CN106442491A - 一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法 - Google Patents

一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速检测溶液中尿糖和尿酸含量的方法。本发明采用打印机，以纸张AKD作为疏水材料，在滤纸上制作纸芯片，作为检测载体。尿糖检测以葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶作催化试剂，以碘化钾作显色试剂。尿酸检测采用UOD‑POD双酶法测定。在所得纸芯片上检测区内负载试剂，待芯片完全干燥后，对不同浓度的尿糖、尿酸标准溶液或样品溶液进行检测，拍照并对图片进行处理，获得RGB颜色强度值，建立标准溶液的颜色强度值和浓度之间的标准曲线。本方法利用了酶促反应的高选择性，结合了纸芯片的简便、多元检测与化学发光成像的直观及高灵敏度，充分发挥了三者的优点，具有成本低、操作简单、快速且易操作等优势。

Description

一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法
技术领域
本发明涉及溶液中样品检测领域，具体涉及一种检测尿糖和尿酸的方法。
背景技术
葡萄糖是生命活动中不可缺少的物质，其水平高低直接影响着人们身体状况。血液流经肾脏时，其中的葡萄糖通过肾小球滤过到肾小管内，在肾小管内的葡萄糖绝大多数又被重吸收人血，尿里仅有微量的葡萄糖，用普通方法检查不出来，可以说是无糖的。在正常人，只有当血糖超过160～180mg/dl时，糖才能较多地从尿中排出，形成尿糖。尿糖检查是早期诊断糖尿病最简单的方法。
尿酸是由核酸氧化生成嘌呤，而后嘌呤会在肝脏中再次氧化生成。成人尿液中尿酸正常含量为90～420umol/L。尿酸含量偏高，容易在体内形成结晶，在关节部位析出晶体则表现为痛风症状。此外，肾功能衰竭、白血病等疾病的出现都与体内高尿酸有关。因此，对人体内尿酸含量进行测定有助于诊断、预测相关疾病。
传统检测尿糖的方法主要是斑氏(Benedict)尿糖定性检查法，干化学法、光度法、电化学法等方法，常用尿酸检测方法有双酶法、磷钨酸还原法、高效液相色谱法以及尿液分析仪等。无论是尿糖还是尿酸，这些现有的分析方法都需要专业人士操作，仪器贵重、运输麻烦，因此需要一种快速、简单地测定尿酸含量的分析方法以弥补现有技术的空缺。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种快速、简单地测定尿糖和尿酸含量的分析方法。
本发明的技术方案是，一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，
(1)以滤纸为纸芯片，采用打印机先常规打印轮廓，在打印机墨盒中加入防水剂烷基烯酮二聚体，再打印疏水材料形成检测区；
(2)将样品溶液与含有辣根过氧化物酶的试剂混合，检测区上分别负载不同的试剂对溶液中的尿糖或尿酸进行检测；
(3)待检测区干燥后，拍照并用图像处理软件对照片进行处理，获得各显色斑点的颜色强度值，建立标准溶液的颜色强度值和尿糖或尿酸浓度之间的标准曲线；在检测实际样品时，按上述同样方法将未知样品溶液的颜色强度值代入相应的标准曲线，即可计算出溶液中尿糖或尿酸浓度。
步骤(3)的同样的方法，是指取未知样品溶液在滴在纸芯片检测区，待检测区完全干燥后，拍照并用图像处理软件对照片进行处理，获得各显色斑点的颜色强度值吗？
纸芯片用纸是whatman滤纸，更优选为whatman4号滤纸。根据我们的检测对象，纸芯片轮廓直径选择7mm长度，0.1磅线条；打印疏水区域时再将线条改为4磅粗细，其余不变，重复3-5次疏水材料即可完成制作过程。
检测区是半径略小于图中黑色圆圈且处于其内部的圆形部分(因为加粗打印了疏水材料)；疏水区域是一个同心圆形状的区域，处于黑色圆圈与检测区之间(被加粗打印的部分)；轮廓指的是图中黑色圆圈。
优选的是，烷基烯酮二聚体(AKD)与正庚烷配置成溶液后再加入墨盒。AKD：正庚烷＝1-4g：20-28ml。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其中，
尿糖检测具体步骤：
(1)检测尿糖时，以葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶作催化试剂，以碘化钾作显色试剂；
(2)依次将葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、碘化钾溶液、尿糖标准溶液以2:2-3:2-3:2-3体积比混合，在试管管中充分反应，取混合液体于纸芯片检测区上；
(3)待检测区完全干燥后，拍照并用图像处理软件对照片进行处理，获得各显色斑点的颜色强度值，建立标准溶液的颜色强度值和尿糖浓度之间的标准曲线；在检测实际样品时，按上述同样方法将未知溶液的颜色强度值代入标准曲线，即可计算出溶液中尿糖浓度。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其中，尿酸检测具体步骤：
(1)在纸芯片上依次加入4-氨基安替比林(AAP)、3,5-二氯-2-羟基-苯磺酸钠(DHBS)、尿酸氧化酶(UOD)、辣根过氧化物酶(HRP)，4-氨基安替比林：DHBS：尿酸氧化酶：辣根过氧化物酶的体积比＝1-2:1-2:1-2:1-2，待负载试剂的区域干燥直至看不见水迹；
(2)将不同浓度尿酸标准溶液和样品溶液分别加在已有四种试剂的纸芯片检测区上，充分反应，等待颜色出现；
(3)拍照并用图像处理软件对照片进行处理，测定显色区域的RGB颜色强度，代回标准曲线即可计算出溶液中尿酸的浓度。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，所述图像处理软件为imageJ软件。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，所述的样品溶液含尿糖及其它水溶性杂质样品的水溶液，或者生物样品。生物样品指经处理除去蛋白的血清、尿样等。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，在所述步骤(1)中，纸芯片的负载量是4μL。尿酸和尿糖检测中的最大负载量都是4μL。
更优选的是，尿酸检测中，纸芯片的负载量分别是1.0μL4-AAP，1.0μLDHBS，1.0μLUOD，1.0μLHRP。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，在所述步骤(3)中，所述的尿糖标准溶液的浓度范围为2.0～10.0g/L；所述的尿酸标准溶液的浓度范围为0～100mg/L.
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，在尿糖检测中，在所述的步骤(1)中，所述的检测试剂，所述葡萄糖氧化酶活力值为100～200U/mL；所述辣根过氧化物酶酶活力值为50～100U/mL；所述碘化钾溶液的适宜浓度为0.5～1.0mol/L。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，在尿酸检测中，在所述步骤(1)中，4-AAP溶液的浓度为3-5mol/L，DHBS溶液的浓度为7-9mol/L；所述尿酸氧化酶UOD和辣根过氧化物酶HRP分别配制成酶活力单位为70-90U/mL、300-360U/mL的溶液。
根据本发明的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，优选的是，在尿糖检测中，在所述的步骤(2)中，所述的充分反应，其反应时间至少为5min。
计算溶液中尿酸含量的具体步骤为：取显色区域的RGB强度值为纵坐标，以尿酸浓度为横坐标建立标准曲线，最后将样品溶液的RGB强度值带入标准曲线，计算得未知尿酸的含量。
计算溶液中尿糖含量的具体步骤为：取显色区域的RGB强度值为纵坐标，以尿糖浓度为横坐标建立标准曲线，最后将样品溶液的RGB强度值带入标准曲线，计算得未知尿糖的含量。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明的创新点是：
本发明创造性地建立了一种以纸基芯片为平台，检测尿糖和尿酸的方法，与常规分析手段比较，整个检测过程具有成本低、快速且易操作等优势。使得该方法对于相关疾病的及早诊断和预后具有重要意义。
附图说明
图1是空白纸芯片。
图2是尿糖检测中显色后的纸芯片图。
图3是尿酸检测中显色后的纸芯片图。
具体实施方式
实施例1
首先对桌面打印机进行改造，将疏水材料烷基烯酮二聚体(AKD)配成溶液(AKD：正庚烷＝2g：25ml)，滴加至墨盒中，待打印。同时，利用Word设计纸芯片检测区域。首先打印纸芯片的轮廓，而后打印疏水区域。最后将打印好的滤纸置于98℃烘箱5分钟左右，使得AKD更紧密结合在滤纸表面，形成疏水通道(图1)。采用此方法得到的纸芯片可以负载3-5μL的试剂，有效保证供检测用量的试剂不渗漏出检测区。
实施例2
(1)在纸芯片上依次加入如下试剂和样品溶液：葡萄糖氧化酶酶活力为120U/mL，用量0.6μL；辣根过氧化物酶酶活力为80U/mL，用量0.6μL；碘化钾溶液的浓度为0.6mol/L，用量1.0μL；尿糖标准溶液浓度梯度为2.0,4.0,6.0,8.0,10.0g/L，以及浓度为3.0g/L葡萄糖样品溶液用于验证标准曲线测定实际样品的误差，用量均为1.0μL。
(2)依照上述顺序负载各试剂和尿糖溶液，反应约10min后充分显色(图2)，对纸芯片拍照，用imageJ软件测定不同浓度尿糖溶液对应的RGB颜色强度值，做出强度值与标准溶液浓度之间的线性曲线，得出相关系数(R2＝0.9895)和线性方程(y＝-1.0169x+166.59)。将3.0g/L尿糖样品对应的RGB强度值带入线性方程，计算出该颜色强度值所对应的浓度为2.95g/L，误差为1.81％。
实施例3
(1)在纸芯片上依次加入4mol/L 4-氨基安替比林(4-AAP)1.0μL、8mol/L 3,5-二氯-2-羟基-苯磺酸钠(DHBS)1.0μL、酶活力单位80U/mL尿酸氧化酶(UOD)1.0μL、酶活力单位339U/mL辣根过氧化物酶(HRP)1.0μL，待负载试剂的区域干燥直至看不见水迹；
(2)将不同浓度尿酸标准溶液和样品溶液分别加在已有四种试剂的纸芯片检测区上，充分反应，等待颜色出现(图3)；
(3)用手机拍照并用imageJ软件测定显色区域的RGB颜色强度，带回标准曲线即可计算出溶液中尿酸的浓度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于：
(1)以滤纸为纸芯片，采用打印机先常规打印轮廓，在打印机墨盒中加入防水剂烷基烯酮二聚体，再打印疏水材料形成检测区；
(2)将样品溶液与含有辣根过氧化物酶的试剂混合，检测区上分别负载不同的试剂对溶液中的尿糖或尿酸进行检测；
(3)待检测区干燥后，拍照并用图像处理软件对照片进行处理，获得各显色斑点的颜色强度值，建立标准溶液的颜色强度值和尿糖或尿酸浓度之间的标准曲线；在检测实际样品时，按上述同样方法将未知样品溶液的颜色强度值代入相应的标准曲线，即可计算出溶液中尿糖或尿酸浓度。
2.根据权利要求1所述的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于：
尿糖检测具体步骤：
(1)检测尿糖时，以葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶作催化试剂，以碘化钾作显色试剂；
(2)依次将葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、碘化钾溶液、尿糖标准溶液以2:2-3:2-3:2-3体积比混合，在试管管中充分反应，取混合液体于纸芯片检测区上；
(3)待检测区完全干燥后，拍照并用图像处理软件对照片进行处理，获得各显色斑点的颜色强度值，建立标准溶液的颜色强度值和尿糖浓度之间的标准曲线；在检测实际样品时，按上述同样方法将未知溶液的颜色强度值代入标准曲线，即可计算出溶液中尿糖浓度。
3.根据权利要求1所述的快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于：
尿酸检测具体步骤：
(1)在纸芯片上依次加入4-氨基安替比林(AAP)、3,5-二氯-2-羟基-苯磺酸钠(DHBS)、尿酸氧化酶(UOD)、辣根过氧化物酶(HRP)，4-氨基安替比林：DHBS：尿酸氧化酶：辣根过氧化物酶的体积比＝1-2:1-2:1-2:1-2，待负载试剂的区域干燥直至看不见水迹；
(2)将不同浓度尿酸标准溶液和样品溶液分别加在已有四种试剂的纸芯片检测区上，充分反应，等待颜色出现；
(3)拍照并用图像处理软件对照片进行处理，测定显色区域的RGB颜色强度，代回标准曲线即可计算出溶液中尿酸的浓度。
4.如权利要求1所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，所述图像处理软件为imageJ软件。
5.如权利要求1所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，所述的样品溶液含尿糖及其它水溶性杂质样品的水溶液，或者生物样品。
6.如权利要求1所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，纸芯片的负载量是4μL。
7.如权利要求1所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的尿糖标准溶液的浓度范围为2.0～10.0g/L；所述的尿酸标准溶液的浓度范围为0～100mg/L。
8.如权利要求2所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的检测试剂，所述葡萄糖氧化酶活力值为100～200U/mL；所述辣根过氧化物酶酶活力值为50～100U/mL；所述碘化钾溶液的适宜浓度为0.5～1.0mol/L。
9.如权利要求3所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，4-AAP溶液的浓度为3-5mol/L，DHBS溶液的浓度为7-9mol/L；所述尿酸氧化酶UOD和辣根过氧化物酶HRP分别配制成酶活力单位为70-90U/mL、300-360U/mL的溶液。
10.如权利要求2所述的一种快速检测溶液中尿糖和尿酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的充分反应，其反应时间至少为5min。
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