TWI802367B - 可產生雌馬酚的益生菌菌株及其相關應用 - Google Patents

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本發明提出一種可產生雌馬酚的益生菌菌株，其包括：副乾酪乳桿菌PA-88、短雙歧桿菌FL-01、嗜酸乳桿菌AC-69、長雙歧桿菌Gold-01、兩歧雙歧桿菌eq-01、或乳酸乳球菌CO-17。本發明尚提出利用上述益生菌菌株的應用。

Description

可產生雌馬酚的益生菌菌株及其相關應用
本發明攸關一種益生菌菌株，且特別關於一種可產生雌馬酚的益生菌菌株及其相關應用。
雌馬酚(equol)最早於1932年自懷孕母馬的尿液中分離取得，之後陸續於綿羊血清及人體尿液中鑑別出來。雌馬酚屬於一種非類固醇的天然雌性激素，學名4’,7-異黃烷二醇(4’,7-isoflavandiol)。如圖1所示，雌馬酚為大豆苷元(daidzein)的代謝產物，可透過腸內細菌代謝大豆苷元而轉化形成，而大豆苷元主要透過攝取大豆等豆科植物取得。
研究指出非所有的人體內均存在雌馬酚，僅30至50%的人存在雌馬酚，更指出約僅50%的日本人存在雌馬酚，約僅20至30%的歐美人士存在雌馬酚，造成這些個體差異的主因在於飲食內容與體內菌相組成的不同。研究更發現相較大豆苷元，雌馬酚具有更佳的生物活性。除了具備類激素的作用外，雌馬酚更具備抗氧化、免疫調節與保健功能。於體內雌性激素不足時，雌馬酚可扮演雌性激素的促進劑；反之，於體內雌性激素過多時，則可與雌性激素競爭地結合至雌性激素受體，造成降低雌性激素促進之細胞增生的活性，進而降低雌性激素過多造成的疾病發生。雌性激素失衡亦可能會引發疾病，如：乳腺癌、動脈粥狀硬化、骨質疏鬆，而透過雌馬酚與雌性激素受體的結合，則可緩解雌性激素失衡的 問題。目前常利用雌馬酚來緩解女性更年期的不適症狀，如：熱潮紅、失眠、躁動、憂鬱、無力、關節或肌肉疼痛、心悸。
常見之可代謝大豆苷元來產生雌馬酚或其前驅體的細菌種類與菌株如以下表1所列。
Figure 111113809-A0305-02-0003-1
職是之故，尋找新穎且可代謝大豆苷元來產生雌馬酚的微生物確實為本發明所屬技術領域人士積極解決的課題之一。
本發明之一目的在於尋找新穎並可產生雌馬酚的微生物，以提供雌馬酚的生產更多樣化的選擇。
是以，本發明提出一種可產生雌馬酚的益生菌菌株，其包括：副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)PA-88(寄存編號：BCRC 911091)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)FL-01(寄存編號：BCRC 911111)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)AC-69(寄存編號：BCRC 911107)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)Gold-01(寄存編號：BCRC 911109)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidium)eq-01(寄存編號：BCRC 911110)、或乳酸乳球菌(Lactoccus lactics)CO-17(寄存編號：BCRC 911117)。
本發明另提出一種產生雌馬酚的方法，其包括：於大豆苷元或雌馬酚之前驅體的存在下培養上述所有菌株之一或任意組合。
本發明又提出一種上述所有菌株之一或任意組合的用途，其為用於製備產生雌馬酚的食品、飲品、或保健品。
本發明更提出一種可食用的組合物，其包括上述所有菌株之一或任意組合以及大豆苷元或雌馬酚的前驅體。
本發明再提出一種上述組合物的用途，其為用於製備產生雌馬酚的組合物。
圖1為一化學反應式示意圖，說明腸內細菌代謝大豆苷元轉化成雌馬酚的過程；圖2為一薄層色層分析結果圖，呈現雌馬酚與金雀異黃酮的分離，其中藍色箭頭 所指為對應於雌馬酚的條帶，紅色箭頭所指為對應於金雀異黃酮的條帶；以及圖3為一薄層色層分析結果圖，比較不同益生菌菌株將大豆苷元或豆奶轉化成雌馬酚的程度，其中藍色箭頭所指為對應於雌馬酚的條帶，紅色箭頭所指為對應於金雀異黃酮的條帶。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：本發明之第一實施方式提出一種益生菌菌株，其可將大豆苷元轉化成雌馬酚，此菌株包括：副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)PA-88(寄存編號：BCRC 911091)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)FL-01(寄存編號：BCRC 911111)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)AC-69(寄存編號：BCRC 911107)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)Gold-01(寄存編號：BCRC 911109)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidium)eq-01(寄存編號：BCRC 911110)、或乳酸乳球菌(Lactoccus lactics)CO-17(寄存編號：BCRC 911117)。
鑑於上述此等菌株的生物活性，本發明之第二實施方式提出一種產生雌馬酚的方法，此方法包括以下步驟：於大豆苷元或雌馬酚之前驅體的存在下培養此等菌株之一或任意組合。本文所用之「雌馬酚的前驅體」乙詞意指大豆苷元轉化成雌馬酚過程中的中間產物，如圖1所示，例如為二氫大豆苷元(dihydrodaidzein)或四氫大豆苷元(tetrahydrodaidzein)。詳言之，培養時可將此等菌株之一或任意組合培養於一含大豆苷元或雌馬酚之前驅體的基質中，基質的實例可以為但不限於MRS Broth、牛奶、果汁、或豆奶；培養溫度可以為但不限於2至53℃，較佳地為30至40℃，更佳地為30℃；培養時間可以為但不限於 48至120小時，較佳地為60至84小時，更佳地為72小時；培養pH值可以為但不限於4.0至6.2，較佳地為4.3至5.5，更佳地為5.0；此等菌株之一或任意組合於基質的培養起始濃度可以為但不限於1x106至1x108cfu/mL，較佳地為5x106至5x107cfu/mL，更佳地為1x107cfu/mL；於每1克的大豆苷元或雌馬酚之前軀體的存在下，此等菌株之一或任意組合的培養起始總菌株量可以為但不限於5x106至5x108cfu，較佳地為1x107至1x108cfu，更佳地為8x107cfu。
培養後更可自基質萃取取得雌馬酚。詳言之，萃取時可將基質與乙酸乙酯均勻混合，再自所得的混合物分離取得一乙酸乙酯層，之後乾燥乙酸乙酯層取得雌馬酚。基質與乙酸乙酯的體積比可以為但不限於1：(0.1至10)，較佳地為1：(0.5至2)，更佳地為1：1；乾燥可以採用但不限於風乾或熱烘實現，而於採用熱烘的條件下，熱烘溫度可以為但不限於40至65℃，較佳地為45至55℃，更佳地為50℃。
鑑於上述此等菌株的生物活性，本發明之第三實施方式提出一種此等菌株之一或任意組合的用途，此用途為用於製備產生雌馬酚的食品、飲品、或保健品，藉此有此需求的個體可服用之。由於轉化取得雌馬酚須大豆苷元或雌馬酚的前軀體作為起始物，因此服用時、前、及/或後個體體內須存在大豆苷元或雌馬酚的前軀體，但不以此為限，只要大豆苷元或雌馬酚的前軀體與此等菌株之一或任意組合於個體內接觸反應即可。基於雌馬酚的生理功能，所製備的食品、飲品、或保健品至少可治療或預防乳腺癌、動脈粥狀硬化、骨質疏鬆、或女性更年期的不適症狀，如：熱潮紅、失眠、躁動、憂鬱、無力、關節或肌肉疼痛、心悸，但不以此為限。
鑑於上述此等菌株的生物活性，本發明之第四實施方式提出一種 可食用的組合物，此組合物包含此等菌株之一或任意組合以及大豆苷元或雌馬酚的前軀體。具體而言，於每1克的大豆苷元或雌馬酚之前軀體的存在下，此等菌株之一或任意組合的總菌株量可以為但不限於5x106至5x108cfu，較佳地為1x107至1x108cfu，更佳地為8x107cfu。另外，可食用的組合物可以呈食品、飲品或保健品的形式，但不以此為限。此外，除了此等菌株之一或任意組合以及大豆苷元或雌馬酚的前軀體外，可食用的組合物更可包括添加劑，添加劑可以為但不限於酸度調節劑、防結塊劑、抗氧化劑、增積劑、載體、乳化劑、增味劑、包覆劑、保存劑、安定劑、甜味劑、增稠劑、營養添加劑或調味劑。而且，大豆苷元或雌馬酚之前軀體與添加劑之間的重量比可以為但不限於1：(1至5)，較佳地為1：(2至4)。須說明的是，以每日每60公斤人體所須下，可食用的組合物含有總菌株量1x109cfu此等菌株之一或任意組合、12.5克大豆苷元或雌馬酚的前軀體以及37.5克添加劑，但不以此為限。
鑑於上述此等菌株的生物活性，本發明之第五實施方式提出一種上述所提之組合物的用途，此用途為用於製備產生雌馬酚的組合物，藉此有此需求的個體可服用之。所製備的組合物可以呈食品、飲品或保健品的形式，但不以此為限。基於雌馬酚的生理功能，所製備的組合物至少可治療或預防乳腺癌、動脈粥狀硬化、骨質疏鬆、或女性更年期的不適症狀，如：熱潮紅、失眠、躁動、憂鬱、無力、關節或肌肉疼痛、心悸，但不以此為限。
茲以下列實施例例示說明本發明：習知利用高效能液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相層析質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)、或液相層析串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC MS/MS)來定性檢測雌馬酚。然而，於雌馬酚與其他代謝產物(如：大豆苷元或金雀異黃酮(genistein))同時存在下，難以將雌馬酚與其他代謝產物分離區分，而可能干擾檢測結果造成誤判。
取1mg雌馬酚標準品溶解於50μl乙酸乙酯配置成雌馬酚溶液，取1mg金雀異黃酮標準品溶解於50μl乙酸乙酯配置成金雀異黃酮溶液，並取1mg雌馬酚標準品與1mg金雀異黃酮標準品溶解於50μl乙酸乙酯配置成混合溶液。之後，滴定2μL溶液於薄層色層分析片上，揮發後置於展開槽內進行展開，而展開液為三氯甲烷：甲醇=10：1。展開後，以波長254nm觀察薄層色層分析片。
如圖2所示，Lane 1為雌馬酚溶液，Lane 2為金雀異黃酮溶液，Lane 3為混合溶液。由此可知，能透過薄層色層分析將雌馬酚與金雀異黃酮分離區分，而雌馬酚的Rf值為0.33，金雀異黃酮的Rf值為0.28，故薄層色層分析為一套值得信賴之定性檢測雌馬酚的方法。
取5ml之大豆苷元或豆奶基質的菌株發酵液(發酵條件為溫度30℃，時間72小時)至離心管內，並加入5mL乙酸乙酯均勻混合。對所得的混合物高速離心分層取得乙酸乙酯層，再於抽風櫃內以55℃加熱乙酸乙酯層直至乾燥。之後，將乾燥產物溶解於50μL乙酸乙酯供備用。最後，參考上述的薄層色層分析過程對備用液進行分析。
如圖3所示，Lane 1為雌馬酚溶液，Lane 2為金雀異黃酮溶液，Lane 3為純豆奶基質，Lane 4為自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)536菌株發酵液取得的備用液，Lane 5為自副乾酪乳桿菌PA-88菌株發酵液取得的備用液，Lane 6為自短雙歧桿菌FL-01菌株發酵液取得的備用液，Lane 7為自嗜酸乳桿菌AC-69菌株發酵液取得的備用液，Lane 8為自長雙歧桿菌Gold-01菌株發酵液取得的備 用液，Lane 9為自兩歧雙歧桿菌eq-01菌株發酵液取得的備用液，Lane 10為自乳酸乳球菌CO-17菌株發酵液取得的備用液，Lane 11為混合溶液。由此可知，長雙歧桿菌536、副乾酪乳桿菌PA-88、短雙歧桿菌FL-01、嗜酸乳桿菌AC-69、長雙歧桿菌Gold-01、兩歧雙歧桿菌eq-01、及乳酸乳球菌CO-17均可將大豆苷元或豆奶轉化成雌馬酚，且相較已知可產生雌馬酚的菌株長雙歧桿菌536(請見J.Funct.Foods 2012,4,736-745)，副乾酪乳桿菌PA-88、短雙歧桿菌FL-01、嗜酸乳桿菌AC-69、長雙歧桿菌Gold-01、兩歧雙歧桿菌eq-01、及乳酸乳球菌CO-17可產生更多的雌馬酚。
綜上所述，本發明所提的微生物可大量地將大豆苷元或豆奶轉化成雌馬酚，因此極有潛力應用於雌馬酚的生產。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
【生物材料寄存】
1、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2022/01/13 BCRC 911091；2、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2022/02/16 BCRC 911111；3、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2022/02/16 BCRC 911107；4、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2022/02/16 BCRC 911109；5、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2022/02/16 BCRC 911110；6、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2022/03/18 BCRC 911117。

Claims (6)

  1. 一種產生雌馬酚的方法，係包括：於含大豆苷元、二氫大豆苷元、或四氫大豆苷元的基質中培養長雙歧桿菌Gold-01(BCRC 911109)；其中該基質為MRS Broth、牛奶、果汁、或豆奶；其中該培養的溫度為30至40℃；其中該培養的時間為60至84小時；其中該培養的pH值為4.3至5.5；其中該長雙歧桿菌Gold-01於該基質的培養起始濃度為1x106至1x108cfu/mL；其中於每1克該大豆苷元、該二氫大豆苷元、或該四氫大豆苷元存在下，該長雙歧桿菌Gold-01的培養起始總菌株量為1x107至1x108cfu。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該培養的溫度為30℃；該培養的時間為72小時；該培養的pH值為5.0；該長雙歧桿菌Gold-01於該基質的培養起始濃度為1x107cfu/mL；於每1克該大豆苷元、該二氫大豆苷元、或該四氫大豆苷元存在下，該長雙歧桿菌Gold-01的培養起始總菌株量為8x107cfu。
  3. 一種長雙歧桿菌Gold-01(BCRC 911109)用途，係為用於製備產生雌馬酚的食品、飲品、或藥品。
  4. 一種可食用的組合物，係包括：長雙歧桿菌Gold-01(BCRC 911109)；以及大豆苷元、二氫大豆苷元、或四氫大豆苷元。
  5. 如請求項4所述之組合物，其中於每1克該大豆苷元、該二氫大豆苷元、或該四氫大豆苷元的存在下，該長雙歧桿菌Gold-01的總菌株量為1x107至 1x108cfu。
  6. 一種如請求項4或5所述之組合物的用途，係為用於製備產生雌馬酚的組合物。
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期刊 , B MAYO, et al., "Equol: a bacterial metabolite from the daidzein isoflavone and its presumed beneficial health effects", Nutrients, 11, MDPI, 2019: 2231.;期刊 , W ZHENG, et al., "Compositional and functional differences in human gut microbiome with respect to equol production and its association with blood lipid level: a cross-sectional study", Gut Pathog, 11, BMC, 2019: 20. *
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