CN109030662B - 检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学分析领域，提供了检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r‑氨基丁酸含量的方法，取戊四唑致痫的大鼠海马组织，冰上匀浆，离心取上清液进行衍生处理，然后进行高效液相色谱检测谷氨酸及r‑氨基丁酸，色谱条件为：采用反向C18柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为40‑60mmol/L的乙酸钠溶液和四氢呋喃，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱。本发明的检测方法步骤简单，结果精确，检测快速。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析领域，具体涉及检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。
背景技术
癫痫是由于神经元异常放电引起的短暂性脑功能障碍，是一种常见的中枢神经系统综合征，癫痫持续状态(SE)是神经内科常见的危重急症，长时间癫痫发作若不及时控制，可因高热、循环衰竭或神经元兴奋毒性损伤，导致不可逆的脑损伤，致残率和病死率很高。SE与癫痫终止机制关系密切，因此，探索癫痫发作终止的相关机制，对改善SE患者预后及其重要。目前，有研究指出，抑制性神经递质及兴奋性神经递质失衡是介导SE的关键。r-氨基丁酸(GABA)与谷氨酸(GLU)分别为中枢神经系统中最为重要的抑制性及兴奋性神经递质，两者失衡是导致SE的重要原因之一。GLU对中枢神经系统有兴奋作用，与癫痫的发作起始关系密切，而其代谢产物：GABA，是中枢神经系统抑制性物质，可介导癫痫发作的终止。GLU、GABA的合成及释放与癫痫的终止关系密切。海马作为大脑边缘系统的一部分，与癫痫发作关系密切。因此。研究SE状态下海马内GLU、GABA含量及其比值变化，对癫痫持续状态的发生、发展及其终止有重要意义。
常见的氨基酸检测方法有离子交换色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳、色谱-质谱联用等。近年来，柱前衍生反相高效液相色谱法分析氨基酸的发展非常迅速，该方法具有灵敏度高、分析速度快、衍生试剂种类多样等优点，已经在许多领域得到应用。然而以前的色谱条件相对比较复杂、衍生产物存在不稳定、易降解等缺点，并且成本高。在本实验中我们摸索出了新的色谱条件，实现了脑内海马组织中GLU、GABA快捷、省时、低成本且准确度高的测定目的。
发明内容
本发明目的在于提供一种低成本、方便快捷的检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法，包括以下步骤：
(1)致痫大鼠模型的建立：取SD大鼠，用剂量为80mg/kg的戊四唑进行皮下注射，观察大鼠行为，根据Racine分级标准，选择IV-V级致痫大鼠作为致痫大鼠模型；
(2)将步骤(1)中得到的所述致痫大鼠达到癫痫发作级别后30min时断头取海马组织，称取海马组织，冰上匀浆，取海马组织匀浆加入50vol％的甲醇溶液，按照每100mg加入1mL甲醇溶液计算，-4℃,12000rpm离心20-30min，取上清与乙腈1:1混合后，-4℃,12000rpm离心20-30min得到的上清液为样品，并将样品进行衍生处理；
(3)衍生后的样品通过高效液相色谱进行检测，测定样品中的谷氨酸及r-氨基丁酸含量，色谱条件如下：
色谱柱采用反向C18色谱柱；
流速：1.0mL/min；
柱温：30-35℃；
检测波长：265nm；
进样量：20uL；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为40-60mmol/L乙酸钠溶液和四氢呋喃，二者体积比为99:1，所述乙酸钠溶液用冰醋酸调节pH至4.8，所述流动相B为乙腈；
采用如下梯度洗脱程序：
进一步，样品衍生处理的具体步骤为向样品中加入柱前衍生剂、乙腈、去离子水和硼酸-硼砂缓冲液，加入的柱前衍生剂、乙腈、去离子水和硼酸-硼砂缓冲液与样品的体积比分别为7～9:10～12:8～10:7～9:4，所述硼酸-硼砂缓冲液的pH为8.6，放入40℃恒温水浴箱中反应5min，然后经0.22μm微孔滤膜过滤。
进一步，所述柱前衍生剂为9-芴甲基氯甲酸酯。
进一步，所述柱温为30-32℃。
本发明的有益效果是：本发明的检测方法步骤简单，结果精确，检测快速。
附图说明
图1为本发明谷氨酸标准曲线，浓度单位为μg/mL；
图2为本发明r-氨基丁酸标准曲线，浓度单位为μg/mL；
图3为本发明谷氨酸标准品和r-氨基丁酸标准品高效液相色谱图；
图4为本发明实施例中对照组海马组织样品的高效液相色谱图；
图5为本发明实施例中药物组致痫大鼠海马组织样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供了一种低成本、方便快捷的检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。
实验中用到的试剂及动物如下：
戊四唑(PTZ)：购自上海源叶生物科技有限公司，用生理盐水配制成10mg/mL备用；
SD成年雄性大鼠：体重约160-200g，由广西医科大学动物实验中心提供；
L-谷氨酸标准品：购自上海源叶生物科技有限公司，其纯度>99％；
r-氨基丁酸标准品：购自北京普天同创生物科技有限公司,其纯度>98％；
具体的实验过程如下：
(1)致痫大鼠模型建立及海马组织处理
将SD大鼠随机分为药物组和对照组两组，药物组取16只大鼠，对照组10只，药物组大鼠用剂量80mg/kg的戊四唑(PTZ)进行皮下注射，对照组予以等量的生理盐水进行皮下注射，给药后观察并记录大鼠行为，药物组按照Racine分级标准选择IV-V级致痫大鼠作为癫痫动物模型组，药物组中有13只大鼠达到该级别，达到癫痫发作级别30min时将实验组的癫痫动物模型组的13只大鼠以及对照组的10只大鼠分别断头取海马组织，称取少量海马组织，冰上匀浆，取海马组织匀浆加入50vol％的甲醇溶液，按照每100mg加入1mL甲醇溶液计算，-4℃,12000rpm离心20-30min，取上清与乙腈1:1混合后，-4℃,12000rpm离心20-30min得到的上清液为样品，取40μL样品加入120μL乙腈、80μL9-芴甲基氯甲酸酯、90μL去离子水和80μL pH为8.6的硼酸-硼砂缓冲液，混匀，放入40℃恒温水浴箱中反应5min进行衍生，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，得到衍生后的样品。
(2)将衍生后的样品通过高效液相色谱进行检测
使用的仪器为LC-20AB高效液相色谱仪，色谱柱为RedClassicalAQ-C18(5um，250*4.8mm)，检测波长为265nm，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为乙酸钠溶液+四氢呋喃，取用冰醋酸调节pH至4.8的50mmol/L的乙酸钠溶液410mL、去离子水85mL和四氢呋喃5mL混合均匀得到流动相A，流动相B为乙腈，流动相的流速为1.0mL/min，柱温为30-35℃，进样量为20uL，梯度洗脱程序如下：
采用HPLC按照上述色谱条件测定不同浓度梯度下(20μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)的谷氨酸及r-氨基丁酸标准品的峰面积，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1和图2所示，谷氨酸的回归方程为y＝1.489681e-004x-1.107063，R^2＝0.9992，r-氨基丁酸的回归方程为y＝1.096515e-004x-2.731902，R^2＝0.9992，在上述色谱条件下，谷氨酸以及r-氨基丁酸标准品的HPLC图如图3所示，谷氨酸的保留时间为19.824min，r-氨基丁酸的保留时间为28.454min，两者峰形良好，其杂质对样品测定无干扰。
采用HPLC在上述色谱条件下测定药物组和对照组衍生后的样品中谷氨酸和r-氨基丁酸的含量，对照组和药物组的HPLC图分别如图4和图5所示，对照组中谷氨酸的保留时间为19.801min，r-氨基丁酸的保留时间为28.519min，两者峰形良好，杂质峰对样品峰无干扰，根据标准曲线得到对照组海马组织中谷氨酸和r-氨基丁酸的浓度分别为162.61±20.74μg/mL和36.74±7.11μg/mL，药物组中谷氨酸的保留时间为19.715min，r-氨基丁酸的保留时间为28.421min，两者峰形良好，其杂质对样品峰无干扰，根据标准曲线得到药物组大鼠海马组织中谷氨酸和r-氨基丁酸的浓度分别为163.52±1.44μg/mL和40.05±6.67μg/mL，在PTZ致痫的药物组大鼠海马组织内谷氨酸和r-氨基丁酸的含量与对照组相比，无显著差别，两组大鼠海马内谷氨酸和r-氨基丁酸的比值(分别为4.50±0.58和4.13±0.42)亦无明显差别，提示达到SE发作30分钟后SD大鼠脑内海马组织中的谷氨酸和r-氨基丁酸含量已经基本恢复至正常水平，谷氨酸与r-氨基丁酸的比值未见失衡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)致痫大鼠模型的建立：取SD大鼠，用剂量为80mg/kg的戊四唑进行皮下注射，观察大鼠行为，根据Racine分级标准，选择IV-V级致痫大鼠作为致痫大鼠模型；
(2)将步骤(1)中得到的所述致痫大鼠达到癫痫发作级别后30min时断头取海马组织，称取海马组织，冰上匀浆，取海马组织匀浆加入50vol％的甲醇溶液，按照每100mg加入1mL甲醇溶液计算，-4℃,12000rpm离心20-30min，取上清与乙腈1:1混合后，-4℃,12000rpm离心20-30min得到的上清液为样品，将样品进行衍生处理；
其中，样品衍生处理的具体步骤为向样品中加入柱前衍生剂、乙腈、去离子水和硼酸-硼砂缓冲液，加入的柱前衍生剂、乙腈、去离子水和硼酸-硼砂缓冲液与样品的体积比分别为7～9:10～12:8～10:7～9:4，所述硼酸-硼砂缓冲液的pH为8.6，放入40℃恒温水浴箱中反应5min，然后经0.22μm微孔滤膜过滤，其中，所述柱前衍生剂为9-芴甲基氯甲酸酯；
(3)衍生后的样品通过高效液相色谱进行检测，测定样品中的谷氨酸及r-氨基丁酸含量，色谱条件如下：
色谱柱采用反向C18色谱柱；
流速：1.0mL/min；
柱温：30-35℃；
检测波长：265nm；
进样量：20uL；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为40-60mmol/L乙酸钠溶液和四氢呋喃，二者体积比为99:1，所述乙酸钠溶液用冰醋酸调节pH至4.8，所述流动相B为乙腈；
采用如下梯度洗脱程序：
2.根据权利要求1所述的检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法，其特征在于,所述柱温为30-32℃。
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