TWI527906B

TWI527906B - 檢測心房顫動之風險的方法

Info

Publication number: TWI527906B
Application number: TW103128689A
Authority: TW
Inventors: 蔡佳醍
Original assignee: 國立臺灣大學
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2016-04-01
Also published as: TW201608027A

Description

檢測心房顫動之風險的方法

本發明係提供一種檢測心房顫動(atrial fibrillation)之風險的方法，特別是一種利用分析第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因的拷貝數變異(copy number variants，CNV)作為心房顫動之風險的檢測方法。

心房顫動(atrial fibrillation)是目前在臨床上最常見的心律不整的症狀，在一般民眾的發生率更高達一百分之一，年紀大於75歲病人發生率更高達十分之一。罹患心房顫動的患者在臨床上會感到心悸、疲倦、頭暈、甚至喘息。由於心房顫動在發生時，會減少心房以及整體心臟的輸運量，導致心房顫動的患者會有誘發心臟衰竭的危險性。目前也有許多的醫學研究證實心房顫動的產生會伴隨著患者的高住院率以及死亡率。而因為心律不整需要住院治療的患者中更有高達三分一都與心房顫動的發生與其急性惡化有關。另外，心房顫動是心房肌肉沒有正常收縮，在不同顫動下，血流減慢並停留在左心耳，並凝固為血塊，當血塊鬆脫後會流向身體各處，若流至大腦會阻塞血管，導致缺血性腦中風。有心房顫動患者其罹患缺血性腦中風的風險為沒有心房顫動患者的4到5倍，且根據統計，在臺灣地區之缺血性腦中風患者每五位就有一位是由於心房顫動引起，甚至有很多患者都是因為第一次中風後才得只有心房顫動的症狀，如此可知能早期預測罹患此疾病風險的重要性。

心房顫動依其發生的特性可以分為陣發性(paroxysmal)、持續性(persistent)以及永久性(permanent)的心房顫動。其中陣發性的心房顫動發生後，心臟自動會終止心律不整的情形，並且回復到正常的心律；而持續性的心房顫動則是需要使用藥物或者是心臟電擊術才能讓心臟回覆到正常的心律；永久性的心房顫動則是無法藉由使用藥物或是心臟電擊術讓心臟回覆到正常的心律，一但發生心房顫動心臟就會永久維持在心律不整的狀態。儘管心房顫動依據其好發的特質可分為上述不同種類，但所增加例如是中風或心臟衰竭等相關病變的機率是一樣高的，而心房顫動所引起的死亡率也常與中風和心臟衰竭有關。近期的醫學研究亦報導罹患心房顫動的患者其死亡率更高達一般民眾的兩倍。因此能否事先預知患者會有心房顫動的症狀產生，進而能夠提早預防並且改善其後續的相關療程，已成為未來預防以及治療心律不整的重要課題。雖然有部份心房顫動的產生是因為心臟結構上的病變所導致的，例如是缺血性的心臟疾病、心臟肥大、心臟衰竭或者是瓣膜性心臟病，然而，目前的研究也發現有極多罹患心房顫動的患者身上並沒有發現到任何心臟結構性的問題，而這樣的心房顫動則被稱為純粹性的心房顫動(lone atrial fibrillation)。所以除了心臟本身結構上的問題外，目前的研究也認為有其他未知的因子也會誘發並且跟大部分心房顫動的產生有直接的相關性。因此，除了結構性的心臟疾病外，是哪些未知的危險因子會誘發心房顫動的發生，是目前研究心房顫動最熱門且重要的課題，而目前認為遺傳基因變異也是一非常重要之危險誘發因子。

在本發明中，經由嚴格的取樣以及篩選出心房顫動患者，經由全基因組相關性研究(genome-wide association，GWAS)顯示出第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因第一內含子拷貝數變異與心房顫動的罹病風險有非常直接的相關性，且帶有KCNIP1基因拷貝數變異的個體，其後續會罹患心房顫動的風險值更高達一般健康個體的兩倍。故第一型鉀通道結合蛋白的拷貝數變異可用以篩選出可能罹患心房顫動的高風險族群，並可以提供醫療建議給該些高風險的族群以減低其後續產生心房顫動的機會，甚至可以提高治療並且改善心房顫動所連帶引起的併發症。此外，KCNIP1基因的表現與功能主要與神經系統有關，本領域尚未得知與心房顫動或其他心臟病有任何相關性(An WF,Bowlby MR,Betty M,Cao J,Ling HP,Mendoza G,Hinson JW,Mattsson KI,Strassle BW,Trimmer JS et al.2000.Modulation of A-type potassium channels by a family of calcium sensors.Nature 403(6769)：553-556)。

本發明提供一種檢測心房顫動之風險的方法，其步驟包括：(a)提供一個體一包含核酸之樣本；以及(b)分析該樣本染色體5q位置上基因拷貝數變異(copy number variation，CNV)；其中該拷貝數變異在(a)樣本中拷貝數大於正常樣本時，表示該個體具有心房顫動之風險。

在本發明之一實施例中，該步驟(b)中該基因拷貝數變異係位於染色體5q33.1的位置上。

在本發明之一實施例中，該步驟(b)中該基因拷貝數變異係位於染色體5q33.1的第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因，且其中步驟(b)中進一步包含分析該KCNIP1基因的第一個內含子，當該第一個內含子具有核酸序列嵌入(insertion)而導致拷貝數大於正常樣本時，則該個體具有高的心房顫動風險。

在本發明之一實施例中，該樣本係為基因組(genomic)DNA樣本，該樣本係為來自患者的組織或體液中。

本發明另提供一種檢測心房顫動之遺傳風險的檢測套組，包含一個染色體5q上基因的聚合酶鏈鎖反應引子序列。

在本發明之一實施例中，該基因係為於染色體5q33.1的位置上。

在本發明之一實施例中，其中該基因係為第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因。

在本發明之一實施例中，其中基因拷貝數變異(copy number variation，CNV)在染色體5q上係為拷貝數增加。

心房顫動是一種常見且複雜之心律不整，過去已知之心房顫動相關基因變異皆不是拷貝數變異。

過去已知外顯子(exon)的拷貝數變異會導致編碼序列的中斷及改變編碼蛋白質的功能，而產生顯著的表現型。然而，本發明卻相反地證實大多數的拷貝數變異位在基因的內含子，且也會產生顯著的表現型。因此，本發明提供一種經由檢測一個體之樣本而得知該個體心房顫動之風險的方法，經由檢測一個體KCNIP1基因第一內含子拷貝數以確認該個體罹患心房顫動的機率。

以下將進一步說明本發明的實施方式，以下所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本文中所述之「拷貝數變異(copy number variation，CNV)」意指細胞基因組中存在的基因或遺傳區域的拷貝數量的改變，拷貝數變異可能會增加拷貝數，或是減少拷貝數。

本文中所述之「正常拷貝數(copy number)」意指一個正常二倍體細胞的各個染色體及其中所含之基因具有兩個拷貝。

本文中所述之「第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)」序列是取自美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology information，NCBI)。

檢測拷貝數變異的方法包含有：染色體核型分析(Karyotype)、螢光原位雜交(FISH)、多重連接探針擴增技術(MLPA)、微陣列晶片技術(例如是單核苷酸多型性生物晶片(single nucleotide polymorphism array)及晶片-比較基因組雜交(array-CGH))、即時聚合酶連鎖反應(Real time polymerase chain reaction，RT-PCR)、聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)及新一代定序技術(Next generation sequence)等方法，但不限於此。

人類基因組經常可以觀察到片段的結構變異，如缺失及複製。在這些結構變異中，拷貝數變異經常包含到基因的區域。由於微陣列晶片技術及新一代定序技術的進展，已經有很多物種的拷貝數變異被偵測出來。基因拷貝數變異廣泛用於全基因組相關性研究(genome-wide association，GWAS)，近年來，拷貝數變異(CNV)的分析在複雜疾病的全基因組關聯研究已經吸引了很多關注。

心房顫動(atrial fibrillation)是一種常見且複雜之心律不整，雖然先前進行全基因組相關性研究已顯示出九個基因區域的單核苷酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)與心房顫動有相關性，其中包含在染色體4q25成對樣同源域轉錄因子2(Paired-like homeodomain transcription factor 2，PITX2)基因的rs2200733、在染色體16q22鋅指同源盒蛋白3(zinc finger homeobox3，ZFHX3)基因的rs2106261及在染色體1q21 Ca²⁺激活K⁺通道蛋白基因3(calcium-regulated potassium channel 3，KCNN3)基因的rs1337633，但該些變異皆為單核苷酸之變異，且無法完全解釋充分的說明對於心房顫動的基因風險以及在功能上的意義也是未知的。另外，亦關於手術後(postoperative)心房顫動與染色體3(Chr 3：76952521-76965475bp)及染色體19(Chr19：48457670-48531928bp)的拷貝數變異有關，但手術後心房顫動患者非常態，不多見，且為過渡性，通常會自行痊癒。再者，上述該些基因或SNP主要與在歐洲人種心房顫動的相關性，雖部分SNP有經由香港的中國人進行驗證，但無法證實有相同之在臺灣人種會有相同之表現。

在人類基因中序列變異及拷貝數變異亦會直接改變基因的表現、功能及疾病的易感性(susceptibility)。本發明進行臺灣漢族人種(Han Chinese population)進行全基因組相關性研究，利用Illumina HumanOmnil-Quad BeadChip(購自於Illumina公司)(共有1,014,075個SNPs)晶片分析CNV結果。經由多重步驟的方法，發現在人類第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因的第一個內含子(intron)有拷貝數變異，該變異顯示出對心房顫動的風險之預測是具有高度敏感性，當KCNIP1基因的第一個內含子具有核酸序列嵌入(insertion)時，和沒有此嵌入之正常人相比，心房顫動的風險較高(勝算比2.23；P=6.23×10^-24)，同時本發明結果亦以臺灣中部及南部人口進行驗證亦得到相同之結果，故本發明提供了一種能有效預測心房顫動風險的方法。

實驗方法 研究樣本

本發明由臺大醫院心房顫動紀錄的1,176位心房顫動患者及2,497位正常心律之對照個體(為臺灣漢族人種)。本發明利用三個階段的實驗設計以減少偽陽性的實驗結果，並增加實驗結果精確度。

在第一階段，先藉由篩選表現型較嚴重之樣本進行拷貝數變異的顯著相關性的研究。本發明篩選出50位具有極度嚴重性的心房顫動患者，該些患者被診斷為難治性症狀的持續性的心房顫動，即使服用至少三類的心律失常藥物，還是持續有心房顫動發作之紀錄，並且該些患者未被診斷為由其他心臟病所引起的心房顫動，即為純粹性的心房顫動(lone atrial fibrillation)；而對照組50位為具有正常竇性心律(normal sinus rhythm，NSR)的健康正常人，其與患者的年紀及性別相匹配。將上述這些樣本利用Illumina HumanOmnil-Quad BeadChip(共有1,014,075個SNPs)進行全基因組的基因拷貝數分析，獲得對偶基因的訊號強度來產生CNV結果。在第二階段，本發明額外再使用105個純粹性心房顫動患者及422個NSR健康正常人之樣本進行第一階段所發現顯著CNV區域之確認證實。在第三階段，以另外的1,021個心房顫動患者及2,025個NSR對照個體之樣本重複在第一階段及第二階段中發現的有顯著CNV的區域之確認證實，最後，有顯著CNV的區域再以臺灣中南部的275個心房顫動患者及546個NSR對照個體做進一步確認。

全基因組的拷貝數分析

利用Illumina HumanOmnil-Quad BeadChip(共有1,014,075個SNPs)進行基因型分析，以獲得對偶基因的訊號強度來產生CNV結果。為增加CNV結果的敏感性(sensitivity)，本發明使用PARTEK Genomic Suite 6.6軟體(PARTEK.Inc.,St.Louis,USA)分割演算法所產生。經由基因型分析的對偶基因訊號強度所產生的拷貝數圖形，檢測CNV的標準如下：(1)具有明顯不同平均強度的鄰近區域，在該些樣本中統計顯著p值小於0.001；(2)訊號對雜訊的比值(signal-to-noise，SNR)≧0.3；(3)SNP訊號強度平滑值(smoothing value)在低於或高於2±0.4可被認為是拷貝數增加或是拷貝數減少。

第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因的拷貝數變異

本發明進一步以傳統聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)進行由全基因組分析所找到之第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因的拷貝數變異分析，經由Illumina HumanOmnil-Quad BeadChip的結果推測出的基因片段的序列來設計引子，其中正向引子序列為5’-TGCAAATAGGCAGTGCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)，反向引子序列為5’-TAAACCGCAGTCCCCACTAC-3’(SEQ ID NO：2)。當正常情況下無核酸序列嵌入時，則沒有PCR產物；當有核酸序列嵌入時(拷貝數增加)，經由電泳檢測可觀察到PCR帶(band)。本發明使用簡單之傳統聚合酶鏈鎖反應將大量的樣本分為無嵌入(沒有PCR產物)以及有嵌入兩組(有PCR帶出現)來分析遺傳的影響。

統計分析

本發明以邏輯迴歸分析(logistic regression model)進行全基因組的CNV分析，其中年紀、性別及基因劑量(allelic dosage)的差異作為共變量(covariate)。在第一階段樣本發現的個別重要的CNV在第二及第三階段的重複分析，亦使用邏輯迴歸分析以控制年紀、性別及用以計算勝算比。使用Mantel-Haenszel法進行跨階段的同質性(homogeneity)相關性測試。

實驗結果 拷貝數變異(CNV)與心房顫動風險的相關性

在第一階段，利用Illumina HumanOmnil-Quad BeadChip(共有1,014,075個SNPs)進行全基因組的基因拷貝數分析，獲得對偶基因的訊號強度來產生CNV結果。經過嚴格的品質過濾後，以656,022個SNPs進行分析。

關於CNV的分析結果，在品質過濾後99%的樣本具有7,210個CNV結果，該些CNV結果分布在1及2,288 SNP標記之間，每個CNV區域平均有43個SNP，且平均CNV區域的片段大小約為119kb。接著定義出與心房顫動有相關性的CNV區域，在第一階段，本發明定義出幾個與心房顫動有相關性的CNV區域，所有統計顯著的CNV區域皆為小片段的CNVs(小於500kb)。

由於第一階段的樣本數較少，進一步進行第二階段以減少偽陽型的結果。第二階中樣本重複進行第一階段的顯著CNV區域以進行確認，發現在第二階段的樣本中只有含第一型鉀通道結合蛋白(Kv channel interacting protein 1，KCNIP1)基因之CNV區域具統計顯著意義，推測在第一階段所發現其他非KCNIP1基因的CNV區域是由於第一階段的樣本數較少。本發明亦發現與心房顫動相關性的區域為KCNIP1基因的第一個內含子(intron)，其係為一個短的CNV區域。另一方面，心房顫動病人和正常人相比，KCNIP1基因的第一個內含子具有核酸序列嵌入(insertion)之機率明顯較高(P=1.8×10^-15)。

最後，第三階段以另外的1,021個心房顫動患者及2,025個NSR正常心律對照之樣本，即相異於第一階段及第二階段之樣本，進一步確認該CNV區域與心房顫動的相關性，由於樣本數較大因而所獲得的結果更為顯著。和沒有此嵌入之正常人相比，KCNIP1基因的第一個內含子具有核酸序列嵌入(insertion)之個體，具有極高的心房顫動的風險(勝算比2.13，95%可信區間1.54-2.63，P=4.19×10^-22)。因此，本發明結合三個階段的實驗結果，明顯的顯示出KCNIP1基因的第一個內含子與心房顫動之間具有相關性(勝算比2.27，95%可信區間1.96-2.63，P=6.23×10^-24)。

台灣其它區域個體之個別驗證

本發明再以821個來自臺灣中部及南部的樣本(包含275個心房顫動患者及546個NSR控制組)針對第一型鉀通道結合蛋白(KCNIP1)基因的第一個內含子進行CNV分析驗證。其結果再度證實心房顫動的患者KCNIP1基因的第一個內含子具有核酸序列嵌入(insertion)之機率明顯較高，簡而言之，KCNIP1基因的第一個內含子具有核酸序列嵌入(insertion)之個體，和沒有此嵌入之正常人相比，具有極高的心房顫動的風險(勝算比2.38，95%信賴區間1.75-3.23，P=1.08×10^-8)。再者，無論在臺灣北部人口或臺灣中南部人口都沒有發現異質性(heterogeneity)(P>0.564)，KCNIP1基因的拷貝數變異和心房顫動之風險都有高度相關。

本發明技術全世界第一得知，涵蓋在基因的內含子拷貝數變異和心房顫動有相關性，這些內含子的拷貝數變異可作為基因標記，且可能影響蛋白的表現量。此外，KCNIP1基因主要與神經系統的表現有關，之前尚未有報導與心臟疾病有相關性。

因此，本發明証實在臺灣人口中KCNIP1基因的內含子拷貝數變異與心房顫動的相關性，而提供一種以KCNIP1基因的拷貝數變異預測心房顫動之風險的方法。

<110> 國立臺灣大學

<120> 檢測心房顫動之風險的方法

<130> 103B0029-I1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence：Synthetic primer

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequences

<220>

<223> Description of Artificial Sequence：Synthetic primer

<400> 2

Claims

一種檢測心房顫動之風險的方法，其步驟包括：(a)提供一核酸之樣本；以及(b)分析該樣本第一型鉀通道結合蛋白(KCNIP1)基因的第一個內含子(intron)拷貝數變異(copy number variation，CNV)；其中該拷貝數變異在(a)樣本中拷貝數大於正常樣本時，表示該個體具有心房顫動之風險。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該樣本係為基因組(genomic)DNA樣本。
如申請專利範圍第1項至第2項任一項所述之方法，其中該樣本係為來自患者的組織或體液中。
一種檢測心房顫動之風險的檢測套組，包含第一型鉀通道結合蛋白(KCNIP1)基因的第一個內含子(intron)的聚合酶鏈鎖反應引子序列，且該引子序列係為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
如申請專利範圍第4所述之檢測套組，其中該引子序列係用於檢測基因拷貝數變異(copy number variation，CNV)。
一種引子對作為檢測心房顫動之風險的用途，其中該引子對包含第一型鉀通道結合蛋白(KCNIP1)基因的第一個內含子(intron)的聚合酶鏈鎖反應引子序列，且該引子序列係用於檢測基因拷貝數變異(copy number variation，CNV)。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該引子序列係為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。