CN110090469A

CN110090469A - 一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法

Info

Publication number: CN110090469A
Application number: CN201910341368.7A
Authority: CN
Inventors: 吕海涛; 王浩; 单虎
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2019-08-06

Abstract

本发明公开了一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，包括如下步骤：称取过35目筛的甘草粉末，依次加入无水乙醇、浓盐酸和蒸馏水，液体中无水乙醇的体积分数为70%，浓盐酸的浓度为0.5~2.5mol/l，料液比为1:10~1:30；回流1~3h，提取1~3次，冷却后抽滤，滤液用甲醇定容，然后利用液相色谱对定容后的滤液进行定量分析，再利用逆流色谱进行纯化，得的高纯度甘草素和甘草次酸。本发明利用盐酸同时水解甘草酸和甘草苷分别得到甘草次酸和甘草素，通过大量的实验得到了的甘草中同时提取纯化甘草素和甘草次酸的最佳工艺路线，水解率超过97.5%，提取量大大提高；利用逆流色谱技术进行纯化，甘草素和甘草次酸纯度均达到96%以上，制备量远超其他色谱方法。

Description

一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法

技术领域

本发明属于中草药有效活性成分提取技术领域，尤其涉及一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法。

背景技术

甘草（学名：Glycyrrhiza uralensis Fisch）别名：国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子，多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带。甘草性味甘平，可补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止疼、调和诸药，有十药九草的说法，作为中草药或一些中成药的成份之一，历史久远、用途广泛。

甘草中的有效成分主要有：三萜类、多糖类、黄酮类等，药理研究主要集中在皂苷类化合物、甘草黄酮与其他酚类化合物。其中，皂苷类化合物以甘草酸和甘草次酸为主，甘草黄酮与其他酚类化合物以甘草素、光甘草定、甘草查耳酮等为主。研究表明甘草提取物，如三萜皂苷、甘草多糖和甘草黄酮等，具有抗肿瘤、抗突变、降血脂、增强免疫调节的作用。目前关于甘草中有效活性成分提取的研究已有文献报道，传统的提取方法主要有浸提法、索氏法、回流法、微波法、超声波法等。其中，回流加热法具有提取条件简捷，操作安全，提取效率高的优势而应用较广，对于甘草中有效活性成分甘草素和甘草次酸的提取，采用现有的回流加热法提取时，提取量较少，且纯化后纯度较低。

发明内容

针对上述背景技术中现有技术存在的不足，本发明提供了一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，该方法通过酸解甘草酸可以大幅度提高甘草素和甘草次酸的提取量，再利用逆流色谱技术可以得到高纯度的甘草素和甘草次酸。

为实现上述目标，本法发明所采用的技术方案为：

一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，包括如下步骤：

称取过35目筛的甘草粉末，依次加入无水乙醇、浓盐酸和蒸馏水，所述无水乙醇、浓盐酸和蒸馏水中无水乙醇的体积分数为70%，所述无水乙醇、浓盐酸和蒸馏水中浓盐酸的浓度为0.5 ~ 2.5mol/l，所述甘草粉末与入无水乙醇、浓盐酸、蒸馏水之和形成的料液比为1:10~1:30；然后进行回流，回流时间为1 ~ 3h，再提取1~3次，冷却后抽滤，滤液用甲醇定容，然后利用液相色谱对定容后的滤液进行定量分析，再利用逆流色谱进行纯化，得的高纯度甘草素和甘草次酸。

优选地，所述无水乙醇、浓盐酸和蒸馏水中浓盐酸的浓度为1.5mol/l。

优选地，所述甘草粉末与入无水乙醇、浓盐酸、蒸馏水之和形成的料液比为1:25。

优选地，所述回流时间为2h。

优选地，提取1次。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

（1）获得利用盐酸同时水解甘草酸为甘草次酸，水解甘草苷为甘草素的最佳工艺路线，水解率超过97.5%，大大提高甘草次酸和甘草素的提取量。

（2）利用逆流色谱技术进行纯化，甘草素和甘草次酸纯度均达到96%以上，制备量远超其他色谱方法。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸混合标准溶液的高效液相色谱图。

图2是本发明实施例2提供的不同盐酸浓度下甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸提取浓度的结果图。

图3是本发明实施例3提供的不同料液比下甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸取浓度的结果图。

图4是本发明实施例4提供的不同回流时间下甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸取浓度的结果图。

图5是本发明实施例5提供的不同提取次数下甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸取浓度的结果图。

图6是本发明对照例提供的甘草样品分离的高效液相色谱图的结构示意图。

图7是本发明实施例7提供的样品中甘草素和甘草次酸分离高速逆流色谱图。

图8是本发明实施例8提供的纯化所得甘草素和甘草次酸红外光谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

称取甘草苷，甘草素，甘草酸和甘草次酸的标准品，配制混合标准溶液。确定高效液相色谱法最佳分离条件：流动相（A：甲醇和B：0.1%磷酸水溶液），梯度为0 ~ 7 min（30:70 ~50:50）、7 ~ 20 min（50:50 ~ 70:30）、20 ~ 25 min（70:30 ~ 75:25）、25 ~ 30 min（75:25~ 85:15）并维持到45 min，检测波长250 nm，柱温25℃，流动相流速1.0 ml/min。甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸混合标准溶液高效液相分离谱图见图1。

实施例2

准确称取1.0g过35目筛的甘草粉末，加入17.5ml无水乙醇、1ml浓盐酸和6.5ml蒸馏水，此时，液体中浓盐酸的浓度为0.5mol/l，料液比为1:25；回流2h，提取1次。冷却后抽滤，滤液用甲醇定容至50ml，通过液相色谱进行定性定量分析，测定其浓度。

重复上述步骤，仅通过调节浓盐酸和蒸馏水的加入量使液体中浓盐酸的浓度分别为1.0 mol/l、1.5 mol/l、2.0 mol/l和2.5mol/l，其它条件不变，将得到的产物通过液相色谱进行定性定量分析，测定其浓度。

液体中浓盐酸的浓度分别为0.5mol/l、1.0 mol/l、1.5 mol/l、2.0 mol/l和2.5mol/l时，所得甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的浓度如图2所示。由图2可以看出，当浓盐酸的浓度为1.5mol/l时，利用盐酸同时水解甘草酸为甘草次酸、水解甘草苷为甘草素的产物浓度最大。

实施例3

准确称取1.0g过35目筛的甘草粉末，加入17.5ml无水乙醇、4.17ml浓盐酸和3.33ml蒸馏水，此时，液体中浓盐酸的浓度为1.5mol/l，料液比1:25，回流2h，提取1次。冷却后抽滤，滤液用甲醇定容至50ml，通过液相色谱进行定性定量分析，测定其浓度。

重复上述步骤，仅将料液比由1:25分别调节为1:10（7ml无水乙醇和1.67ml盐酸+1.33ml蒸馏水）、1:15（10.5ml无水乙醇+2.5ml盐酸+2.0ml水）、1:20（14ml无水乙醇+3.33ml盐酸+2.67ml水）、1:30（21ml无水乙醇+5ml盐酸+4.0ml水），其它条件不变，将得到的产物通过液相色谱进行定性定量分析，测定其浓度。

料液比为分别为1:10、1:15、1:20、1:25和1:30时，所得甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的浓度如图3所示。由图3可以看出，当料液比为1:25时，利用盐酸同时水解甘草酸为甘草次酸、水解甘草苷为甘草素的产物浓度最大。

实施例4

准确称取1.0g过35目筛的甘草粉末，加入17.5ml无水乙醇、4.17ml浓盐酸和3.33ml蒸馏水，此时，液体中浓盐酸的浓度为1.5mol/l，料液比1:25。重复该步骤，分别制备5份，分别回流1h、1.5h、2h、2.5h、3h，各提取1次。冷却后抽滤，滤液用甲醇定容至50ml，通过液相色谱进行定性定量分析，测定其浓度。

回流时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h、3h时，所得甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的浓度如图4所示。由图4可以看出，当回流时间为2h时，利用盐酸同时水解甘草酸为甘草次酸、水解甘草苷为甘草素的产物浓度最大。

实施例5

准确称取1.0g过35目筛的甘草粉末，加入17.5ml无水乙醇、4.17ml浓盐酸和3.33ml蒸馏水，此时，液体中浓盐酸的浓度为1.5mol/l，料液比1:25。重复该步骤，分别制备3份，各回流2h，分别提取1次、2次、3次。冷却后抽滤，滤液用甲醇定容至50ml，通过液相色谱进行定性定量分析，测定其浓度。

提取次数分别为1次、2次、3次时，所得甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的浓度如图5所示。由图5可以看出，当提取次数为1次时，利用盐酸同时水解甘草酸为甘草次酸、水解甘草苷为甘草素的产物浓度最大。

对照例

准确称取1.0g过35目筛的甘草粉末，加入25 ml 体积分数为70% 的无水乙醇（此时料液比为1:25），回流2h，提取1次。冷却后抽滤，滤液用甲醇定容至50 ml，通过液相色谱进行定性定量分析。甘草中含甘草苷8.15mg/g，甘草素1.38mg/g，甘草酸48.97mg/g，甘草次酸0.13mg/g。样品的高效液相分离谱图见图6。

实施例6

通过实施例2~5得到的单因素结果，设计正交试验L₉ (3⁴) 因素水平表进行试验，以甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸浓度变化为评价指标，结果见表1：

表1 正交试验因素水平表

正交试验结果见表2：

表2 盐酸降解提取甘草素和甘草次酸正交试验结果

由表2正交实验直观分析可知，各因素对甘草素得率得影响顺序为：A>C>B>D，最佳提取条件为A₂C₃B₂D₁；各因素对甘草次酸得率得影响顺序为：A>C>D>B，最佳提取条件为A₂C₃D₁B₂。最佳提取条件为：提取次数为1次，浓盐酸浓度为1.5mol/l，回流时间为2h，料液比为1:25。在此条件下，甘草素和甘草次酸提取量高，甘草苷和甘草酸水解完全。

为使得实验的结果得到合理验证，按最佳实验条件回流提取并平行测定3次。甘草中甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的提取量平均值分别为0.04 mg/g，2.45 mg/g，1.16mg/g和15.32 mg/g。此结果与正交试验所测得结果的最高值基本一致，所得实验方法是稳定、可靠的。甘草苷和甘草酸基本水解完全，大大提高甘草素和甘草次酸的提取量。

实施例7

将实施例6中在最佳条件下酸解的样品，旋蒸浓缩后经乙酸乙酯萃取，祛除脂类和其他物质，得粗纯化的酸解样品。样品中分离甘草素和甘草次酸的高速逆流色谱图如图7所示。样品中甘草素4.26 mg/g提高到7.62 mg/g，甘草次酸含量30.27 mg/g提高到52.30 mg/g。

实施例8

通过高速逆流色谱图（HSCCC）选择最佳纯化条件为：二元体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（4:5:4:5，v/v），上相为流动相，流速2.0 ml/min，下相为固定相，转速为850 rpm，柱温为25℃。固定相的保留率为51%，从315mg实例7中所得粗纯化的酸解样品中获得2.1mg甘草素，纯度为96.5％，收率为87.6%；获得12.3mg甘草次酸，纯度为97.1%，收率为74.4%。纯化所得甘草素和甘草次酸红外光谱图如图8所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，其特征在于，所述无水乙醇、浓盐酸和蒸馏水中浓盐酸的浓度为1.5mol/l。

3.如权利要求1所述的从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，其特征在于，所述甘草粉末与入无水乙醇、浓盐酸、蒸馏水之和形成的料液比为1:25。

4.如权利要求1-3任一项所述的从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，其特征在于，所述回流时间为2h。

5.如权利要求1-3任一项所述的从甘草中提取纯化甘草素和甘草次酸的方法，其特征在于，提取1次。