CN109965269A - 食品组合物及其应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明涉及食品组合物及其应用。目的在于,提供对于预防生物体器官功能障碍导致的疾病或延迟其发展有用的、能够日常摄取的食品组合物,其作用机理的一部分是明确的。用于解决课题的方法是,提供一种食品组合物,其含有微生物菌群的大豆来源发酵产物,所述微生物菌群包括乳酸菌群和酵母菌群,所述乳酸菌群包括乳酸杆菌属的至少1种乳酸菌和乳球菌属的至少1种乳酸菌,所述酵母菌群包括酵母菌属的至少1种酵母和克鲁维酵母属的至少1种酵母,所述大豆来源发酵产物含有雌马酚、γ-氨基酸和抗菌物质。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品组合物,其含有包括乳酸菌群和酵母菌群的微生物菌 群的大豆来源发酵产物。
背景技术
在有历史记载以前,开菲尔就在东欧(黑海周边)被饮用,现在在以俄罗 斯为中心的东欧被日常饮用。自古以来,凭经验得知开菲尔是具有各种药理作 用的。作为显示这样的药理作用的物质,报告了牛奶开菲尔中,作为发酵起始 物(种子)的开菲尔粒所产生的粘性多糖类和其中所含的肽(非专利文献1)。
作为牛奶开菲尔中那样的药理作用,本发明人报告了(1)对大肠杆菌、 产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌的抗菌作用(非专利文献2)、(2)抗压作用 (非专利文献3)。
其他关于开菲尔的已有研究主要是关于开菲尔粒构成菌的鉴定、发酵产物 的经口给药对癌症、动脉硬化、高血压、关节炎等氧化障碍系的病理学作用(非 专利文献4和5)和整肠作用(非专利文献6)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Ohishi H.等,Jpn.J.Dairy and Food Sci.,37(6),A-291-A-293(1988)
非专利文献2:谷久典等,日本农艺化学会2010年度大会演讲摘要集, p173(2010)
非专利文献3:谷久典等,日本农艺化学会2000年度大会演讲摘要集, p77(2000)
非专利文献4:Halliwell B.和Gutterige J.M.C.,Biochem J.,219,1-4,(1984)
非专利文献5:Frenkel K.,Pharmacol Ther.,53,127-166,(1992)
非专利文献6:Liu J.等,J.Sci.Food Agric.,86,2527-2533,(2006)
发明内容
发明所要解决的课题
几乎没有对随着年龄增加、生活方式疾病而变化的、生物体器官功能障碍 导致的疾病的预防或其发展的延迟有用的、能够日常摄取的食品的例子,即使 偶尔有强调那样的功效的食品,其作用机理也并不清楚。关于开菲尔,以往对 于发酵产物中所含有用成分的作用也没有多少研究。本发明的目的在于,提供 一种食品组合物,其为对于生物体器官功能障碍导致的疾病的预防或其发展的 延迟有用的、能够日常摄取的食品组合物,其作用机理的一部分是清楚的。
用于解决课题的方法
本发明人利用作为发酵起始物(种子)的开菲尔粒使包括果汁、牛奶的各 种食品原料发酵,对有用成分进行了深入研究,结果发现,大豆来源发酵产物 中含有作为异黄酮代谢物的雌马酚、作为谷氨酰胺代谢物的γ-氨基丁酸 (GABA)、以及对于作为所谓坏细菌的梭菌属细菌、大肠菌群(coliform bacteria)和葡萄球菌属的细菌显示强的抗菌作用而对于作为所谓好细菌的乳 酸菌(lactic acid bacteria)、产丁酸菌(butylate-producing bacteria)和双歧杆 菌(bifidobacteria)等不显示抗菌作用的抗菌物质,从而完成了本发明。
即,本说明书包括以下发明的公开。
[1]一种食品组合物,其含有微生物菌群的大豆来源发酵产物,所述微 生物菌群包括乳酸菌群和酵母菌群,所述乳酸菌群包括乳酸杆菌属的至少1 种乳酸菌和乳球菌属的至少1种乳酸菌,所述酵母菌群包括酵母菌属的至少1 种酵母和克鲁维酵母属的至少1种酵母,所述大豆来源发酵产物含有雌马酚、 γ-氨基丁酸和抗菌物质。
[2]根据[1]所述的食品组合物,乳酸菌群包括专性同型(组I)的至 少1种、兼性异型(组II)的至少1种和专性异型(组III)的至少1种乳酸 杆菌属乳酸菌。
[3]根据[1]或[2]所述的食品组合物,乳酸菌群包括嗜酸乳杆菌 (Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)干酪亚种、高 加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏 乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳 酸乳球菌(Lactococcus lactis)乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种和嗜热链球菌 (Streptococcusthermophilus)。
[4]根据[1]~[3]中任一项所述的食品组合物,酵母菌群包括酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)、图列茨哈萨克斯坦酵母(Kazachstania turicensis)、单孢哈萨克斯坦酵母(Kazachstania unispora)和马克斯克鲁维酵 母(Kluyveromycesmarxianus)。
[5]根据[1]~[4]中任一项所述的食品组合物,大豆来源发酵产物 为豆浆发酵产物。
[6]根据[1]~[5]中任一项所述的食品组合物,抗菌物质不是细菌 素。
[7]根据[1]~[6]中任一项所述的食品组合物,其用于预防生物体 器官功能障碍导致的疾病或延迟其发展。
[8]根据[1]~[7]中任一项所述的食品组合物,生物体器官功能障 碍导致的疾病为肾脏功能障碍导致的疾病、肝脏功能障碍导致的疾病或脑功能 障碍导致的疾病。
[9]根据[1]~[8]中任一项所述的食品组合物,其为固体。
[10]根据[1]~[8]中任一项所述的食品组合物,其为液体。
发明的效果
本发明的食品组合物能够降低肠道内大肠杆菌(Escherichia coli)、产气荚 膜梭菌(Clostridium perfringens)等坏细菌的占有率。坏细菌产生吲哚等代谢 物。而且,由宿主肠道吸收的吲哚在宿主的肝脏由于细胞色素P450而氧化且 由于磺基转移酶而硫酸结合,生成硫酸吲哚酚,使宿主的血中硫酸吲哚酚浓度 增加(Niwa T.等,Am.J.Nephrol.,14(3),207-212,1994)。因此,本发明的食品 组合物能够减少坏细菌产生的吲哚等代谢物、减少宿主体内由吲哚生成的硫酸 吲哚酚、减少宿主的血中硫酸吲哚酚浓度。硫酸吲哚酚作为尿毒素而闻名,因 而本发明的食品组合物对于由于这些坏细菌在肠道内增殖而引起的、生物体器 官功能障碍导致的疾病的预防或其发展的延迟是有用的。这些疾病随着年龄增加、生活方式疾病而变化,因而本发明的食品组合物在所谓高龄化社会能够有 助于实现健康长寿。
附图说明
图1-1为雌马酚标准品的层析图。
图1-2为来自实施例1中得到的豆浆开菲尔的试样的层析图。
图2-1为γ-氨基丁酸标准品的层析图。
图2-2为来自实施例1中得到的豆浆开菲尔的试样的层析图。
图3为显示摄取了实施例1中得到的豆浆开菲尔的、人粪便移植大鼠的粪 便中大肠杆菌和产气荚膜梭菌的数量的图表。显示的是试验开始时(0天)、 第15天和第30天的粪便测定结果。
图4-1为硫酸吲哚酚钾标准品的层析图。
图4-2为摄取了实施例1中得到的豆浆开菲尔的、人粪便移植大鼠的血 清的层析图。
具体实施方式
以下,非限定性地对本发明的方式进行说明。
本发明的食品组合物是含有包括乳酸菌群和酵母菌群的微生物菌群的大 豆来源发酵产物的食品组合物。
本说明书中,“乳酸菌群”是包括乳酸杆菌属的至少1种乳酸菌和乳球菌属 的至少1种乳酸菌的乳酸菌群,优选包括专性同型(组I)的至少1种、兼性 异型(组II)的至少1种和专性异型(组III)的至少1种乳酸杆菌属乳酸菌, 进一步优选包括链球菌(Streptococcus)属的至少1种乳酸菌。
作为乳酸杆菌属乳酸菌,可列举例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、高加索酸奶乳杆菌 (Lactobacillus kefiri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、鼠李糖乳 杆菌(Lactobacillus rhamnosus)等,优选列举嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、高加索酸奶乳杆菌 (Lactobacillus kefiri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。此外,作 为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),可列举例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 干酪亚种、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)阿拉伯糖亚种等,优选列举干酪 乳杆菌(Lactobacillus casei)干酪亚种。
作为乳球菌属乳酸菌,可列举例如乳酸乳球菌、植物乳球菌(Lactococcusplantum)等,优选列举乳酸乳球菌。此外,作为乳酸乳球菌,可列举例如乳 酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌丁二酮乳酸亚种等,优 选列举乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种。
作为链球菌(Streptococcus)属乳酸菌,可列举例如嗜热链球菌、黄金链 球菌(Streptococcus chryseus)等,优选列举嗜热链球菌。
本说明书中,“酵母菌群”是包括酵母菌属的至少1种酵母和克鲁维酵母属 的至少1种酵母的酵母菌群,优选还包括哈萨克斯坦(Kazachstania)属的至 少1种酵母。
作为酵母菌属酵母,可列举例如酿酒酵母、巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)等,优选列举酿酒酵母。
作为克鲁维酵母属酵母,可列举例如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等,优选列举马克斯克鲁维酵母。
作为哈萨克斯坦(Kazachstania)属酵母,可列举例如图列茨哈萨克斯坦 酵母、单孢哈萨克斯坦酵母、特鲁利斯哈萨克斯坦酵母(Kazachstania telluris) 等,优选列举图列茨哈萨克斯坦酵母、单孢哈萨克斯坦酵母。
一个方式中,上述微生物菌群可以是构成开菲尔粒等被保存的发酵起始物 (种子)的微生物,也可以是种子的发酵产物或将该发酵产物继代1次以上而 得的发酵产物所含的微生物。
本说明书中,“大豆来源发酵产物”是作为发酵基质的大豆原料或大豆加工 品的上述微生物菌群的发酵产物,作为大豆原料,可列举全大豆、脱脂加工大 豆、大豆全粒粉、大豆胚芽等,优选列举大豆全粒粉、大豆胚芽等。作为大豆 加工品,可列举豆浆(有成分调整和无成分调整)、豆腐、油皮、豆渣、毛豆、 大豆豆芽、豆粉(きな粉)等,优选列举豆浆等。此外,大豆的品种可以是任 何品种。
作为发酵基质的大豆原料或大豆加工品优选经加热灭菌。加热灭菌例如通 过在60~120℃、优选在80~100℃加热例如0.5~2.0小时、优选0.5~1.0小 时来进行。加热灭菌可以加压而进行。
本发明中,发酵如下进行:将发酵基质和上述微生物菌群混合,在例如 22~55℃、优选25~45℃、更优选30~40℃、进一步优选30~37℃、最优选 35℃,以例如20~100小时、优选24~75小时、更优选30~50小时、进一步 优选32~40小时、最优选36小时,进行例如静置、一边通气一边搅拌、搅拌, 优选进行静置。
本发明中,上述大豆来源发酵产物可以是液体(例如发酵滤液),也可以 是固体(例如发酵滤液的冻干物)。
本发明中,上述大豆来源发酵产物含有雌马酚、γ-氨基丁酸、抗菌物质 等有用成分。雌马酚在上述大豆来源发酵产物、优选为上述大豆来源发酵产物 固体中含有例如0.5~2.0%(w/w)、优选含有1.5~2.0%(w/w)。γ-氨基丁酸 在上述大豆来源发酵产物、优选为上述大豆来源发酵产物固体中含有例如 0.5~2.0%(w/w)、优选含有1.5~2.0%(w/w)。抗菌物质以下述程度含有: 在将上述大豆来源发酵产物液体的稀释液按1/20体积添加在含有106个大肠杆 菌的培养液中并培养的情况下,显示50%生长抑制率的稀释倍数例如为5倍以 下、10倍以下、20倍以下、40倍以下、80倍以下、160倍以下,优选为20 倍以下、40倍以下、80倍以下、160倍以下,更优选为80倍以下、160倍以 下,最优选为160倍以下的程度;在将1mg/ml的上述大豆来源发酵产物固体 的溶液的稀释液按1/20体积添加在含有106个大肠杆菌的培养液中并培养的情 况下,显示50%生长抑制率的稀释倍数例如为5倍以上、10倍以上、20倍以 上、40倍以上、80倍以上、160倍以上,优选为20倍以上、40倍以上、80倍以上、160倍以上,更优选为80倍以上、160倍以上,最优选为160倍以上。
本发明的食品组合物可以仅包含上述大豆来源发酵产物,也可以含有上述 大豆来源发酵产物以外的食品成分等。作为那样的食品成分,可列举例如维生 素类、矿物质类。
本发明的食品组合物通过每天按换算成上述大豆来源发酵产物液体的量 例如为1~10g、优选为2~8g、更优选为3~5g、按换算成上述大豆来源发酵 产物固体的量例如为10~500mg、优选为50~300mg、更优选为100~200mg 的量连续摄取例如7天以上、优选15天以上、更优选30天以上,从而能够使 肠道内大肠杆菌和产气荚膜梭菌等坏细菌的数量减少摄取前的例如10%左右、 优选25%左右、更优选50%左右。此外,还能够使粪便中的吲哚含量减少至 摄取前的例如2%左右、优选5%左右、更优选10%左右。进而,还能够使血 中的硫酸吲哚酚含量减少摄取前的例如2%左右、优选5%左右、更优选10% 左右。
本发明的食品组合物能够作为健康食品、补充剂等使用。可以作为例如锭 剂、胶囊剂(软胶囊剂、硬胶囊剂)、颗粒剂(包括干糖浆)、散剂(粉末剂)、 细粒剂、丸剂等固体制剂、水性或非水性内服用液(包括液剂、悬浮剂、糖浆 剂)等液体制剂使用。
上述各种制剂可以将本发明的食品组合物与健康食品、补充剂等中通常可 允许的添加剂混和并通过公知的方法来制造。作为那样的添加剂,可列举例如 赋形剂、滑润剂(涂敷剂)、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫嗅剂、基剂、 分散剂、稀释剂、表面活性剂、乳化剂、经皮吸收促进剂、pH调节剂、保存 剂、着色剂、油分(油脂、矿物油等)、保湿剂、醇、增稠剂、聚合物、皮膜 形成剂、紫外线吸收剂、细胞赋活剂、抗氧化剂、防腐剂、凉爽剂、除臭剂、颜料、染料、香料、糖类、氨基酸类、维生素类、有机酸、有机胺、植物提取 物等,但不限于此。
作为一个方式,本发明的食品组合物能够用于被认为是由血中吲哚硫酸的 积累引起的、生物体器官功能障碍导致的疾病、例如肾脏、肝脏、脑、心脏功 能障碍导致的疾病、优选肾脏、肝脏功能障碍导致的疾病、更优选肾脏功能障 碍导致的疾病的预防或其发展的延迟。
作为肾脏功能障碍导致的疾病,可列举例如慢性肾功能衰竭(CDK)、肾 血管疾病。
作为肝脏功能障碍导致的疾病,可列举例如肝硬化、肝性脑病。
作为脑功能障碍导致的疾病,可列举例如脑血管疾病、痴呆。
作为心脏功能障碍导致的疾病,可列举例如心血管疾病(CVD)。
作为一个进一步的方式,本发明的食品组合物能够用于口腔内环境的改善、 龋齿的预防或其发展的延迟。
作为一个进一步的方式,本发明的食品组合物能够用于减小精神压力。
作为一个进一步的方式,本发明的食品组合物能够用于降低致癌风险。
实施例
以下,以实施例的形式对本发明的具体方式进行说明。
实施例1豆浆开菲尔的制造
首先,为了调制发酵起始物(种子),在开菲尔粒(50g)中加入10倍量 的市售无成分调整牛奶,25℃静置培养72小时使其发酵。开菲尔粒所含的经 鉴定的微生物如下面的表1所示。
表1
发酵后,使用网、滤器等将发酵产物从开菲尔粒分离,以分离到的发酵产 物作为种子。其中,在分离了发酵产物后的开菲尔粒中再次加入牛奶继代培养, 从而能够进一步获得发酵产物。
接下来,为了制造豆浆开菲尔,将全粒大豆粉末(500g,由派力肯公司获 得)、大豆胚芽(10g,由派力肯公司获得)、市售的砂糖(25g)混合于自来水 中,制成1,000ml。然后,95℃加热灭菌1小时后,25℃冷却,添加50g通过 上述方法得到的种子,25℃静置36小时使其发酵,得到豆浆开菲尔。此外, 作为比较对照,将500ml市售无成分调整牛奶同样地用种子发酵,制造牛奶开 菲尔。
实施例2豆浆开菲尔中的成分的分析
1.异黄酮类糖苷、雌马酚和γ-氨基丁酸的分析
关于实施例1的豆浆开菲尔和比较对照的牛奶开菲尔,分别使用15g发酵 前和发酵后的物质,加入500ml 50%(v/v)乙醇,室温下振荡提取。以该提 取液作为试样,通过高效液相色谱(HPLC)对试样中的异黄酮类糖苷、雌马 酚和γ-氨基丁酸进行分析。
(1)异黄酮类糖苷的分析
异黄酮类糖苷的分析所用的条件如下。
HPLC系统:LC-8020(东曹株式会社制)
柱:Hypersil HyPurity C18(内径2.1mm×长度100mm)(Thermo Fisher公 司制)
柱温:40℃
流动相:乙腈:水(75:25)
流速:0.2ml/分钟
试样注入量:10μl
检测器:紫外可见检测器(UV-8020,东曹株式会社制)
检测波长:254nm
通过与大豆苷、金雀异黄素和黄豆黄苷标准品(均由和光纯药工业株式会 社获得,产品编号:309-05161、079-05533和G635410)的分析结果的比 较,鉴定层析图中试样中的异黄酮类糖苷的峰。
(2)雌马酚的分析
雌马酚的分析所用的条件如下。
HPLC系统:LC-8020(东曹株式会社制)
柱:Hypersil HyPurity C18(内径2.1mm×长度100mm)(Thermo Fisher株 式会社制)
柱温:40℃
流动相:乙腈:水(75:25)
流速:0.20ml/分钟
试样注入量:10μl
检测器:紫外可见检测器(UV-8020,东曹株式会社制)
检测波长:254nm
通过与雌马酚标准品(由和光纯药工业株式会社获得,产品编号:380- 04991)的分析结果的比较,鉴定层析图中试样中的雌马酚的峰。分别将由标 准品和豆浆开菲尔来源的试样得到的层析图示于图1-1和图1-2。
(3)γ-氨基丁酸的分析
GABA的分析所用的条件如下。
HPLC系统:LC-8020(东曹株式会社制)
柱:TSKgel ODS-80Ts(内径4.6mm×长度250mm)(东曹株式会社制)
柱温:40℃
流动相:乙腈:10mM乙酸铵水溶液(50:5)
流量:1.00ml/分钟
试样注入量:10μl
衍生化试剂:茚三酮(预柱法)
检测器:紫外可见检测器(UV-8020,东曹株式会社制)
检测波长:570nm
通过与γ-氨基丁酸标准品(由和光纯药工业株式会社获得,产品编号: 010-02441)的分析结果的比较,鉴定层析图中试样中的γ-氨基丁酸的峰。 分别将由标准品和豆浆开菲尔来源的试样得到的层析图示于图2-1和图2-2。
2.抗菌活性的分析
关于实施例1的豆浆开菲尔和比较对照的牛奶开菲尔,将分别通过离心分 离从发酵前和发酵后的物质将固体成分除去而得的液体部分作为抗菌活性测 定用试样,通过以纸片法测定抗菌活性进行分析。具体而言,在由人粪便调制 的微生物中加入平板计数琼脂培养基(Merck公司制),制成平板,在其中央 放置吸收了50μl上述抗菌活性测定用试样的纸片(直径8mm,ADVANTEC 公司制),35℃进行24小时培养,观察平板上纸片周围形成的微生物的生长被 阻止的范围(抑菌圈)的直径。
通过上述“1.异黄酮类糖苷、雌马酚和γ-氨基丁酸的分析”和“2.抗菌活性的分 析”,关于实施例1的豆浆开菲尔和比较对照的牛奶开菲尔,分析异黄酮 类糖苷、雌马酚和γ-氨基丁酸的含量以及抗菌活性,将其结果汇总示于表2。
表2
抗菌活性中,-表示阴性,+表示假阳性(形成轮廓不清晰的抑菌圈), ++表示弱阳性(形成轮廓清晰的抑菌圈,抑菌圈的直径为10mm以下),+ ++表示中阳性(形成轮廓清晰的抑菌圈,抑菌圈的直径为10~15mm),且 ++++表示强阳性(形成轮廓清晰的抑菌圈,抑菌圈的为15mm以上)。
实施例1的豆浆开菲尔在发酵后含有2.0%(w/w)雌马酚、2.0%(w/w) γ-氨基丁酸,抗菌活性也极高,而牛奶开菲尔在发酵后未检测到雌马酚,γ -氨基丁酸的含量为0.4%(w/w),也比豆浆开菲尔低。此外,抗菌活性也比 豆浆开菲尔低。由此提示,实施例1中制造的豆浆开菲尔中,通过发酵,有效 地产生了雌马酚、γ-氨基丁酸和抗菌物质。其中,认为雌马酚是由作为发酵 基质的豆浆所含的异黄酮类产生的,γ-氨基丁酸是由作为发酵基质的豆浆所 含的谷氨酸产生的。认为雌马酚具有降低致癌风险的作用,γ-氨基丁酸具有 减小精神压力的作用(Beg A.A.,Jorgensen E.M.,Nat.Neurosci.,6(11), 1145-1152,2003)。
此外,在牛奶开菲尔中,乳酸菌的增殖在108CFU/g左右停止,而在豆浆 开菲尔中,乳酸菌增殖至1011CFU/g左右,因而认为,实施例1中制造的豆浆 开菲尔与牛奶开菲尔的γ-氨基丁酸的含量之差不仅是由于发酵基质所含谷氨 酸的量的差别,还由于增殖的乳酸菌的数量的差别。
实施例3豆浆开菲尔抗菌活性的测定
通过以下方法对实施例2中观察到的豆浆开菲尔的抗菌活性进行测定,从 而进一步进行分析。
试验材料
将通过离心分离或硅藻土过滤从实施例1中得到的豆浆开菲尔中将固体 成分除去而得的发酵滤液冻干,以其作为抗菌活性测定用试验材料。此外,将 牛奶开菲尔的发酵滤液冻干,以其作为比较对照。
豆浆开菲尔的抗菌活性浓度筛选
以液体培养基中大肠杆菌的生长抑制率为指标,对豆浆开菲尔来源的试验 材料显示抗菌活性的浓度进行筛选。首先,在2ml CASO培养基(由Merck 公司获得,产品编号:1.00525.5000)中,以每1ml为106个的方式添加大肠 杆菌。将豆浆开菲尔来源的试验材料用灭过菌的生理盐水调制成1mg/ml的浓 度,以其作为基准试样,进一步用灭过菌的生理盐水梯度稀释20~640倍,以 其作为稀释试样。
在上述含有大肠杆菌的CASO培养基中分别添加100μl基准试样和稀释试 样。37℃培养6小时,以其作为各测定试样,测定600nm波长下的浊度(OD600)。 将OD600的测定结果、以及算出的大肠杆菌的增殖率(%)和生长抑制率(%) 示于表3。未添加基准试样或稀释试样,而是添加100μl灭过菌的生理盐水并 培养,以其作为对照,以单独的CASO培养基作为空白。基于各OD600的值, 通过以下的式1算出大肠杆菌的增殖率(%)。此外,生长抑制率(%)通过 与对照的增殖率100%之差算出。其中,添加有基准试样的测定试样的OD600比空白还低,因此将增殖率设为0%。
式1
大肠杆菌的增殖率(%)={(各测定试样-空白)/(对照-空白)}×100
表3
根据表3,认为豆浆开菲尔对大肠杆菌增殖的50%抑制浓度以豆浆开菲尔 来源的试验材料浓度计为6.25μg/ml(添加160倍稀释试样的测定试样)左右。
豆浆开菲尔抗菌活性谱的分析
通过以下方法,对于实施例1中得到的豆浆开菲尔对大肠杆菌、梭菌属菌 的产气荚膜梭菌、李斯特属菌的李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绿脓杆菌 (Pseudomonasaeruginosa)和沙门氏属菌的肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的抗菌活性进行试验。
以对于大肠杆菌增殖的50%抑制浓度为参考,调制10μg/ml浓度的豆浆开 菲尔来源的试验材料去离子水溶液,使50μl该溶液含浸于直径8mm的纸片 (ADVANTEC公司制,产品编号:49005010),置于10ml的平板计数琼脂培 养基(Merck公司制)上,与进行试验的细菌一起培养。大肠杆菌、梭菌属菌 和沙门氏属菌是37℃培养24小时,李斯特属菌和绿脓杆菌是37℃培养48小 时。其中,梭菌属菌在厌氧条件下培养。测定纸片周围形成的抑菌圈的直径, 调查抗菌活性的程度。抑菌圈的直径越大,则认为抗菌活性的程度越高。此外, 作为比较对照,对牛奶开菲尔来源的试验材料也同样地进行试验。将结果示于 表4。
表4
其结果表明,关于进行试验的全部细菌,均形成了清晰的透明区,实施例 1中得到的豆浆开菲尔对于这些细菌全部显示出抗菌活性。此外,在全部这些 细菌中,实施例1中得到的豆浆开菲尔的抗菌活性均比牛奶开菲尔的抗菌活性 高。提示如果按透明区的直径的值之比计算,则实施例1中得到的豆浆开菲尔 与牛奶开菲尔相比,在大肠杆菌中具有约1.7倍、在梭菌属菌中具有约1.5倍、 在李斯特属菌中具有约1.7倍、在绿脓杆菌中具有约1.5倍、在沙门氏属菌中 具有约3.3倍的抗菌活性。
如此可见,实施例1中得到的豆浆开菲尔的抗菌活性谱非常广,考虑到乳 酸菌等细菌所产生的针对近缘细菌的抗菌物质细菌素的抗菌活性谱窄,提示实 施例1中得到的豆浆开菲尔含有与细菌素不同的抗菌物质。此外,即使将由于 实施例1中得到的豆浆开菲尔的抗菌活性而产生的透明区用生理盐水洗涤后 再次培养,也完全无法确认到进行试验的细菌的生长,因而提示该抗菌物质的 作用并非抑菌作用,而是灭菌作用。进而,开菲尔粒在实施例1中得到的豆浆 开菲尔中增殖了,因而推测该抗菌物质不显示对于开菲尔粒中也含有的乳酸菌、 双歧杆菌等有用细菌(所谓好细菌)的抗菌活性,能够选择性作用于所谓坏细菌。这样的对于坏细菌的选择性抗菌作用可以期待大大有助于在日常生活中促 进健康。
其中,在分子量1kDa的截留透析管的透析外液中确认到实施例1中得到 的豆浆开菲尔的抗菌活性,通过使用了TOYOPEARL HW-40S(东曹株式会 社制)的凝胶过滤色谱(洗脱液:70%乙醇溶液),在分子量450Da和500Da 附近以2个峰的形式洗脱,因而推测具有抗菌活性的抗菌物质是分子量约 450Da和约500Da的甘油衍生物。
实施例4豆浆开菲尔摄取对粪便中坏细菌数和总吲哚含量、以及血中硫酸吲哚酚
浓度的影响的评价
作为所谓坏细菌的大肠菌群、梭菌属菌代谢色氨酸而产生吲哚。吲哚在这 些坏细菌宿主的肝脏被代谢,转变为硫酸吲哚酚。硫酸吲哚酚被认为是代表性 的尿毒素,经由活性氧使作为转录因子的核因子κB(NF-κB)活化,使作为 细胞衰老标记基因的p53和p21表达,引起细胞的老化、纤维化,结果,发生 肾脏、肝脏、脑、心脏等生物体器官功能障碍(NiwaT.等,Am.J.Nephrol.,14(3), 207-212,1994;Niwa T.和Ise M.,J.Lab.Clin.Med.,124(1),96-104,1994)。硫酸 吲哚酚被认为在血中与白蛋白结合,不在尿中被排泄而是在血中积累,从而对 以肾功能为首的、生物体内全部脏器产生不良影响。例如血中硫酸吲哚酚浓度 在健康人中为10μM以下,而在晚期慢性肾功能衰竭患者中最高达到550μM、 平均达到250μM左右(Niwa T.和Ise M.,J.Lab.Clin.Med.,124(1),96-104, 1994)。
此外,上述坏细菌分解蛋白质产生吲哚、粪臭素、苯酚、氨等有害物质, 使肠道内呈碱性。由此产生扰乱肠道内环境、使作为肠道内抗菌物质的防御素 无效等不良影响(广川胜昱,汉方与最新治疗(漢方と最新治療),21(3), 235-242,2012)。进而,被认为是“超坏细菌”的产气荚膜梭菌还分泌使分泌 型免疫球蛋白A(sIg-A)、作为肠道的屏障的粘蛋白层分解的酶,成为各种 疾病的重要原因。
因此,关于实施例1中得到的豆浆开菲尔对粪便中的坏细菌数、坏细菌所 产生的吲哚的量和血中硫酸吲哚酚的量产生什么样的影响,通过以下方法进行 评价。
对粪便中坏细菌数的影响的评价
使用Wistar/ST大鼠(6周龄,雄性),用胃管将调制为20mg/ml的氯化镁 强制给药,引发腹泻,使消化道细菌减少。将便秘倾向的人大便悬浮于生理盐 水,移植至上述大鼠,以此作为人粪便移植大鼠。然后,在100g粉末饲料(CE-2, 日本克莱尔株式会社制)中混合6mg加热灭菌并冻干的豆浆开菲尔而得到饲 料,使每只人粪便移植大鼠摄取10g该饲料(以豆浆开菲尔干燥物计,按 3.3mg/kg体重给药)。人粪便移植大鼠的体重计为180g。作为比较对照,将市 售的原味酸奶(明治保加利亚酸奶)灭菌并冻干后,以同样的方法,以酸奶干 燥物计,按3.3mg/kg体重对人粪便移植大鼠给药。在试验开始时、第15天和 第30天采集粪便,使用选择培养基,测定大肠杆菌和产气荚膜梭菌的数量。 具体而言如下:在1g粪便中加入9ml灭过菌的生理盐水,制作10倍稀释的原 液,使用灭过菌的生理盐水对其进行10倍梯度稀释至104倍,制作稀释液。作 为大肠杆菌用选择培养基,使用去氧胆酸盐琼脂培养基(Merck公司制);作 为产气荚膜梭菌用选择培养基,使用在含卡那霉素的CW琼脂基础培养基(日 水公司制)中添加有10%的50%蛋黄液的培养基;在1ml各梯度稀释液中加 入15ml选择培养基并混悬,37℃培养48小时(对于各梯度稀释液,按n=5 培养)。然后,由各选择培养基上生长的菌落数,算出大肠杆菌和产气荚膜梭 菌在粪便中的数量。其中,产气荚膜梭菌在厌氧条件下培养。将结果示于图3。 由于豆浆开菲尔的摄取,大肠杆菌和产气荚膜梭菌的数量在第15天减少至摄 取前的50%左右。
对粪便中总吲哚含量的影响的评价
关于粪便中的总吲哚,将1g采集自5只人粪便移植大鼠的粪便破碎,放 入Bacto(商标)心浸液肉汤(Heart Infusion Broth)(Becton Dickinson公司制) 培养基,37℃培养,按照保田等的方法(保田正人等,改进的利用对二甲基氨 基苯甲醛的吲哚定量法-II、吲哚简易定量法(p-ヂメチルアミノベンズア ルデヒドによるインドール定量法の変法-II、インドールの簡易定量法), Bulletin of the Faculty of Fisheries,NagasakiUniversity,No.7,pp.101-107,1958) 对培养基中的吲哚量进行定量。即,在50ml培养后的上述培养基中加入0.5ml 硫酸,加入20ml石油醚,利用涡旋器剧烈振荡而提取。在石油醚层中加入40mg 作为显色试剂的对二甲基氨基苯甲醛,室温下一边振荡一边显色。通过离心分离(1,000rpm,10分钟)得到显色层,测定其565nm的吸光度。然后,将吲 哚标准品(和光纯药工业公司制,产品编号:094-00161)以成为浓度10mg/ml 的方式溶解于去离子水,得到标准溶液,将该标准溶液添加至上述培养基而稀 释,对此进行同样的测定,制成吸光度与吲哚量的校准曲线,由制成的校准曲 线对培养上述粪便后培养基中的吲哚量定量,算出粪便中的总吲哚含量。将结 果示于表5。
表5
大鼠 | 摄取物 | 粪便中总吲哚(μg/ml) |
无处理 | - | 0 |
人粪便移植 | - | 83.2 |
人粪便移植 | 豆浆开菲尔 | 8.8 |
人粪便移植 | 原味酸奶 | 76.2 |
人粪便移植大鼠的粪便中总吲哚含量为83.2μg/ml,比较对照的市售酸奶 摄取组为76.2μg/ml,减少了低于10%左右,豆浆开菲尔摄取组中为8.8μg/ml, 减少了90%左右。
对血中总硫酸吲哚酚浓度的影响的评价
关于血中总硫酸吲哚酚,按照使用HPLC的丹羽等的方法(丹羽俊充等, 透析患者的硫酸吲哚酚的动态(透析患者におけるインドキシル硫酸の動態), 透析学会杂志21(10):951-956,1988)进行定量。在上述针对粪便的试验结束时 进行采血,通过常规方法分离血清,通过HPLC分析硫酸吲哚酚。HPLC的分 析条件如下。
HPLC系统:LC-8020(东曹株式会社制)
柱:CAPCELLPAK MGII(内径2.0mm×长度100mm)(株式会社资生堂 制)
柱温:40℃
流动相:0.2M乙酸/三乙胺(pH6.5):异丙醇:四氢呋喃(84:10:6,v/v)
流量:0.20ml/分钟
试样注入量:10μl
检测器:紫外可见检测器(UV-8020,东曹株式会社制)
检测波长:270nm
根据与硫酸吲哚酚钾标准品(由Nacalai tesque株式会社获得,产品编号:19208-04)分析结果的比较,在层析图中鉴定血液试样中的峰。将由来自标 准品和豆浆开菲尔的试样得到的层析图分别示于图2-1和图2-2。
将得到的层析图示于图4-1和图4-2。此外,将血中的总硫酸吲哚酚浓 度(n=5)示于表6。
表6
大鼠 | 摄取物 | 血中总硫酸吲哚酚(μg/ml) |
无处理 | - | 0.5±0.27 |
人粪便移植 | - | 32.6±14.8 |
人粪便移植 | 豆浆开菲尔 | 4.2±3.3 |
人粪便移植 | 原味酸奶 | 35.7±12.1 |
在图4-1和图4-2的层析图中,吲哚硫酸在约8.3分钟洗脱,人粪便移 植大鼠血中总硫酸吲哚酚浓度为32.6μg/ml(约153.0μM)。比较对照的市售酸 奶摄取组中为35.7μg/ml(约167.6μM),未观察到影响,而豆浆开菲尔摄取组 中为4.2μg/ml(约19.7μM),减少了约87%。
由以上结果确认到,通过摄取实施例1中得到的豆浆开菲尔,大肠杆菌、 产气荚膜梭菌等坏细菌数减少,这些菌在宿主肠道内产生的吲哚减少。而且, 通过摄取实施例1中得到的豆浆开菲尔,作为肾脏、肝脏、脑、心脏等生物体 器官功能障碍的原因的宿主体内由吲哚生成的硫酸吲哚酚减少。
此外,大肠杆菌、产气荚膜梭菌等坏细菌数减少,因而提示,通过摄取实 施例1中得到的豆浆开菲尔,还能够预防这些坏细菌引起的其他各种疾病。
Claims (12)
1.一种食品组合物,其含有微生物菌群的大豆来源发酵产物,所述微生物菌群包括乳酸菌群和酵母菌群,所述乳酸菌群包括乳酸杆菌属的至少1种乳酸菌和乳球菌属的至少1种乳酸菌,所述酵母菌群包括酵母菌属的至少1种酵母和克鲁维酵母属的至少1种酵母,所述大豆来源发酵产物含有雌马酚、γ-氨基丁酸和抗菌物质。
2.根据权利要求1所述的食品组合物,乳酸菌群包括专性同型即组I的至少1种、兼性异型即组II的至少1种和专性异型即组III的至少1种乳酸杆菌属乳酸菌。
3.根据权利要求1或2所述的食品组合物,乳酸菌群包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)干酪亚种、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
4.根据权利要求1或2所述的食品组合物,酵母菌群包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、图列茨哈萨克斯坦酵母(Kazachstania turicensis)、单孢哈萨克斯坦酵母(Kazachstania unispora)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
5.根据权利要求1或2所述的食品组合物,大豆来源发酵产物为豆浆发酵产物。
6.根据权利要求1或2所述的食品组合物,抗菌物质不是细菌素。
7.根据权利要求1或2所述的食品组合物,用于预防生物体器官功能障碍导致的疾病或其进展的延迟。
8.根据权利要求7所述的食品组合物,生物体器官功能障碍导致的疾病为肾脏功能障碍导致的疾病、肝脏功能障碍导致的疾病、或脑功能障碍导致的疾病。
9.根据权利要求1或2所述的食品组合物,其为固体。
10.根据权利要求1或2所述的食品组合物,其为液体。
11.权利要求1或2所述的食品组合物在制造用于预防生物体器官功能障碍导致的疾病或延迟其发展的组合物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,生物体器官功能障碍导致的疾病为肾脏功能障碍导致的疾病、肝脏功能障碍导致的疾病、或脑功能障碍导致的疾病。
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