CN110128382A - 一种水黄皮籽素的制备方法和应用 - Google Patents
一种水黄皮籽素的制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110128382A CN110128382A CN201910456743.2A CN201910456743A CN110128382A CN 110128382 A CN110128382 A CN 110128382A CN 201910456743 A CN201910456743 A CN 201910456743A CN 110128382 A CN110128382 A CN 110128382A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- added
- seed element
- indian beech
- reaction
- beech seed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
- C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
- C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明属于药物化学领域,涉及一种水黄皮籽素的制备方法和应用。以1,3‑环己二酮(6)为起始原料,经成环反应得6,7‑二氢‑4(5H)‑苯并呋喃酮(7),(7)经酰化反应得5‑乙酰基‑6,7‑二氢‑4(5H)‑苯并呋喃酮(8),(8)经脱氢反应得1‑(4‑羟基‑5‑苯并呋喃基)乙酮(3),(3)经甲基化反应得1‑(4‑甲氧基‑5‑苯并呋喃基)乙酮(4),最后(4)与苯甲酰氯缩合得水黄皮籽素。本发明选用的试剂廉价易得,后处理方法简单,反应条件温和,产品收率较高,经过药理活性实验表明所合成的化合物具有抗神经损伤和抗炎活性,使得该化合物在治疗神经损伤和炎症相关疾病领域具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域,特别涉及一种水黄皮籽素的制备方法和应用。
背景技术
水黄皮籽素化学名为1-(4-甲氧基-5苯并呋喃)-3-苯基-1,3-丙二酮,属于查尔酮类化合物,从水黄皮中分离得到,具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗糖尿病的生物活性,具有较高的研究价值。其结构式为:
查尔酮类化合物是一类存在于甘草,红花等多种药用植物的天然有机化合物,在自然界分布相对有限,天然存在的查尔酮类化合物难于提取,不易得到,无法得到广泛的应用。因此人们通过大量研究,通常采用人工合成的方法得到各种查尔酮类化合物。目前为止,合成水黄皮籽素的方法较少,现有的方法存在起始原料较贵、后处理繁琐、收率较低等问题。此外,目前为止,也没有相关文献对水黄皮籽素在神经损伤相关疾病(阿尔兹海默症、帕金森病等)和炎症相关疾病(关节炎、肺炎、肝炎等)方面有报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的:合成合成水黄皮籽素的起始原料价格相对较高,产品收率相对较低,后处理繁琐的技术问题。本发明提供了一种以价格相对低廉的起始原料,经过简单的后处理操作,以较高的收率得到目标产物水黄皮籽素的制备方法。
1、制备方法
本发明水黄皮籽素的制备方法以1,3-环己二酮(6)为起始原料,经成环反应得6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(7),(7)经酰化反应得5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(8),(8)经脱氢反应得1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮(3),(3)经甲基化反应得1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮(4),最后(4)与苯甲酰氯缩合得终产品水黄皮籽素。
本发明水黄皮籽素的制备方法具体步骤如下:
(1)6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮的合成
向250mL圆底烧瓶中加入1,3-环己二酮,用水将其溶解,冰浴下加入20%氢氧化钠溶液,再加入KI,最后缓慢滴加40%的氯乙醛水溶液,加毕,室温反应,12h后经TLC检测,原料基本反应完全。加入质量分数为37.5%的浓盐酸调节至PH=4左右,加入100mL水,用石油醚萃取(100mL×4),合并有机相,用饱和食盐水洗涤(100mL×3),最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得淡黄色液体,即6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(7)。
其中,1,3-环己二酮与氢氧化钠,KI,氯乙醛的摩尔比为1:1-1.5:1-1.5:1-1.5,1,3-环己二酮与水的质量体积比为1:2-10(g/mL)。
(2)5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮的合成
向250mL圆底烧瓶中加入(7),用无水四氢呋喃将其溶解,冰浴下加入60%NaH,加毕,充氮气保护,1h后滴加乙酸乙酯,加毕,室温反应,2h后经TLC检测,原料基本反应完全。加入1mol·L-1HCl调节PH=7左右,加入100mL水,用乙酸乙酯萃取(100mL×3),合并有机相,用饱和食盐水洗涤(100mL×3),最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得黄色油状物,即5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(8)。
其中,化合物(7)与无水四氢呋喃的质量体积比为1:1-10(g/mL),化合物(7)与NaH和乙酸乙酯的摩尔比为1:1:4-10:2-6。
(3)1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮的合成
向250mL圆底烧瓶中加入(8),用1,4-二氧六环将其溶解,加入DDQ,加热至101℃回流反应,2h后经TLC检测,原料基本反应完全。用硅藻土抽滤,加入100mL水,用二氯甲烷萃取(100mL×3),合并有机相,用亚硫酸钠水溶液洗涤(100mL×3),最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得黄色固体,黄色固体经(己烷/乙酸乙酯)重结晶得到淡黄色固体,即1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮(3)。
其中,化合物(8)与DDQ的摩尔比为1:1-1.5,化合物(8)与1,4-二氧六环的质量体积比为1:5-25(g/mL)。
(4)1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮的合成
向100mL圆底烧瓶中加入(3),用丙酮将其溶解,加入K2CO3,逐滴加入碘甲烷搅拌下回流反应1h(TLC跟踪)。减压蒸掉一半的反应液,加入水,析出白色固体,过滤,用水洗(100mL×3),真空干燥,得白色固体,即1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮(4)。
其中,化合物(3)与丙酮的质量体积比为1:5-10(g/mL),化合物(3)与K2CO3、碘甲烷的摩尔比为1:1-1.5:1-1.5。
(5)水黄皮籽素的合成
向50mL圆底烧瓶中加入(4),N2保护下,用无水四氢呋喃将其溶解,置于-78℃低温中,加入双(三甲基硅基)氨基锂,低温反应1h后,苯甲酰氯溶于5mL无水四氢呋喃,用干燥注射器逐滴加入到反应瓶中,加毕,室温反应1h(TLC跟踪)。加入1mol·L-1HCl 7mL淬灭反应,再加入水50mL,置冰浴中,慢慢析出淡黄色固体,过滤,用水洗(3×50mL),真空干燥,得淡黄色固体,即产物水黄皮籽素。
其中,化合物(4)与无水四氢呋喃的质量体积比为1:1-10(g/mL),化合物(4)与双(三甲基硅基)氨基锂、苯甲酰氯的摩尔比为1:1-2:1-1.5。
2、应用
本发明方法合成的水黄皮籽素用于治疗神经损伤相关疾病和炎症相关疾病。
2.1生物活性测试
1、抗神经损伤
H2O2是一种活性氧,是一种膜易透性氧化剂,在体内可转变成细胞毒性极强的OH,在许多细胞培养模型中都可以引起细胞氧化应激损伤。在AD的发展过程中存在着多种病理因素,氧化应激作为其中一个重要的参与者,与Aβ、Tau蛋白、炎症反应等其他因素相互影响,共同推进AD的病理进程。因此,本研究以H2O2损伤PC12细胞为氧化应激损伤神经元的体外实验模型,旨在体外更好地模拟阿尔茨海默病的病理过程。
2、实验步骤
(1)细胞处理
当细胞传代时,用胰酶消化细胞,收集并离心后,加入培养液轻轻反复吹打,使细胞均匀地重悬于培养基中,使用台盼蓝染色细胞并计数,按8×104/mL的密度均匀接种于96孔板中,每孔细胞液80μL。将96孔板放置于CO2培养箱中,孵育过夜,次日细胞即可贴壁。
(2)加药
根据实验要求用培养基配制不同浓度的药物,每孔加入10μL,每组设3个复孔。然后将96孔板置于培养箱中,继续培养。
(3)细胞增殖活力检测
给药培养24h后,于96孔板中每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL),放入培养箱中继续孵育。4h后小心吸弃孔中液体,每孔加入100μL DMSO使甲瓒晶体完全溶解。轻轻振荡,使96孔板中液体混合均匀,置于酶标仪中,检测570nm和630nm处的吸光度值。
2.2抗炎
1、MTT检测细胞活力
(1)细胞处理
当细胞传代时,用胰酶消化细胞,收集并离心后,加入培养液轻轻反复吹打,使细胞均匀地重悬于培养基中,使用台盼蓝染色细胞并计数,按4×104/mL的密度均匀接种于96孔板中,每孔细胞液90μL。将96孔板放置于CO2培养箱中,孵育过夜,次日细胞即可贴壁。
(2)加药
根据实验要求用培养基配制不同浓度的药物,每孔加入10μL,每组设3个复孔。然后将96孔板置于培养箱中,继续培养。
(3)细胞增殖活力检测
给药培养24h后,于96孔板中每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL),放入培养箱中继续孵育。4h后小心吸弃孔中液体,每孔加入100μL DMSO使甲瓒晶体完全溶解。轻轻振荡,使96孔板中液体混合均匀,置于酶标仪中,检测570nm和630nm处的吸光度值。
2、Griess试剂法检测亚硝酸盐浓度
(1)细胞处理
将待处理的RAW264.7细胞拿到显微镜下观察,待培养皿内的细胞长到将近布满皿底时,将其传代。首先,先将培养皿内上层培养基吸弃,用移液器吸取3mL的PBS加入培养皿内洗涤细胞2次后,再于皿内加入500μL胰酶对细胞进行消化,等细胞完全消化下来后,继续向皿内加入3mL新鲜培养基轻轻吹打细胞,以使细胞均匀分散,然后把细胞悬液转移至15mL离心管中,于离心机中离心收集细胞后,往离心管里加入新鲜培养基,用移液器将细胞轻轻吹打均匀,然后于显微镜下进行细胞计数,在96孔板中每孔均匀加入180μL细胞悬液,细胞密度为3×104个/孔。
(2)加药
待96孔板内的细胞贴壁后,进行加药处理。首先,用新鲜培养基对水黄皮籽素和LPS的原倍储备液进行梯度稀释。根据实验要求,配制不同浓度的水黄皮籽素(1、10、20、40、60、80、100μM)和(250ng/mL)的LPS。然后,将10μL不同浓度的水黄皮籽素和LPS(250ng/mL)加入96孔板的相应孔中,每个浓度设置2个复孔。
(3)亚硝酸盐浓度检测
RAW264.7细胞被药物处理细胞24h后,通过Griess Kit测定细胞上清液中亚硝酸盐的浓度。首先,取出一块新的96孔板,将50μL细胞上清液加入新的96孔板的对应孔中。随后按25μL/孔,在各孔依次加入GriessⅠ和GriessⅡ试剂后,用锡箔纸将96孔板包住,立马将96孔板置于酶标仪中,设置在540nm处检测各个孔的吸光度值,然后根据标准曲线计算培养上清液中的NO浓度。
3、ELISA检测炎症因子PGE2和TNF-α
(1)细胞处理
将待处理的RAW264.7细胞拿到显微镜下观察,待培养皿内的细胞长到将近布满皿底时,将其传代。首先,先将培养皿内上层培养基吸弃,用移液器吸取3mL的PBS加入培养皿内洗涤细胞2次后,再于皿内加入500μL胰酶对细胞进行消化,等细胞完全消化下来后,继续向皿内加入3mL新鲜培养基轻轻吹打细胞,以使细胞均匀分散,然后把细胞悬液转移至15mL的干净的离心管中,于离心机中离心收集细胞后,往离心管里加入新鲜培养基,用移液器将细胞轻轻吹打均匀,然后于显微镜下进行细胞计数,在96孔板中每孔均匀加入180μL细胞悬液,细胞密度为3×104个/孔。
(2)加药
待96孔板内的细胞贴壁后,就可以对其进行加药处理了。首先,用新鲜培养基对水黄皮籽素和LPS的原倍储备液进行梯度稀释。根据实验要求,配制不同浓度的水黄皮籽素(20、40、60μM)和(250ng/mL)的LPS。然后,将10μL不同浓度的水黄皮籽素和LPS(250ng/mL)加入96孔板的相应孔中,每个浓度设置2个复孔。
(3)炎症因子PGE2和TNF-α含量检测
RAW264.7细胞被药物处理细胞24h后,吸取细胞上清液,用ELISA Kit测定上清液中PGE2和TNF-α浓度。首先,将ELISA试剂盒从冰箱内取出后,放在室温条件下平衡20min,然后将浓缩洗涤液用双蒸水或者去离子水稀释30倍;根据说明书指示用标准品稀释液配制不同浓度的标准品。将50μL标准品或者样品加入到对应的板条孔中,做好标记,用封板胶纸将反应孔封住,室温反应2h;反应过后,将板条里的液体甩掉,加入事先配制好的洗涤液对板条进行清5次,最后将板条倒扣在吸水纸上轻轻将孔内的水分拍干;拍干后,然后向每孔加入50μL酶标试剂,空白孔内不加,继续用封板膜将板条封上后,将板条置于37℃条件下温育30min。反应过后,将反应液吸弃掉,继续用事先配制好的洗涤液洗板5次,然后用吸水纸吸干,尽量吸干净水分,然后再向每孔内加入50μL HRP工作液,在室温下避光孵育20min。反应过后,吸弃反应液,继续用事先配制好的洗涤液洗板5次,最后一次把板倒扣在吸水纸上用手轻轻拍干,每孔加入50μL TMB,避光孵育20min,然后每孔直接加入50μL中止液,中止反应,最后将板条置于酶标仪中检测450nm波长处各孔的吸光度(OD值)。特别值得注意的是,以空白孔调零,测定应在加终止液后15min以内进行。根据标准曲线计算各个实验组的PGE2和TNF-α的浓度。
4、qRT-PCR检测mRNA的表达
(1)细胞处理
将待处理的RAW264.7细胞拿到显微镜下观察,待培养皿内的细胞长到将近布满皿底时,将其传代。首先,先将培养皿内上层培养基吸弃,用移液器吸取3mL的PBS加入培养皿内洗涤细胞2次后,再于皿内加入500μL胰酶对细胞进行消化,等细胞完全消化下来后,继续向皿内加入3mL新鲜培养基轻轻吹打细胞,以使细胞均匀分散,然后把细胞悬液转移至15mL的干净的离心管中,于离心机中离心收集细胞后,往离心管里加入新鲜培养基,用移液器将细胞轻轻吹打均匀,然后于显微镜下进行细胞计数,将密度为4×105个/孔的细胞均匀接种在24孔板中,每孔加入1mL细胞悬液,轻轻摇晃24孔板以使细胞均匀分布于板底。
(2)加药
待24孔板内的细胞贴壁后,就可以对其进行加药处理了。首先,用新鲜培养基对水黄皮籽素和LPS的原倍储备液进行梯度稀释。根据实验要求,配制不同浓度的水黄皮籽素(20、40、60μM)和(250ng/mL)的LPS。然后,将100μL不同浓度的水黄皮籽素和LPS(250ng/mL)加入24孔板的相应孔中,每个浓度设置2个复孔。
(3)总RNA提取
RAW264.7细胞被水黄皮籽素和LPS共同处理处理4h后,将24孔板从培养箱中取出,用吸泵将孔内上层培养基吸弃,然后往各孔内加入1mL冷的PBS洗细胞2次后,吸弃PBS,将500μL Trizol轻轻加入各个板孔内,上下左右摇晃24孔板,使裂解液均匀分布于皿底,然后室温静置反应,并且每隔5min吹打依次细胞,大约反应30min后,准备与实验孔相对应数量的灭好菌的1.5mL离心管,将24孔板各孔内的细胞用移液器收集到离心管,盖好离心管的盖子,在室温下静置10min。静置完成后,于每管内加入200μL氯仿,用振荡器剧烈震荡30s,然后继续室温条件下静静放置10min。等离心管内液体分层后,将离心管对称的放在低温高速离心机中,离心15min,然后将上层水相(大约500μL)收集到提前放在冰上预冷的新的离心管中,然后再往新的离心管中加入和上层水相相同体积的异丙醇,用手上下颠倒摇晃二十下,使水相和异丙醇混匀,然后室温条件下静静放置10min,继续将离心管对称的放在低温高速离心机中,离心10min后,用吸泵将离心管中上层液体吸弃掉,这时就可以看到在离心管的管底部和侧壁出现胶状沉淀,然后向各管内加入事先配制好的75%的乙醇,上下摇晃对沉淀进行清洗2次,用吸泵吸弃离心管中上层乙醇,把沉淀在室温条件下干燥15min后,往离心管中加入40μL DDW将沉淀溶解,从中取出6μL于另一新的EP管中然后再加入114μLDDW,用移液枪轻轻吹打混匀,吸取60μL于比色皿中,用分光光度计测量260nm和280nm处吸收强度对mRNA进行定量。定量完后,将mRNA接着逆转录合成cDNA。
(4)RNA逆转录得到cDNA
准备灭菌的200μL的离心管,将提取的RNA取出1μg作为转录的模板,往离心管中加入2μL 4×g DNA wiper Mix及RNasefree ddH2O至总体积为8μL。用移液枪轻轻吹打混匀。将此反应体系置于42℃水浴箱中温育2min,然后再加入2μL 5×HiscriptⅡqRT Super MixⅡ,用移液器轻轻吹打混匀。混匀后,将该反应体系按照标准程:25℃反应10min,50℃反应30min,85℃反应5min进行逆转录反应。反应结束后,将得到的cDNA保存于-20℃以备用。
(5)qRT-PCR
在每孔中依次加入0.2μL Forward Primer(10μM),0.2μL Reverse Primer(10μM),5μL 2×Transtart Top Green qPCR Super Mix,1μL cDNA模板,最后加入3.6μLddH2O。试剂加好之后,用封口膜把孔板封紧,然后将孔板放在PCR仪上进行扩增循环:94℃30sec、94℃5sec、50-60℃15sec、72℃10sec,共进行了40个循环,4℃反应15min,循环结束。
有益效果:
(1)本发明合成路线以廉价易得的1,3-环己二酮为起始原料,经过一步反应合成了6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮,反应条件温和,收率相对较高,更重要的是使用本发明的合成方法,可以实现水黄皮籽素的稳定放大,可以实现工业化生产。
(2)、通过重结晶或者加水有固体析出等后处理替代了相对繁琐的柱层析。
(3)经过药理活性实验表明本发明所合成的化合物具有抗神经损伤和抗炎活性,使得该化合物在治疗神经损伤相关疾病和炎症相关疾病具有较好的应用前景。
附图说明
图1为Pongamol在24h时对PC12细胞存活率的影响柱状图;
图2为H2O2在24h时对PC12细胞存活率的影响柱状图;
图3为Pongamol对24h时对H2O2诱导的PC12细胞存活率的影响柱状图;
图4为不同浓度的水黄皮籽素对RAW264.7细胞的毒性检测柱状图;
图5为不同浓度的LPS对RAW264.7细胞的毒性检测柱状图;
图6为LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7产生NO的浓度筛选柱状图;
图7为水黄皮籽素对LPS诱导的NO产生的影响柱状图;
图8为水黄皮籽素对LPS诱导的PGE2的影响柱状图;
图9为水黄皮籽素对LPS诱导的TNF-α的影响柱状图;
图10为水黄皮籽素对炎症因子IL-1β基因表达的影响柱状图。
图11为水黄皮籽素对炎症因子IL-6基因表达的影响柱状图。
图12为水黄皮籽素对炎症因子TNF-α基因表达的影响柱状图。
图13为水黄皮籽素对炎症因子COX-2基因表达的影响柱状图。
图14为水黄皮籽素对炎症因子iNOS基因表达的影响柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮的合成
向250mL圆底烧瓶中加入1,3-环己二酮(10.0g,89.18mmol),用60mL水溶解,冰浴下加入20%氢氧化钠溶液35mL,再加入KI(2.9g,17.4mmol),最后缓慢滴加40%的氯乙醛水溶液16mL,加毕,室温反应,12h后经TLC检测,原料基本反应完全。加入质量分数为37.5%浓盐酸调节至PH=4左右,加入100mL水,用石油醚萃取(100mL×4),合并有机相,用饱和食盐水洗涤(100mL×3),最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得淡黄色液体7即6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮10.0g,收率82%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.32(d,J=2.0Hz,1H),6.67(d,J=2.0Hz,1H),2.90(m,2H),2.52(m,2H),2.21(m,2H).
(2)5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮的合成
向250mL圆底烧瓶中加入7(7.0g,51.45mmol),用30mL无水四氢呋喃溶解,冰浴下加入60%NaH(8.23g,205.8mmol),加毕,充氮气保护,1h后滴加乙酸乙酯,加毕,室温反应,2h后经TLC检测,原料基本反应完全。加入1mol·L-1HCl调PH=7左右,加入100mL水,用乙酸乙酯萃取(100mL×3),合并有机相,用饱和食盐水洗涤(100mL×3),最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得黄色油状物8即5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮9.0g,收率98%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.34(d,J=2.0Hz,1H),6.67(d,J=2.0Hz,1H),3.61(t,J=4.0Hz,1H),3.19(m,1H),2.91(m,1H),2.60(m,1H),2.31(s,3H),2.28(m,1H).
(3)1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮的合成
向250mL圆底烧瓶中加入8(9.0g,50.54mmol),用50mL 1,4-二氧六环溶解,加入DDQ(13.7g,60.65mmol),加热101℃回流反应,2h后经TLC检测,原料基本反应完全。用硅藻土抽滤,加入100mL水,用二氯甲烷萃取(100mL×3),合并有机相,用亚硫酸钠水溶液洗涤(100mL×3),最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得黄色固体,黄色固体经(己烷/乙酸乙酯)重结晶得到淡黄色固体3即1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮8g,收率90%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:13.22(s,1H),7.59(d,J=9.0Hz,1H),7.50(d,J=3.0Hz,1H),6.98(d,J=9.0Hz,1H),6.93(d,J=3.0Hz,1H),2.59(s,3H).
(4)1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮的合成
向100mL圆底烧瓶中加入3(6g,34.06mmol),用50mL丙酮溶解,加入K2CO3(7.06g,51.08mmol),逐滴加入碘甲烷(5.8g,40.86mmol)搅拌下回流反应1h(TLC跟踪)。反应液减压蒸掉一半,加入水100mL,析出白色固体,过滤,用水洗(100mL×3),真空干燥,得白色固体4即1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮6.2g,收率95.7%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.68(d,J=6.0Hz,1H),7.55(d,J=3.0Hz,1H),7.17(d,J=9.0Hz,1H),6.94(d,J=3.0Hz,1H),4.11(s,3H),2.60(s,3H).
(5)水黄皮籽素的合成
向50mL圆底烧瓶中加入4(1g,5.26mmol),N2保护下,用10mL无水四氢呋喃溶解,置于-78℃低温中,加入双(三甲基硅基)氨基锂7.5mL(7.5mmol),低温反应1h后,苯甲酰氯(0.96g,6.83mmol)溶于5mL无水四氢呋喃,用干燥注射器逐滴加入到反应瓶中,加毕,室温反应1h(TLC跟踪)。加入1mol·L-1HCl 7mL淬灭反应,再加入水50mL,置冰浴中,慢慢析出淡黄色固体,过滤,用水洗(3×50mL),真空干燥,得淡黄色固体1.2g,收率80%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.89(m,2H),7.82(d,J=9.0Hz,1H),7.56(d,J=2.0Hz,1H),7.23(m,3H),7.24(d,J=9.0Hz,1H),7.10(s,1H),6.91(d,J=2.0Hz,1H),4.07(s,3H),ESI-MS m/z:295.097{[M+H]+}.
抗神经损伤实验结果
(1)MTT法检测水黄皮籽素细胞毒性
分别用不同浓度的水黄皮籽素处理PC12细胞24h。实验结果见图1,由图1可以看出1-100μM浓度范围的水黄皮籽素处理组细胞和对照组相比,细胞活性相差不大。因此,水黄皮籽素单独作用于PC12细胞时,对细胞无毒。
(2)MTT法检测H2O2细胞毒性
分别用不同浓度的H2O2处理PC12细胞24h,细胞存活率见图2,由图2可以看出,随着H2O2浓度的逐渐增大,PC12细胞的存活率逐渐降低,300μM的H2O2处理后和对照组相比PC12细胞存活率约为62.3%,损伤程度适中,而150μM、200μM、250μM浓度的H2O2处理损伤不大,350μM、400μM浓度的H2O2处理损伤过重,因此后续实验中选用300μM浓度的H2O2进行实验。
(3)MTT法检测水黄皮籽素对H2O2诱导的PC12细胞神经损伤的保护作用
在本实验处理中将不同梯度浓度的水黄皮籽素加入PC12细胞培养基中,预处理4h后,再加入300μM H2O2,以检测水黄皮籽素对H2O2诱导的PC12细胞神经损伤的保护作用。如图3实验结果显示,加入H2O2的细胞存活率为62.3%,相比于正常对照组降低了37.7%,而加入不同浓度的水黄皮籽素后,细胞存活率有所增加,说明水黄皮籽素对H2O2诱导的PC12细胞活性的下降具有一定的保护作用。
抗炎实验结果
(1)MTT法检测细胞毒性
分别用不同浓度的水黄皮籽素(1、10、20、40、60、80、100μM)和不同浓度的LPS(100、250、500、750、1000ng/mL)作用于小鼠巨噬细胞细胞RAW264.7 24h,通过MTT对细胞的存活率进行检测。由图4和图5可以发现,在100-1000ng/mL浓度范围内,LPS并没有影响小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率;此外,在1-100μM浓度范围内,水黄皮籽素对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的增殖也没有表现出抑制作用。这些结果说明在1-100μM浓度范围内水黄皮籽素对小鼠巨噬细胞RAW264.7几乎没有产生毒性,并且在100-1000ng/mL浓度范围内的LPS对小鼠巨噬细胞RAW264.7也没有毒性。
(2)LPS刺激巨噬细胞建立炎症模型的浓度筛选
一氧化氮(NO)是通常不表达的信使气体分子。只有当身体被刺激产生炎症时,它才会大量产生,导致与炎症相关的免疫疾病。为了建立理想的炎症模型,我们用不同浓度的LPS(100、250、500、750、1000ng/mL)处理细胞24h后,收集细胞培养上清液,Griess试剂检测NO含量。由图6可看出,随着LPS给药浓度增加,细胞释放的NO的量也越来越多,且LPS浓度为250ng/mL时,就可以刺激成比较理想的细胞炎症模型状态,因此我们选择浓度为250ng/mL的LPS用于细胞炎症模型的建立。
(3)水黄皮籽素的抗炎活性浓度筛选
已证实一氧化氮(NO)是判定炎症程度的有效分子,为了初步探究水黄皮籽素的抗炎活性,我们用不同浓度的水黄皮籽素(1、10、20、40、60、80、100μM)与LPS(250ng/mL)共同处理小鼠巨噬细胞RAW264.7 24h后,使用Griess试剂检测其上清液中NO的含量。从图7可以看出,与空白对照组相比,LPS处理引起NO释放的显着增加,经过水黄皮籽素的处理后,RAW264.7细胞中LPS诱导的NO释放的增加被显著抑制。同时,我们可以得到水黄皮籽素对NO的半数抑制浓度为39.7μM。因此我们选20,40和60μM的三个浓度的水黄皮籽素用于后续实验研究。
(4)ELISA检测水黄皮籽素对PGE2和TNF-α表达的影响
PGE2和TNF-α是两种重要的炎性细胞因子,参与介导炎症反应。为了检测水黄皮籽素是否对炎症因子PGE2和TNF-α的表达有影响,我们用ELISA试剂盒检测了经水黄皮籽素和LPS共同处理24h的小鼠巨噬细胞RAW264.7培养上清液中PGE2和TNF-α的含量。如图8和图9所示,小鼠巨噬细胞RAW264.7经单独的LPS处理后可以显著诱导PGE2和TNF-α的释放。然而,水黄皮籽素加入后可以显著抑制LPS诱导PGE2和TNF-α的释放,并且水黄皮籽素浓度越高,抑制程度越大。水黄皮籽素对PGE2和TNF-α两种炎症因子的抑制均呈现出一定的剂量依赖性。
(5)qRT-PCR检测水黄皮籽素对多种炎症因子mRNA表达的影响
为了验证水黄皮籽素对炎症因子的调控是否基于基因表达的水平,我们进一步用qRT-PCR检测了多种炎症因子的表达情况。如图10-14所示,用不同浓度的水黄皮籽素(20,40,60μM)处理6h后,RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α以及COX-2和iNOS的mRNA表达量均被显著抑制,并且抑制程度呈现一定的剂量依赖性。说明水黄皮籽素可以通过在基因转录水平抑制多种炎症因子的表达来发挥抗炎活性。
Claims (8)
1.一种水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:所述方法以1,3-环己二酮(6)为起始原料,经成环反应得6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(7),(7)经酰化反应得5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(8),(8)经脱氢反应得1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮(3),(3)经甲基化反应得1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮(4),最后(4)与苯甲酰氯缩合得终产品水黄皮籽素。
2.如权利要求1所述的水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:所述方法具体步骤如下:
(1)6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮的合成
向圆底烧瓶中加入1,3-环己二酮,并用水溶解,冰浴下加入20%氢氧化钾溶液,再加入KI,最后缓慢滴加40%的氯乙醛水溶液,室温反应12h后,加入浓盐酸调节PH,加入水,用石油醚萃取,合并有机相,用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得淡黄色液体6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(7);
(2)5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮的合成
向圆底烧瓶中加入(7),用无水四氢呋喃溶解,冰浴下加入60%NaH,加毕,充氮气保护,1h后滴加乙酸乙酯,室温反应2h后,加入1mol·L-1 HCl调节PH,加入水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,用饱和食盐水洗涤,最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得黄色油状物5-乙酰基-6,7-二氢-4(5H)-苯并呋喃酮(8);
(3)1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮的合成
向圆底烧瓶中加入(8),用1,4-二氧六环溶解,加入DDQ,加热至101℃回流反应2h后,用硅藻土抽滤,加入水,用二氯甲烷萃取,合并有机相,用亚硫酸钠水溶液洗涤,最后用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂得黄色固体,黄色固体经重结晶得到淡黄色固体1-(4-羟基-5-苯并呋喃基)乙酮(3);
(4)甲基化反应得1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮的合成
向圆底烧瓶中加入(3),用丙酮溶解,加入K2CO3,逐滴加入碘甲烷搅拌下回流反应1h,减压蒸掉一半反应液,加入水,析出白色固体,过滤,用水洗,真空干燥,得白色固体1-(4-甲氧基-5-苯并呋喃基)乙酮(4);
(5)水黄皮籽素的合成
向圆底烧瓶中加入(4),N2保护下,用无水四氢呋喃溶解,置于-78℃低温中,加入双(三甲基硅基)氨基锂,低温反应1h后,将苯甲酰氯溶于5mL无水四氢呋喃,用干燥注射器逐滴加入到反应瓶中室温反应1h,加入1mol·L-1HCl淬灭反应,再加入水,置于冰浴中,慢慢析出淡黄色固体,过滤,用水洗,真空干燥,得淡黄色固体,即产物水黄皮籽素。
3.如权利要求1所述的水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述1,3-环己二酮与氢氧化钾、KI、氯乙醛的摩尔比为1:1-1.5:1-1.5:1-1.5。
4.如权利要求1所述的水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述化合物(7)与NaH、乙酸乙酯的摩尔比为:1:4-10:2-6。
5.如权利要求1所述的水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:步骤(3)所述化合物(8)与DDQ的摩尔比为1:1-1.5。
6.如权利要求1所述的水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:步骤(4)所述化合物(3)与K2CO3、碘甲烷的摩尔比为1:1-1.5:1-1.5。
7.如权利要求1所述的水黄皮籽素的制备方法,其特征在于:步骤(5)所述化合物(4)与双(三甲基硅基)氨基锂、苯甲酰氯的摩尔比为1:1-2:1-1.5。
8.一种如权利要求1所述方法制备的水黄皮籽素的应用,其特征在于:所述的水黄皮籽素用于治疗神经损伤相关疾病和炎症相关疾病。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910456743.2A CN110128382B (zh) | 2019-05-29 | 2019-05-29 | 一种水黄皮籽素的制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910456743.2A CN110128382B (zh) | 2019-05-29 | 2019-05-29 | 一种水黄皮籽素的制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110128382A true CN110128382A (zh) | 2019-08-16 |
CN110128382B CN110128382B (zh) | 2022-11-01 |
Family
ID=67582675
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910456743.2A Active CN110128382B (zh) | 2019-05-29 | 2019-05-29 | 一种水黄皮籽素的制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110128382B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114507201A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-05-17 | 常州大学 | 一种水黄皮籽素衍生物及其制备方法和应用 |
CN115677637A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-02-03 | 萍乡学院 | 一种1-溴二苯并呋喃的简易制备方法 |
CN115850219A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-28 | 三峡大学 | 泽兰素开链多聚体,制备方法及用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102397269A (zh) * | 2011-09-20 | 2012-04-04 | 温州医学院 | 查尔酮类化合物在制备抗炎药物中的应用 |
CN103382195A (zh) * | 2012-05-04 | 2013-11-06 | 四川大学 | 苯并吡喃查尔酮类化合物及其制备方法和用途 |
-
2019
- 2019-05-29 CN CN201910456743.2A patent/CN110128382B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102397269A (zh) * | 2011-09-20 | 2012-04-04 | 温州医学院 | 查尔酮类化合物在制备抗炎药物中的应用 |
CN103382195A (zh) * | 2012-05-04 | 2013-11-06 | 四川大学 | 苯并吡喃查尔酮类化合物及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
LEE, YONG ROK等: "A new route for the synthesis of furanoflavone and furanochalcone natural products", 《TETRAHEDRON》, 31 December 1995 (1995-12-31), pages 4909 - 22 * |
PREM P. YADAV等: "Synthesis of 4-hydroxy-1-methylindole and benzo[b]thiophen-4-ol based unnatural flavonoids as new class of antimicrobial agents", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》, 21 January 2005 (2005-01-21), pages 1497 - 1505 * |
VIKRAM JOSHI等: "Celastrol modulates inflammation through inhibition of the catalytic activity of mediators of arachidonic acid pathway: Secretory phospholipase A2 group IIA, 5-lipoxygenase and cyclooxygenase-2", 《PHARMACOLOGICAL RESEARCH》, 3 September 2016 (2016-09-03), pages 1 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114507201A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-05-17 | 常州大学 | 一种水黄皮籽素衍生物及其制备方法和应用 |
CN114507201B (zh) * | 2022-01-20 | 2023-06-27 | 常州大学 | 一种水黄皮籽素衍生物及其制备方法和应用 |
CN115677637A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-02-03 | 萍乡学院 | 一种1-溴二苯并呋喃的简易制备方法 |
CN115677637B (zh) * | 2022-09-27 | 2024-02-23 | 安徽秀朗新材料科技有限公司 | 一种1-溴二苯并呋喃的简易制备方法 |
CN115850219A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-28 | 三峡大学 | 泽兰素开链多聚体,制备方法及用途 |
CN115850219B (zh) * | 2022-11-30 | 2024-05-28 | 三峡大学 | 泽兰素开链多聚体,制备方法及用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110128382B (zh) | 2022-11-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110128382A (zh) | 一种水黄皮籽素的制备方法和应用 | |
CN112592350B (zh) | 聚酮类化合物lithocarpin E-G及其制备方法和应用 | |
CN114133390B (zh) | 一种去氢骆驼蓬碱衍生物及其制备方法和应用 | |
CN108484632A (zh) | 青蒿素-苯胺基喹唑啉类衍生物及其制备方法和应用 | |
CN109608419B (zh) | 从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和应用 | |
CN104945361B (zh) | 吉玛烷型倍半萜衍生物及其制备方法与应用 | |
CN106046105A (zh) | 一种甘草次酸、阿魏酸和硒代蛋氨酸三元化合物的制备方法及应用 | |
CN113968893A (zh) | 一种具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用 | |
CN107602658B (zh) | 一种三氮唑修饰的乌索酸衍生物及其制备方法和应用 | |
CN106045896B (zh) | 靛红酰肼类衍生物及其制备方法 | |
CN110330490A (zh) | 一种具有抗肿瘤活性的达沙替尼类似物及其制备方法 | |
CN108117542A (zh) | 丙酰氨基甲氧苯基苯并[d]氮杂*基喹唑啉类化合物及制备和应用 | |
CN114591269B (zh) | 一种Eremophilane型倍半萜及其在制备具有抗炎活性的药物中的应用 | |
CN116621812B (zh) | 四氢吲唑化合物、制备方法及其在治疗食管鳞癌中的应用 | |
CN108329299A (zh) | 丁酰氨基氯代苯并[d]氮杂*基喹唑啉类化合物及制备和应用 | |
CN114213497B (zh) | 筋骨草中甾体类化合物及其提取方法和用途 | |
CN111892539B (zh) | 异长叶烯酮基己内酰胺衍生物及其制备方法和应用 | |
CN116332765B (zh) | 一种烷酸酯化合物及其制备方法与应用 | |
CN106117236A (zh) | 不饱和去甲斑蝥素苄酯钡盐及其抗肿瘤应用 | |
CN114437161B (zh) | 一种齐多夫定拼接4-苯胺喹唑啉类化合物及其制备方法与应用 | |
CN103006670A (zh) | 一种总不饱和蟾蜍内酯及其制备方法和用途 | |
CN113004368B (zh) | 熊果酸嘧啶酰胺类衍生物及其制备方法和应用 | |
CN110003291B (zh) | 一种氟代糖基修饰的紫杉醇类化合物及其合成方法和应用 | |
CN110183320B (zh) | 一类多烯二酮类抗肿瘤化合物 | |
CN113368090B (zh) | 3,4-裂环环阿屯烷型四环三萜化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |