CN110042145B - 一种基于量子点纸芯片及其制备方法和在检测葡萄糖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于量子点纸芯片及其制备方法和在检测葡萄糖中的应用。所述制备方法包括如下步骤：S1：将猪血干燥，研磨成猪血粉；S2：将猪血粉溶解，于150～200℃下进行水热反应10～18h后，离心，取上清液过滤，稀释得碳量子点溶液备用；S3：在纸芯片上部分涂覆疏水基质形成疏水区，未涂覆疏水基质的部分形成亲水区；S4：在疏水区加入辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液，干燥后，加入葡萄糖氧化酶溶液，干燥，再加入辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液，即得所述基于量子点纸芯片。本发明提供的量子点纸芯片具有类辣根过氧化酶活性，可快速检测葡萄糖的含量，检测结果可靠准确，成本低，具有良好的应用价值及前景。

Description

一种基于量子点纸芯片及其制备方法和在检测葡萄糖中的 应用
技术领域
本发明属于医药化学检测技术领域，具体涉及一种基于量子点纸芯片及其制备方法和在检测葡萄糖中的应用。
背景技术
糖尿病的主要外在表现是血糖水平异常偏高，但除此之外，它对心血管系统、神经系统以及心脏、肝脏、肾脏等主要脏器都有不同程度的负面影响，由此导致的一系列并发症，不但给患者和社会带来了沉重的经济负担，同时也是致人死亡的重要因素。据中国糖尿病协会组织调查，我国的糖尿病发病率高达9.7％，而糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。血糖是检测糖尿病的唯一标准，血糖的日常检测对于糖尿病患者有着重要的指导意义。
现有检测血糖的方法主要为葡萄糖氧化酶法(GOD法)和己糖激酶法(HK法)等，其中GOD法测定葡萄糖有较高的特异性灵敏度和准确性，试剂比较稳定，价格亦适中，操作较方便，是当前全国临床检验中心推荐的常规方法。但是该法涉及到使用辣根过氧化酶，多酶系统下，不易于检测试剂的保存，且一般通过酶标仪等专用设备对结果进行定量分析，不适合糖尿病患者的日常检测。因此，开发一种绿色经济，快速、准确、可靠的检测方法具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中血糖检测存在污染，成本高的缺陷和不足，提供一种基于量子点纸芯片的制备方法。本发明提供的量子点纸芯片具有类辣根过氧化酶活性，可快速检测葡萄糖的含量，检测结果可靠准确，成本低，具有良好的应用价值及前景。
本发明的另一目的在于提供一种基于量子点纸芯片。
本发明的另一目的在于提供上述基于量子点纸芯片在检测葡萄糖中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于量子点纸芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1：将猪血干燥，研磨成猪血粉；
S2：将猪血粉溶解，于150～200℃下进行水热反应10～18h后，离心，取上清液过滤，稀释得碳量子点溶液备用；
S3：在纸芯片上部分涂覆疏水基质形成疏水区，未涂覆疏水基质的部分形成亲水区；
S4：在疏水区加入辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液，干燥后，加入葡萄糖氧化酶溶液，干燥，再加入辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液，即得所述基于量子点纸芯片；所述葡萄糖氧化酶和碳量子点的质量摩尔比为1:5～1:640。
本发明以猪血为原料，经水热反应后制备得到具有类辣根过氧化酶活性的碳量子点，然后通过碳量子点、辣根过氧化酶的底物和葡萄糖氧化酶形成检测体系，辣根过氧化酶的底物和过氧化氢在碳量子点的作用下产生显色反应，从而实现葡萄糖的含量，检测结果可靠准确，成本低，具有良好的应用价值及前景。
优选地，S2中水热反应的温度为180℃，时间为12h。
优选地，S2中所述底物为TMB、OPD或ABTS中的一种或几种。
本领域常规的纸芯片均可用于本发明中。
优选地，S3中所述纸芯片为滤纸。
优选地，S3中疏水基质为石蜡。
疏水区和亲水区可按照常规的纸芯片进行设计。
优选地，S3中疏水区为圆孔阵列；所述圆孔的直径为5～10mm，所述相邻圆孔的中心距为10～20mm。
圆孔阵列的行和列数可根据实际检测的需要进行设计，一般情况下行数为8，列数为12较为适宜。
优选地，S3中利用如下过程形成疏水区：在纸芯片上放置具有镂空图案的框架，在框架表面涂覆疏水基质使得该疏水基质通过镂空图案渗入至纸芯片上，取下纸芯片，加热，冷却即得与镂空图案一致的疏水区。
根据疏水区和亲水区的图形设计要求，可针对性的设计镂空图案。
优选地，S4中所述葡萄糖氧化酶和碳量子点的质量比为1:10。
优选地，S4中所述辣根过氧化酶的底物和葡萄糖氧化酶的质量比为1:10～10:1。
更为优选地，S4中所述辣根过氧化酶的底物和葡萄糖氧化酶的质量比5:1。
一种基于量子点纸芯片，通过上述制备方法制备得到。
优选地，基于量子点纸芯片在检测葡萄糖中的应用也在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的量子点纸芯片具有类辣根过氧化酶活性，可快速检测葡萄糖的含量，检测结果可靠准确，成本低，具有良好的应用价值及前景。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的碳量子点的类辣根过氧化酶活性的紫外分析图；
图2为本发明实施例1提供的量子点纸芯片的碳量子点稀释比优化结果；
图3为本发明实施例1提供的量子点纸芯片的TMB浓度优化结果；
图4是本发明实施例1提供的基于量子点纸芯片的葡萄糖检测标准曲线；
图5是本发明实施例1提供的基于量子点纸芯片对检测葡萄糖的特异性图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
本发明提供一种基于量子点纸芯片，其制备方法如下。
(1)类辣根过氧化酶碳量子点的制备
1.猪血粉的制备：从市场购入猪血，置于滤纸上将表面的液体吸走，然后置于烘箱中干燥，干燥结束后置于研钵中进行研磨得到粉末，称重。
2.碳量子点的制备：称取1g猪血粉，加入100mL去离子水，反复吹吸，使其溶液均匀，转移到聚四氟乙烯内衬反应釜，180℃反应12小时，冷却后取出反应釜，将反应液进行8000rpm，室温离心10分钟去除沉淀，取上清，上清用0.45μm的滤膜进行过滤，溶液保存在4℃冰箱。
如图1，为该碳量子点的类辣根过氧化酶活性的紫外分析图。从图1可知，碳量子点(CDs)，TMB，以及TMB+H2O2在500～700nm的波长下没有紫外吸收，但是在TMB+H2O2体系下加入碳量子点后，在652nm下有明显吸收，是TMB氧化产物联苯醌，说明在碳量子点催化H2O2和TMB的反应。
(2)纸芯片的制作
1.在word软件上设计尼龙筛的样式，设计圆孔直径5mm，孔间距10mm，一共10行，10列，在印刷店打印成版。在木制框，尼龙筛上刷红色的固体石蜡，使石蜡渗透到3MM滤纸上，随后将纸撕下来，放在微波炉加热2分钟，随后置室温冷却10秒，形成疏水区和亲水区，其中疏水区与圆孔阵列一致。
(3)条件优化，铺制纸芯片1.取形成了疏水区和亲水区的滤纸，在滤纸的圆孔内分别加入5μL的5mmol/L的TMB溶液和等体积的1:1～1:16稀释比的碳量子点(碳量子点的质量分数分别为0.10mg/mL，即1:1的稀释比例，记为1#；0.05mg/mL，即1:2的稀释比例，记为2#；25.00ng/mL，即1:4的稀释比例，记为3#；12.50ng/mL，即1:8的稀释比例，记为4#；6.25ng/mL，即1:16的稀释比例，记为5#；3.13ng/mL，即1:64的稀释比例，记为6#；1.56ng/mL，即1:128的稀释比例，记为6#)，干燥后，各圆孔内均加入5μL的0.01mg/mL葡萄糖氧化酶溶液，干燥后按组每孔内分别加入5μL的5mmol/L的TMB溶液和1:1～1:16稀释比的碳量子点(与前述步骤一致)，最后形成纸芯片的铺制。碳量子点的优化如图2，横坐标为碳量子点的稀释倍数，灰度值为纵坐标，可以看出，当碳量子点浓度越大(即稀释倍数越小)，响应值越大，且当稀释倍数在1:2时候达到饱和，因此优选1:2稀释倍数(即0.05mg/mL，葡萄糖氧化酶和碳量子点的质量比为1:10)作为后续反应。
2.取形成了疏水区和亲水区的滤纸，在滤纸的圆孔内分别加入5μL0.04～8.32mmol/L的TMB溶液(0.04mmol/L，0.08mmol/L，1.66mmol/L，3.33mmol/L，6.65mmol/L以及8.32mmol/L)和等体积的1:2稀释比的碳量子点(碳量子点的质量分数分别为0.05mg/mL)，干燥后，各圆孔内均加入5μL的0.01mg/mL葡萄糖氧化酶溶液，干燥后按组每孔内分别加入5μL不同浓度的TMB溶液(与前述一致)和1:2稀释比的碳量子点，最后形成纸芯片的铺制。优化条件如图3，横坐标为TMB的浓度，灰度值为纵坐标，可以看出，随着TMB浓度上升，灰度值增大，但是当TMB浓度在3.33mmol/L(即0.8mg/mL)时候，信号值保持平缓，因此，本发明优选TMB浓度为0.8mg/mL，TMB和葡萄糖氧化酶的质量比为5:1。
(4)利用纸芯片检测葡萄糖，建立标准曲线
选用前述的优化条件制备纸芯片，其过程如下：按照步骤(1)和步骤(2)得到类辣根过氧化酶碳量子点和具有亲水区和疏水区的滤纸，然后取形成了疏水区和亲水区的滤纸，在滤纸的圆孔内分别加入5μL的3.33mmol/L的TMB溶液和等体积的1:2稀释比的碳量子点，干燥后，各圆孔内均加入5μL的0.01mg/mL葡萄糖氧化酶溶液，干燥后按组每孔内分别加入5μL的3.33mmol/L的TMB溶液和1:2稀释比的碳量子点，最后形成纸芯片的铺制。
利用该纸芯片得到标准曲线，步骤如下：
1.配制标准溶液：将36mg的葡萄糖溶于1mL的去离子水中做贮存液(200mmol/L)使用。然后用去离子水按照一定的稀释度将其配成配制不同浓度的葡萄糖标准溶液(0，1.56，3.13，6.25，12.50，25，50，100，200mmol/L)。
2.在步骤(3)铺制的纸芯片上，每孔加入5μL标准溶液，25min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析，以葡萄糖浓度为横坐标，以灰度值为纵坐标，用origin8.5作图。如图4，使用logistic进行非线性四参数拟合，拟合的方程是Y＝-85.67/[1+(X/17.53)^0.84]+83.67，R2＝0.998，线性范围是3.34～92.12mmol/L，最低检测限是1.72mmol/L。
实施例2
本实施例提供一种基于量子点纸芯片，其制备方法如下。
(1)类辣根过氧化酶碳量子点的制备
1.猪血粉的制备：从市场购入猪血，置于滤纸上将表面的液体吸走，然后置于烘箱中干燥，干燥结束后置于研钵中进行研磨得到粉末，称重。
2.碳量子点的制备：称取1g猪血粉，加入100mL去离子水，反复吹吸，使其溶液均匀，转移到聚四氟乙烯内衬反应釜，150℃反应20小时，冷却后取出反应釜，将反应液进行8000rpm，室温离心10分钟去除沉淀，取上清，上清用0.45μm的滤膜进行过滤，溶液保存在4℃冰箱。
(2)纸芯片的制作与实施例1一致，(3)铺制纸芯片按实施例1中优化后的条件进行。
实施例3
本实施例提供一种基于量子点纸芯片，其制备方法如下。
(1)类辣根过氧化酶碳量子点的制备
1.猪血粉的制备：从市场购入猪血，置于滤纸上将表面的液体吸走，然后置于烘箱中干燥，干燥结束后置于研钵中进行研磨得到粉末，称重。
2.碳量子点的制备：称取1g猪血粉，加入100mL去离子水，反复吹吸，使其溶液均匀，转移到聚四氟乙烯内衬反应釜，200℃反应10小时，冷却后取出反应釜，将反应液进行8000rpm，室温离心10分钟去除沉淀，取上清，上清用0.45μm的滤膜进行过滤，溶液保存在4℃冰箱。
(2)纸芯片的制作与实施例1一致，(3)铺制纸芯片按实施例1中优化后的条件进行。
应用实施例
在实施例1在标准曲线的基础上，利用实施例1优化后的量子点纸芯片对检测葡萄糖的特异性进行检测。
1.配制浓度为400mmol/L的maltose、L-rhamnose monohydrate、sucrose、galactose、L-Arabinose、fructose、fucose、glucose；
2.在铺制的纸芯片上，每孔加入5μL上述溶液，24min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析，以葡萄糖浓度为横坐标，以灰度值为纵坐标，用origin8.5作图，如图5。从图5可知，本方法与其他糖类物质没有交叉反应，对葡萄糖的检测有专一性，说明利用该方法检测葡萄糖是可靠的。
从测定结果可知，本发明提供的量子点纸芯片具有类辣根过氧化酶活性，可快速检测葡萄糖的含量，检测结果可靠准确，成本低，具有良好的应用价值及前景。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于量子点纸芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将猪血干燥，研磨成猪血粉；
S2：将猪血粉溶解，于150～200℃下进行水热反应10～18h后，离心，取上清液过滤，稀释得碳量子点溶液备用；
S3：在纸芯片上部分涂覆疏水基质形成疏水区，未涂覆疏水基质的部分形成亲水区；
S4：在疏水区加入辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液，干燥后，加入葡萄糖氧化酶溶液，干燥，再加入辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液，即得所述基于量子点纸芯片；所述葡萄糖氧化酶和碳量子点的质量比为1:10；所述辣根过氧化酶的底物和葡萄糖氧化酶的质量比为160:1；第一次和第二次加入的辣根过氧化酶的底物和碳量子点溶液是等量的；
S4中所述底物为TMB。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中水热反应的温度为180℃，时间为12h。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S3中疏水基质为石蜡。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S3中疏水区为圆孔阵列；所述圆孔的直径为5～10mm，所述相邻圆孔的中心距为10～20mm。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S3中利用如下过程形成疏水区：在纸芯片上放置具有镂空图案的框架，在框架表面涂覆疏水基质使得该疏水基质通过镂空图案渗入至纸芯片上，取下纸芯片，加热，冷却即得与镂空图案一致的疏水区。
6.一种基于量子点纸芯片，通过权利要求1～5任一所述制备方法制备得到。
7.权利要求6所述基于量子点纸芯片在检测葡萄糖中的应用，所述应用为在非疾病诊断治疗目的的应用。
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