1,046명의 제2형 당뇨병 환자군 및 1,288명의 대조군 등 혈액기반 메틸화 정보를 이용한 제2형 당뇨병에서의 CPA3 유전자의 영향력을 분석하였다. 지역사회 기반 코호트 및 대도시 코호트에서 독립적으로 선정한 약 2,300명의 참여자 정보를 이용하여 제2형 당뇨병과 CPA3 유전자의 전사시작부위에 위치한 cg13424229의 연관성 분석을 수행하였다. reference-free 방법인 ReFACTor(Reference-Free Adjustment for Cell-Type composition)와 reference-based 방법인 RefbaseEWAS(Reference-based epigenome-wide association study) 두 방법을 사용하여 연관성 분석을 수행하였다. ReFACTor는 주성분분석(Principle component analysis, PCA) 방법을 이용하여 레퍼런스를 사용하지 않아도 cell type composition의 보정이 가능하며, 모든 세포에도 적용가능한 방법이고(Nature Methods (2016) May;13(5):443-5), RefbaseEWAS는 전혈(whole blood)의 각 필수 면역 구성 성분(principle immune component)의 methylation signature를 backbone (레퍼런스)으로 하여 세포 유형 이질성(cell type heterogeneity을 보정하는 방법이다(BMC Bioinformatics (2012)13:86).
독립적으로 선정한 약 2,300명의 참여자 정보를 이용하여 제2형 당뇨병과 CPA3 유전자의 전사시작부위에 위치한 cg13424229의 연관성 분석을 수행한 결과, reference-free 방법인 ReFACTor와 reference-based 방법인 RefbaseEWAS 두 방법 모두에서 유의한 결과를 확인하였다(표 4).
Figure 112020140171965-pat00008
<6-2> GEO 정보를 이용한 제2형 당뇨병 발병 여부에 따른 CPA3 유전자 발현 차이 분석
상기 실시예 1 내지 4에 의해 발굴된 메틸화 마커인 cg13424229의 제2형 당뇨병에 대한 영향력을 검증하기 위해, GEO 정보를 이용하여 제2형 당뇨병 환자 및 정상인의 췌도세포에서의 CPA3 유전자 발현량 차이를 분석하였다. 사람 19명의 췌도세포(GDS3782)의 정보를 이용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 5-3에 개시된 방법과 동일하게 수행하였다.
GEO에서 다운받은 정보를 이용하여 제2형 당뇨병 발병 여부에 따른 CPA3 유전자의 발현 정도를 분석한 결과, 제2형 당뇨병 환자에서 CPA3의 발현이 상승하는 것을 확인할 수 있었다(도 8). CPA3 유전자의 발현이 증가하는 것은 CPA3 유전자의 cg13424229의 저메틸화에 의한 것이므로, 이는 CPA3 유전자의 cg13424229의 메틸화 정도가 제2형 당뇨병 발병 예측 또는 진단을 위한 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다.
<실시예 7> 천식에 대한 메틸화 마커의 영향력 검증
상기 실시예 1 내지 4에 의해 발굴된 메틸화 마커인 cg13424229의 천식에 대한 영향력을 검증하기 위해, GEO 정보를 이용하여 천식 환자 및 정상인의 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서의 CPA3 유전자 발현량 차이를 분석하였다. 사람 19명의 PBMC(GDS3615)의 정보를 이용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 5-3에 개시된 방법과 동일하게 수행하였다.
GEO에서 다운받은 정보를 이용하여 천식의 차도에 따른 CPA3 유전자의 발현 정도를 분석한 결과, 악화된 천식 환자에서 CPA3의 발현이 상승하는 것을 확인할 수 있었다(도 9). CPA3 유전자의 발현이 증가하는 것은 CPA3 유전자의 cg13424229의 저메틸화에 의한 것이므로, 이는 CPA3 유전자의 cg13424229의 메틸화 정도가 천식 발병 예측 또는 진단을 위한 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다.
<110> Korea Disease Control and Prevention Agency <120> Method for providing information of prediction and diagnosis of obesity related disease using methylation level of CPA3 gene <130> 2020P-07-015 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cg13424229 of CPA3 <400> 1 cacactattt tgatagtaca taagcgtgac tctgagaagt tttatctac 49 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cg11024682 of SREBF1 <400> 2 caggcgccct ttaatgactc tggccgatgt attctgtgag gccatgagg 49

Claims (17)

  1. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 CPA3 유전자 프로모터 CpG 부위는 cg13424229인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 cg13424229는 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 생물학적 시료는 비만 관련 질환 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 지방 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 비만 관련 질환은 비만, 소아비만, 천식, 당뇨 및 제2형 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은 메틸화 DNA 면역침강법(methylation DNA immunoprecipitation), DNA 메틸화 마이크로어레이(DNA methylation microarray), 중아황산염 시퀀싱(bisulfite sequencing), 코브라(COBRA; combined bisulfite restriction analysis), 실시간 메틸화 특이적 중합효소연쇄반응(real-time methylation specific PCR) 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 상기 측정된 메틸화 수준이 정상 대조군의 CPA3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준보다 낮은 경우 비만 관련 질환으로 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 SREBF1(sterol regulatory element-binding transcription factor 1) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;를 더 포함하고,
    상기 단계 (b)는 상기 측정된 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 SREBF1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 SREBF1 유전자 프로모터 CpG 부위는 cg11024682인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 cg11024682는 서열번호 2로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 상기 측정된 메틸화 수준이 정상 대조군의 SREBF1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준보다 높은 경우 비만 관련 질환으로 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 관련 질환의 진단용 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 CPA3 유전자 프로모터 CpG 부위는 cg13424229인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단용 키트.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 비만 관련 질환은 비만, 소아비만, 천식, 당뇨 및 제2형 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단용 키트.
  15. CPA3(carboxypeptidase A3) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 관련 질환의 진단용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 CPA3 유전자 프로모터 CpG 부위는 cg13424229인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단용 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 비만 관련 질환은 비만, 소아비만, 천식, 당뇨 및 제2형 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 비만 관련 질환의 진단용 조성물.
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