CN105424646B - 一种监控γ-氨基丁酸生物转化过程的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种监控γ‑氨基丁酸生物转化过程的系统和方法。本发明采用近红外技术方法选用特定的光谱预处理方法和波数区间优化预测模型，针对以L‑谷氨酸为底物利用谷氨酸脱羧酶酶法制备γ‑氨基丁酸过程中的L‑谷氨酸和γ‑氨基丁酸的含量进行在线预测和监控。本发明的系统引入了微滤和超滤串联过滤装置，克服了过饱和L‑谷氨酸底物以及菌体细胞对测量的干扰，提高了检测的准确度。本发明还提供了一种γ‑氨基丁酸生物转化过程的系统，该系统简便快捷，并可同时检测L‑谷氨酸和γ‑氨基丁酸的含量，从而判定反应终点。本发明的系统还可用于酶法转化生产γ‑氨基丁酸的过程控制，具有很好的应用前景。

Description

一种监控γ-氨基丁酸生物转化过程的系统和方法
技术领域
本发明涉及生物技术制药领域，具体地涉及一种采用近红外技术监控γ-氨基丁酸生物转化过程的系统和方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种不属于21种常见氨基酸的非蛋白质组成氨基酸。γ-氨基丁酸作用于γ-氨基丁酸受体可引起细胞超极化，是中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质。据估计，30％至40％的中枢神经元可被γ-氨基丁酸所抑制，其主要具有延缓神经细胞衰老、降低血压、修复皮肤机能、调节心律失常、治疗癫痫等生理功能。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD，CE 4.1.1.15)能在磷酸吡哆醛辅酶的协助下，体内催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸。因此谷氨酸脱羧酶是生物体内合成γ-氨基丁酸的关键酶。
目前谷氨酸脱羧酶已在细菌如大肠杆菌、链球菌、黑曲霉、链孢霉等细菌中被发现。同时，该酶还存在于植物如发芽糙米、矮茶番茄、大豆、桑叶，和哺乳动物的大脑组织中。许多研究表明，γ-氨基丁酸是哺乳动物大脑和脊髓的主要的抑制性神经递质，能治疗帕金森病、老年性痴呆、癫痫、阿尔茨海默病、僵人综合征和精神分裂症。研究发现每日口服米胚芽(含有26.4mgγ-氨基丁酸)对治疗这些神经系统疾病非常有效。因此γ-氨基丁酸在食品、医药保健、饲料加工领域都有广泛应用的前景，其市场的需求也越来越大。
中国专利(申请号：201210464078X、2013101538534、2011100249468、2014100146395、2012104899722、2009100405134、2012100636395、2007101299415)分别公开了以米浆或发芽糙米、三七茎叶、茶叶、桑叶、绿藻以及大豆制品等为原料，制备富含γ-氨基丁酸的产品与方法。但自然界的植物组织中γ-氨基丁酸含量低，将它高纯度地提取出来是很困难的。目前制备高纯度的γ-氨基丁酸主要采用化学合成、微生物发酵和酶法合成等方法。化学合成法具有反应条件剧烈、不易控制、成品粗糙不能应用于医药和饮食等缺点。随着酶法转化技术的发展，人们开始了利用天然植物来源的谷氨酸脱羧酶来制备γ-氨基丁酸。中国专利(申请号：2013103335411、2013103334870、2009101691190)分别公开了从葡萄、西瓜皮、番木瓜等植物组织中提取谷氨酸脱羧酶的方法，以及酶法生产γ-氨基丁酸的方法。
一般认为由微生物发酵产生的含有γ-氨基丁酸的食品是安全、环保的，也为丰富的γ-氨基丁酸产品的生产提供了新的可能性。目前，基于谷氨酸脱羧酶催化合成γ-氨基丁酸是主要的生产方式。γ-氨基丁酸的主要产生菌是乳酸菌，包括短乳杆菌，植物乳杆菌，副干酪乳杆菌等。中国专利(申请号：2009101140164、2013104864747、2013105198813、2008101069507、2010101670587、2013100451393、2012101366961、2012100039318、2009101140183、2005100407589、2008100614192)公开了乳酸乳球菌、乳杆菌、肠球菌、唾液链球菌、以及红色红曲霉等细胞酶法转化法生产γ-氨基丁酸的方法。
大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶是由6个相同亚基组成的寡聚酶，单个亚基分子质量为52.6kDa，每个亚基含有1分子辅酶磷酸吡哆醛。该酶对L-谷氨酸具有严格的底物专一性，反应的最适pH为3.8～4.5。随着基因工程技术的发展，高效表达谷氨酸脱羧酶的酶法转化技术缩短了转化时间，大大提高了γ-氨基丁酸的产量和谷氨酸转化率。中国专利(申请号：2013105459086、2011102897963)公开了高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌、重组大肠杆菌的构建方法和应用。此外，中国专利(申请号：2013103317856)将两种谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2构建共表达载体导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基因工程菌表达的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸，大大提高了糖酸转化率。
γ-氨基丁酸的紫外吸收很弱，这给直接准确测定转化液和提取液中的γ-氨基丁酸含量带来较大困难。通常采用衍生化的层析、比色法和HPLC法进行测定，耗时较长。中国专利(申请号：2010105609130)公开了一种简便快速测定茶叶中γ-氨基丁酸的方法。该发明利用不溶性聚乙烯吡咯烷酮去除茶叶中的茶多酚类物质，然后基于Berthelot反应的分光光度法测定茶叶中γ-氨基丁酸含量。中国专利(申请号：2011104363513)公开了一种γ-氨基丁酸的高效液相色谱法，它首先将待衍生样品与NaH2CO3和衍生试剂2,4-二硝基氟苯进行衍生化反应，再采用C18柱对衍生产物进行高效液相分析，并在350nm处进行紫外检测，测定样品中γ-氨基丁酸的含量。中国专利(申请号：2009801132289)还提供一种使用特异性γ-氨基丁酸转氨酶，以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸使酶脱氢失活，电子载体作用于所生成的NADPH，使水溶性甲臜染料发生颜色变化，通过间接的方法测定γ-氨基丁酸的含量。
此外，中国专利(申请号：2012101728271)还提供了一种生物转化反应中快速计算γ-氨基丁酸生成量的检测装置，该装置包括：pH感应仪、数字转化仪、滴液瓶、控制仪和反应器。其数字转化仪可记录添加酸的体积，控制仪可以设定反应pH值、添加酸的浓度两个参数，由加酸体积经过程序计算可得γ-氨基丁酸生成量，并直接显示在控制仪上，间接的测定生物转化过程中γ-氨基丁酸。
目前，测定γ-氨基丁酸含量的方法有比色法、电泳法、色谱法和氨基酸分析仪等方法。比色法常用的方法是以苯酚和次氯酸钠溶液作为显色剂显色反应，用紫外可见分光光度计在645nm波长处测定γ-氨基丁酸含量的方法法，此方法在不同条件(温度、pH值、离子等)下，显色略有不同，同时需要避免氨和铵盐的干扰。电泳法是以纸为基板，在外加电场的作用下，由于物质理化性质差异，从而达到分离的作用，此方法重现性不好，误差较大，适合定性分析，不适合定量分析，且结果易受温度、pH值等条件的影响。色谱法则以高效液相色谱为主，由于γ-氨基丁酸无紫外吸收，先需要邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、2，4－二硝基氟苯(FDNB)等衍生化试剂进行柱前衍生才能检测，但是衍生物不稳定或者易产生副产品影响检测结果，且此方法操作繁琐耗时，单个样品需要30min以上时间才能检测出来。氨基酸分析仪法则由于没有直接测定γ-氨基丁酸的氨基酸分析仪，只能通过测定L-谷氨酸含量，间接计算出γ-氨基丁酸含量，此方法还易受其他氨基酸的影响。γ-氨基丁酸的标准化、市场化规范都需要快速、准确、简便的检测方法作为支撑，现今这些检测方法仍需优化，这些方法要么易受条件影响，准确性较差，要么操作过程复杂且耗时长而无法普及。
发明内容
本发明的一方面是针对现有γ-氨基丁酸酶法转化生产过程中存在的难以在线控制的问题，提供一种同时在线测定L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的系统，该系统包括：
发生酶促反应从而获得生物转化液的生物反应器；
用于过滤来自生物反应器的转化液的过滤装置；
对来自过滤装置的转化液进行检测的近红外光谱仪；
使生物反应器中的转化液经由过滤装置连续地传送到近红外光谱仪的传送泵；以及
用于对近红外光谱仪所采集的近红外光谱信号进行处理和运算拟合，从而得到γ-氨基丁酸及其底物L-谷氨酸含量的计算机数据处理系统。
优选地，所述生物反应器具有搅拌装置和控温加热装置。
优选地，所述过滤装置包括串联的微滤金属筛网和超滤膜。
进一步优选地，所述传送泵设置在微滤金属筛网和超滤膜之间。
进一步优选地，所述微滤金属筛网为能够过滤不溶性颗粒的400目至800目的不锈钢筛网。
进一步优选地，所述超滤膜是能够截留细菌菌体的0.2微米的超滤膜。
优选地，所述计算机数据处理系统对采集得到的近红外光谱进行预处理，选取近红外光谱检测波数段区间6111～5748cm-1，采用偏最小二乘法对该波数段区间的数据进行拟合建模，从而测算L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量。
本发明的另一方面是提供一种在线监控γ-氨基丁酸生物转化过程的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在生物反应器中发生如下酶促反应，从而获得包含γ-氨基丁酸的生物转化液：
(2)采用过滤装置过滤来自生物反应器的转化液；
(3)通过传送泵使生物反应器中的转化液经由过滤装置连续地传送到近红外光谱仪，采集转化液的近红外光谱；
(4)在计算机数据处理系统中对所采集的近红外光谱信号进行处理和运算拟合，从而得到γ-氨基丁酸及其底物L-谷氨酸含量。
优选地，所述反应在搅拌和控温加热条件下进行。
优选地，所述过滤包括串联的微滤金属筛网过滤和超滤膜过滤。
优选地，在所述步骤(4)中，对采集得到的近红外光谱进行预处理，选取近红外光谱检测波数段，采用偏最小二乘法对指定波数段区间的数据进行拟合建模，从而测算L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量。
优选地，近红外光谱检测波数段的区间为6111cm-1至5382cm-1或4587cm-1至4223cm-1。
进一步优选地，近红外光谱检测波数段的区间为6111cm-1至5748cm-1。
优选地，近红外光谱预处理是近红外光谱去趋势化预处理。
优选地，在所述方法的步骤(1)中，采用流加方式加入谷氨酸脱羧酶，其中谷氨酸脱羧酶来自谷氨酸脱羧酶的天然菌株或基因工程表达菌株的菌体细胞、微生物菌体细胞、以及植物动物组织。
进一步优选地，谷氨酸脱羧酶的投入量是3000～6000U，酶的流加速度控制在1000～2000U/小时。
优选地，本发明的在线监控γ-氨基丁酸生物转化过程方法还包括采用邻苯二甲醛自动化柱前衍生HPLC法对在线监控γ-氨基丁酸生物转化过程的方法进行校正和检验的步骤。
近红外光具有较强的穿透力，可直接测定样品内部各种组分的物理、化学和生物学信息，不需要进行复杂的样品制备，单个样品可以在几秒钟内完成测定。本发明提供了采用近红外技术监控γ-氨基丁酸生物转化过程的系统和方法，可以定点、实时、快速的检测出转化过程中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量变化。本发明采用了微滤和超滤串联过滤装置，对发酵液进行预处理，排除不溶性底物和菌体对近红外光谱测量的干扰，测定结果准确，所建模型中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的决定系数R2均大于0.999。本发明还可以用于利用谷氨酸脱羧酶提取液或表达谷氨酸脱羧酶的微生物菌体细胞的酶法转化L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的过程控制，方法操作简单、可靠，适合于工业化在线监控。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是实施例2中自动化柱前衍生法测定L-谷氨酸与γ-氨基丁酸的HPLC图谱。
图2是实施例3中谷氨酸脱羧酶酶法转化γ-氨基丁酸的转化效果图。
图3是实施例4中微滤和超滤串联过滤装置的过滤效果图。
图4是实施例5中γ-氨基丁酸生物转化过程近红外监控装置的示意图。
图5是实施例6中近红外光谱的9种预处理方法的全波长处理效果图。
图6是实施例7中近红外检测L-谷氨酸的光谱最佳波数段的选择效果图。
图7是实施例7中近红外检测γ-氨基丁酸的光谱最佳波数段的选择效果图。
图8是实施例7中近红外的拟合值与HPLC实测值的比较图。
图9是实施例8中γ-氨基丁酸生物转化过程的近红外监控效果图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
谷氨酸脱羧酶酶活测定方法
缓冲液A：取0.2mol/L硼酸(12.37g/L)与0.05mol/L硼砂(19.07g/L)按体积比1：4混合，制得0.2mol/L pH9.0的硼酸缓冲液A。
缓冲液B：取71.6g Na2HPO4·12H2O，21g一水柠檬酸，用500mL水溶解后，使用3MNaOH调节pH至5.35，蒸馏水定容至1L。
底物溶液：取10g谷氨酸钠，加入4mL 5g/L的磷酸吡哆醛，用缓冲液B定容至100mL。
谷氨酸脱羧酶酶液：取谷氨酸脱羧酶的提取粗酶或酶源细胞，使用缓冲液B，适量稀释制成谷氨酸脱羧酶酶液。
酶促反应的测定：取底物溶液2mL与2mL谷氨酸脱羧酶酶液混合，37℃下震荡反应30分钟，用缓冲液A将反应液稀释10倍。取750μL冰浴中预冷的上述稀释液，加入1500μL预冷的5％苯酚溶液，混合后再加入750μL的30％次氯酸钠，室温放置5分钟，沸水浴加热10分钟，冰浴5分钟后，于630nm测定吸光度。
酶活力定义：37℃反应条件下，每分钟内生成1μmol的GABA所需酶量定义为1个活力单位。
实施例2
自动化柱前衍生法测定L-谷氨酸与γ-氨基丁酸的含量
采用邻苯二甲醛(OPA)自动化柱前衍生HPLC法，测定转化过程中的L-谷氨酸与γ-氨基丁酸的含量，具体操作如下：
安捷伦高效液相色谱仪1260infinity，1290DAD检测器；流动相A：称取0.4g结晶乙酸钠，用水溶解定容至500mL；加入11μL三乙胺，滴加5％醋酸约80μL调节pH至7.20，混合过滤后备用；流动相B：称取0.24g乙酸钠结晶，用水溶解定容至300mL，滴加2％的醋酸约10μlpH调至7.20，再按乙酸钠溶液：乙腈：甲醇＝1:2:2的体积比混合，过滤后备用；色谱柱：C18色谱柱Phenomenex Luna 5μm,100A,250mm×4.6mm；检测波长：338nm；流速：1mL/分钟；进样量：10μL；色谱梯度洗脱条件(体积比)如下表1所示。
表1.色谱梯度洗脱条件
柱前自动衍生使用安捷伦6100自动进样器，采用自动衍生化程序，1μL衍生化试剂加入9μL硼酸缓冲液，20μL适当稀释的反应液或标准溶液，混合，静置2分钟后进样。
硼酸缓冲液：称取2.47g硼酸，加水约80mL，用NaOH调节pH至10.2，用双蒸水定容至100mL。
衍生化试剂：称取OPA 0.1g加入130μL巯基乙醇和1mL乙腈。
色谱分离效果如图1所示，L-谷氨酸的出峰时间约在5分钟，γ-氨基丁酸的出峰时间约在8.5分钟，两者可以达到基线分离。L-谷氨酸与γ-氨基丁酸在0.005g/L至0.2g/L的浓度范围内呈现良好的线性(R2＝0.9999)，可用于转化液中L-谷氨酸与γ-氨基丁酸的测定。
实施例3
谷氨酸脱羧酶酶法转化制备γ-氨基丁酸的条件考察
在过量的底物中一次性加入过量的谷氨酸脱羧酶，会产生大量的二氧化碳，这样会导致反应体积的迅速膨胀，使转化液溢出转化容器，造成不必要的损失。因此采用流加谷氨酸脱羧酶的方式，不仅有益于节约谷氨酸脱羧酶的用量，反应过程也相对容易控制，而且对采集近红外光谱的样品也十分有利。因此我们考察了谷氨酸脱羧酶的流加速度与用量。
氨酸脱羧酶粗酶的制备：取供试粳稻津星一号(津审稻1996002)由天津市农科院提供。用砻米机去除稻子外壳，得到糙米。经过筛、除杂后，选取大小均匀一致的糙米粒，室温下浸泡6小时，每2小时通气1次，然后用0.5％的次氯酸钠溶液消毒30分钟，再用馏水洗至中性。晾干糙米表面水分后，用含有0.1％的L-谷氨酸、0.1％的抗坏血酸的培养液(pH 5)浸渍，32℃恒温培养60小时，黑暗条件下发芽。称取50g发芽糙米，加入400mL预冷的pH 5.8磷酸缓冲液，低温高速匀浆研磨粉碎，10,000g冷冻离心15分钟。上清液冷冻干燥得到谷氨酸脱羧酶粗酶。采用实施例1所述的谷氨酸脱羧酶酶活测定方法测定酶活。
转化条件：酶促反应在1L反应体系下完成，底物L-谷氨酸量200g/L，磷酸吡哆醛5mg/L，温度控制在37℃搅拌条件下进行。采用匀速流加的方式分别投入总酶量为3000U，6000U，12000U的上述糙米谷氨酸脱羧酶粗酶。加入酶时间分别控制在1.5小时、3.0小时和6.0小时。采用实施例2所述的自动化柱前衍生法测定转化液中L-谷氨酸的含量，计算L-谷氨酸的转化率。
结果如下图2所示，采用3000～6000U酶的投入量，流加速度控制在1.5小时至3小时之内，可以较好的控制二氧化碳的迅速生成，L-谷氨酸的转化率在5小时内也可以达到98％。因此为节约酶用量，当L-谷氨酸底物浓度为200g/L时，酶的流加速度控制在1000～2000U/小时，其中以1500U/小时左右的流加速度为最佳。
实施例4
微滤和超滤串联过滤装置的考察
L-谷氨酸难溶于水，37℃时溶解度约为1.5g/100mL水，过饱和的底物溶液和不溶性的酶源菌体细胞，会严重影响近红外光谱的采集。因此本发明尝试同时引入了微滤和超滤串联过滤装置，试图克服了过饱和L-谷氨酸底物以及菌体细胞对测量的干扰。微滤网分别采用100目(孔径150微米)、400目(孔径38微米)、800目(孔径18微米)不同孔径的不锈钢筛网，超滤膜采用0.2微米超滤膜(外压型中空纤维超滤膜，天津膜天膜科技有限公司)，分别考察了对过饱和L-谷氨酸和10g/L的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，CICC编号：23133)菌体细胞混悬液的过滤效果。
结果如图3A所示，采用100目的不锈钢筛网不能有效出去L-谷氨酸不溶性颗粒，400目以上的不锈钢筛网才具有过滤效果。而采用800目的不锈钢微筛网在流速和过滤效果上最佳。再经0.2微米超滤膜去除菌体细胞，过滤后的转化液通过传送泵循环进入近红外测定仪进行光谱采集，其光谱最接近饱和浓度的L-谷氨酸的标准溶液。经去趋势化光谱预处理后，与标准光谱基本重合，可用于建模以及预测分析(图3B)。
实施例5
γ-氨基丁酸的酶法转化过程的装置与近红外检测
高表达谷氨酸脱羧酶的基因工程大肠杆菌的构建：根据NCBI数据库收录的大肠杆菌BL21的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计上游引物GAD1：5’-CGC GGA TCC ATG GAT AAG AAGCAA G-3’和下游引物GAD2：5’CCG CTC GAG CGG TCA GGT ATG TTT AAA G-3’。以大肠杆菌BL21的基因组为模板进行PCR扩增获得谷氨酸脱羧酶基因，1％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带后，连接pET21a(+)载体，构建pET21a(+)-GAD，并转入BL21(DE3)，获得基因工程菌BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD。取一个谷氨酸脱羧酶工程菌单菌落接种于LB培养基，37℃培养过夜以获得饱和培养物，将饱和培养物以1％接种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，37℃继续培养至OD600达到0.5，添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mmol/L，37℃诱导3小时，诱导表达谷氨酸脱羧酶。3000rpm离心收集湿菌体细胞，采用实施例1的方法确认表达谷氨酸脱羧酶的菌体细胞的酶活为666U/g。
取200g L-谷氨酸，5mg的磷酸吡哆醛，2g高表达谷氨酸脱羧酶的BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD菌体细胞置于盛有1L水的生物反应器中，控制温度在37℃，控制转速在200rpm。1小时后再以1g/小时均匀速度流加BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD菌体细胞于生物反应器内，第一批流加的终酶量达到10g/L，反应监控时间8小时。第二批流加的终酶量达到12g/L，反应监控时间10小时。
采用Bruker红外光谱仪(TENSOR 37)，控制检测室内温度25℃，湿度保持在50％以下，光谱扫描范围4000～12000cm-1，分辨率为8cm-1，全波长近红外光谱可以得到2074个变量，每个样品光谱重复扫描3次，扫描次数32次。上述生物反应器内的反应液经过实施例4的二级过滤，通过传送泵流入红外光谱仪石英比色池内，用于采集其近红外光谱，整体装置与流程如图4所示。
具体操作如下：反应开始20分钟时停泵取第一个点采集光谱，之后每间隔10分钟取点检测一次，第一批反应时长8小时，共计收集71组数据作为校正集。第二批流加时长10小时，共计收集70组数据作为检验集。转化液一部分直接用于近红外光谱图的采集的同时，取另一部分100μL于10mL容量瓶中，用pH 10.2的硼酸缓冲液稀释终止反应，定容后采用实施例2所述的自动化柱前衍生HPLC法测定转化液中的L-谷氨酸与γ-氨基丁酸的含量。
实施例6
近红外检测的光谱数据预处理方法选择
取实施例4所测定的光谱，剔除光谱强噪音区(波数范围4000～4200cm-1，4880～5320cm-1)，将原始光谱分割成两大区间。第一区间为4200～4880cm-1，包含177个变量，第二区间为4880～12000cm-1，包含1730个变量。两个区间分别采用原始光谱、均值化、消去常量偏移值、Savitzky-Golay卷积平滑、多元散射校正、标准变量变换、去趋势化、Savitzky-Golay卷积平滑一阶导数、Savitzky-Golay卷积平滑二阶导数等九种光谱预处理方法。其中Savitzky-Golay卷积平滑、Savitzky-Golay卷积平滑一阶导数与Savitzky-Golay卷积平滑二阶导数，均采用三次多项式拟合，平滑点数设定为9，去趋势化处理采用二阶导数拟合。如图3所示，所得9种光谱图在高波数区基线未发生漂移，说明经过实施例3的800目不锈钢筛网和0.2微米的超滤过滤后，所得溶液消除了干扰，得到了更稳定的光谱数据。
如表2所示，从9种预处理模式中筛选主成分数和RMSECV均较小的光谱预处理方法，结果发现去趋势化预处理模式不论对L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的光谱均表现出理想的拟合效果，因此综合考虑光谱预处理方法定为去趋势化法。
表2.基于全波长信息的光谱预处理优化
实施例7
近红外检测的光谱的最佳波数段选择
采用实施例5的光谱信息，首先剔除原始光谱强噪音区，得到波数范围4200～4880cm-1和4880～12000cm-1包含1907个变量的光谱图两个大区间。采用实施例6的方法进行去趋势化光谱预处理，再根据变量数将第一区间4200～4880cm-1等分为2个子区间，第二区间4880～12000cm-1等分为18个子区间。在每个子区间上运用偏最小二乘回归法分别针对L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的HPLC含量实测值进行拟合，各得到20个局部回归模型，结果见图6，7所示。对校正集使用交叉验证均方差(RMSECV)选择局部精度最高的波数区为优选波数区。选定优化波数区后，以检测集作为独立集合作为验证集，计算外部检验均方差(RMSEP)，确定最适合波数段，
结果如表3所示。采用去趋势化预处理方法，结合偏最小二乘法对γ-氨基丁酸建模时，选择第17、18和20波数段，主成分定为9，7和11时，具有最低的RMSECV值。在随后的检验集验证中，该模型同样具有较低的RMSEP值。同样，在对L-谷氨酸建模时，同样选择第17，18和20波数段，主成分分别为6，7和5时，具有最低的RMSECV值。而检验集验证中，该模型也同样具有较低的RMSEP值。
表3.基于间隔偏最小二乘算法的波段优化
因此采用6111～5382cm-1或4587～4223cm-1波数段，其中优选范围区间为6111～5748cm-1，主因子数分别为6，9时所建立的L-谷氨酸模型的交互检验均方差值(RMSECV)0.78g/L，交互验证的校正标准偏差值(RMSEP)为1.83g/L，R值为0.999；γ-氨基丁酸模型的RMSECV值1.13g/L，RMSEP值为3.78g/L，R值为0.998，可以同时准确的测算出L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量，见图8。
实施例8
酶法转化生产γ-氨基丁酸的在线控制应用
采用上述实施例5的在线监测装置，在1L反应体系下进行转化反应。取底物L-谷氨酸量200g/L，磷酸吡哆醛5mg/L，温度控制在37℃，120rpm搅拌速度。采用上述实施例5制备的高效表达谷氨酸脱羧酶的菌体细胞(666U/g)，以2.5g/小时的速度进行流加，酶的最终添加量达为10g/L。按照上述转化条件，30分钟时开始取第一个样品进行检测，之后每间隔10分钟取样一次，310分钟后每间隔30分钟取样一次，450分钟后结束采样监控。利用实施例6，7已经建立好的光谱处理方法和近红外模型，预测转化过程中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量。同时采用实施例2所述的自动化柱前衍生HPLC法测定L-谷氨酸与γ-氨基丁酸的实际含量。通过对比预测值与实测值，检验近红外模型预测的稳健性。
结果如图9所示，随着反应的进行γ-氨基丁酸浓度的提高后使得转化液pH值的升高，导致L-谷氨酸在水溶液中的溶解度不断增加，因此底物L-谷氨酸的溶解度在240分钟之内不断升高。当到达240分钟时溶液中过饱和的L-谷氨酸全部溶解，谷氨酸脱羧酶直接消耗溶液中的L-谷氨酸，导致L-谷氨酸在水溶液中的浓度迅速下降。而由于产物γ-氨基丁酸水中溶解度高，其浓度随反应时间不断升高。至300分钟时，γ-氨基丁酸浓度达到121g/L，L-谷氨酸达到4g/L后，反应进入平台期二者浓度变化微小。350分钟以后反应基本结束时，反应体系中L-谷氨酸浓度为2.9g/L，γ-氨基丁酸浓度为123g/L，L-谷氨酸的转化率大于98.5％。
本实施例证明：利用本发明提供的近红外监测装置和方法所得到的预测值与HPLC法的测定值很好的吻合。本发明提供的装置和方法具有简便快捷，可同时检测转化过程中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量变化，并可用于判定反应终点，有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种同时在线测定L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的系统，该系统包括：
发生酶促反应从而获得生物转化液的生物反应器；
用于过滤来自生物反应器的转化液的过滤装置；
对来自过滤装置的转化液进行检测的近红外光谱仪；
使生物反应器中的转化液经由过滤装置连续地传送到近红外光谱仪的传送泵；以及
用于对近红外光谱仪所采集的近红外光谱信号进行处理和运算拟合，从而得到γ-氨基丁酸及其底物L-谷氨酸含量的计算机数据处理系统；所述计算机数据处理系统对采集得到的近红外光谱进行去趋势化预处理，选取近红外光谱检测波数段区间6111cm-1至5748cm-1，采用偏最小二乘法对该波数段区间的数据进行拟合建模，从而测算L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量；
其中，所述过滤装置包括串联的微滤金属筛网和超滤膜。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述生物反应器具有搅拌装置和控温加热装置。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述传送泵设置在微滤金属筛网和超滤膜之间。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微滤金属筛网为能够过滤不溶性颗粒的400目至800目的不锈钢筛网。
5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述超滤膜是能够截留细菌菌体的0.2微米的超滤膜。
6.一种在线监控γ-氨基丁酸生物转化过程的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在生物反应器中发生如下酶促反应，从而获得包含γ-氨基丁酸的生物转化液：
(2)采用过滤装置过滤来自生物反应器的转化液，其中，所述过滤装置包括串联的微滤金属筛网和超滤膜；
(3)通过传送泵使生物反应器中的转化液经由过滤装置连续地传送到近红外光谱仪，采集转化液的近红外光谱；
(4)在计算机数据处理系统中对所采集的近红外光谱信号进行去趋势化预处理并选取近红外光谱检测波数段区间6111cm-1至5748cm-1，采用偏最小二乘法对指定波数段区间的数据进行拟合建模，从而得到γ-氨基丁酸及其底物L-谷氨酸含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应在搅拌和控温加热条件下进行。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用流加方式加入谷氨酸脱羧酶，其中谷氨酸脱羧酶来自谷氨酸脱羧酶的天然菌株或基因工程表达菌株的菌体细胞、微生物菌体细胞、以及植物动物组织。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，谷氨酸脱羧酶的投入量是3000～6000U，酶的流加速度控制在1000～2000U/小时。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用邻苯二甲醛自动化柱前衍生HPLC法对在线监控γ-氨基丁酸生物转化过程的方法进行校正和检验的步骤。
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