CN109916690B - 一种幽门螺杆菌染色液及其染色方法 - Google Patents
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Abstract
一种幽门螺杆菌染色液及其染色方法，该染色液由如下原料组成：6‑18mg/mL美蓝，3‑9mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水，以质量体积比mg/mL为单位。本发明将样本组织切片浸入上述幽门螺杆菌染色液中染色＜10s；将染色后的样本切片用流水冲洗，然后依次用95％乙醇、无水乙醇、正丁醇、二甲苯浸泡、脱水，脱水后用中性树胶湿封，得到染色片样本；在显微镜下观察染色片样本中HP，按照《中国慢性胃炎共识意见(2017年，上海)》进行HP诊断判读。本发明用硼酸钠替换硼酸来配制美蓝染液对幽门螺杆菌进行染色，显著缩短染色时间，具有省时省力、菌体颜色深、镜检容易分辨等优势，符合诊断标准。
Description
技术领域
本发明属于生物组织染色领域，具体涉及一种幽门螺杆菌染色液及其染色方法。
背景技术
幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)感染在引起胃炎、胃溃疡、胃癌的发生、发展有一定的相关性。因此HP的早发现早治疗，对预防胃癌的发生有重要意义。美蓝法是临床病理常用的染色法，现有美蓝染液含有美蓝(3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物，又称“亚甲基蓝”)、硼酸。但染色后的HP要在高倍镜下才能观察到针尖大小，美蓝法染色显得偏淡，诊断医师在大量病例检测后眼睛容易疲劳并容易漏诊。
发明内容
本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌染色液及其染色方法，用硼酸钠替换硼酸来配制美蓝染液对幽门螺杆菌进行染色，显著缩短染色时间，具有省时省力、菌体颜色深、镜检容易分辨等优势，符合诊断标准。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种幽门螺杆菌染色液，由如下原料组成： 6-18mg/mL美蓝，3-9mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水，以质量体积比mg/mL 为单位。
优选的，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：10mg/mL美蓝， 5mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水。
优选的，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：6mg/mL美蓝， 3mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水。
优选的，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：18mg/mL美蓝， 9mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水。
优选的，所述硼酸钠为十水合四硼酸钠。
本发明提供的幽门螺杆菌染色液的制备方法包括：按照上述配方称量各原料，向蒸馏水中加入硼酸钠，搅拌至完全溶解，然后加入美蓝，充分搅拌混合后过滤，直接盛入避光密封染色缸，室温保存即可。
本发明的第二方面，提供所述幽门螺杆菌染色液的染色方法，其包括如下步骤：
(1)染色
将样本组织切片浸入上述幽门螺杆菌染色液中染色1～10s；
(2)脱水、湿封
将染色后的样本组织切片用流水冲洗，然后依次用95％乙醇、无水乙醇、正丁醇、二甲苯浸泡、脱水，出二甲苯后用中性树胶湿封。
进一步，在步骤(1)染色之前还包括对样本处理，该样本处理方法包括：将样本组织切片用固定液固定、脱水、包埋、切片、捞片、烘片、脱蜡，得到样本组织切片，均采用常规方法即可。
优选的，步骤(2)中，将染色后的样本切片用流水冲洗后，先用95％乙醇浸泡1～10s，再经过两道无水乙醇浸泡各1～5s，然后经正丁醇浸泡 3-8s，最后经过两道二甲苯浸泡各1-5s，出二甲苯后用中性树胶湿封。
本发明上述步骤(1)染色+步骤(2)脱水、湿封总用时不超过60s (优选不超过40s)。
优选的，本发明提供的幽门螺杆菌染色液的染色方法，包括如下步骤：
(1)样本处理
将样本组织用固定液固定、脱水、包埋、切片、捞片、烘片、脱蜡，得到样本组织切片；
(2)染色
将样本组织切片浸入上述幽门螺杆菌染色液中染色5～10s；
(3)脱水、湿封
将染色后的样本组织切片用流水冲洗掉染色液2s，先用95％乙醇浸泡1～10s，再经过两道无水乙醇浸泡各1～5s，然后经正丁醇浸泡5-8s，最后经过两道二甲苯浸泡各1-5s，出二甲苯后用中性树胶湿封，得到染色片样本。
本发明将湿封后得到的染色片样本在显微镜下观察HP，按照《中国慢性胃炎共识意见(2017年，上海)》进行HP诊断判读：观察胃黏膜黏液层、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮表面的HP。无：特殊染色片上未见HP；轻度：偶见或小于标本全长1/3有少数HP；中度：HP分布超过标本全长1/3而未达2/3或连续性、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度：HP 成堆存在，基本分布于标本全长。
本发明的有益效果：
本发明用硼酸钠替换硼酸配制幽门螺杆菌染色液对幽门螺杆菌样本进行染色，使用该改良后的幽门螺杆菌染色液对幽门螺杆菌进行染色，染色总时间≤60s，使用现有染液进行染色所用总时间＞4min，因此，本发明染色用时大幅缩短，可以让技术员减轻工作负担。同时，本发明研究证实，将样本组织切片放入上述改良后的幽门螺杆菌染色液中浸泡1～10s(优选5～10s)时间范围内，对最终显微镜观察下图像的染色深浅无差异。故也不用担心忘记从染色缸拿出，使浸泡时间过长而导致颜色过深影响判读的问题。而且，染色后有一道95％乙醇浸入10s内就能使过度染色的黏膜黏液层、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮表面脱色，而HP褪色比较轻微忽略不计。
现有染液对幽门螺杆菌样本进行染色后，如果使用95％乙醇后幽门螺杆菌脱色，所以不能用酒精脱水，只能通过烘片等加热的形式脱水，导致显微镜观察到的图像背景常有透明晶体颗粒和褐色色素样细颗粒存在。这是因为组织切片在烘干后还没有封片时，由于巨大的温差导致空气中的湿气和空气快速进入组织细胞的周围和表面，导致在显微镜下看到透明和褐色色素样颗粒样存在，影响显微镜下判读。
HP是革兰氏阴性菌(pH 4-5)，本发明用弱碱性的硼酸钠配制的染色液与HP染色结合牢固，不宜被95％乙醇脱色，因而能依次使用95％乙醇、无水乙醇、正丁醇、二甲苯快速脱水，脱水后直接可用中性树胶湿封，显微镜下观察背景清晰。
本发明研制的改良后染色液及染色方法具有染色省时省力、菌体颜色深、镜检容易分辨等优势，并且已经开始临床使用，在日常临床使用中经反复对比发现，本发明改良后的染色液和现有成熟染色液的判读结果无差异，能满足常规诊断需要。但本发明改良后的染色液和相应的方法具有配置简单、储存便捷、成本低廉、染色时间短、菌体颜色深、镜下容易辨识菌体、眼睛不易疲劳等优点。
附图说明
图1为本发明经实施例1幽门螺杆菌染色液染色后在显微镜下观察到的组织切片效果图。
图2为经对比例1未改良的染液染色后在显微镜下观察到的组织切片效果图。
图3为本发明经实施例2幽门螺杆菌染色液染色后在显微镜下观察到的组织切片效果图。
图4为本发明经实施例3幽门螺杆菌染色液染色后在显微镜下观察到的组织切片效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例
1材料与方法
1.1样本
选取上海市宝山区仁和医院病理科2017年胃镜活检HP阳性确诊病例 3例。
1.2主要试剂及设备
美蓝(亚甲基蓝)、硼酸钠(十水合四硼酸钠)、硼酸：均购于国药集团化学试剂公司)；蒸馏水(本院制剂室)；甲醛溶液；75％乙醇；95％乙醇；无水乙醇；正丁醇；二甲苯；包埋石蜡(68-60℃)；全自动脱水机 (Leica SP300S)；组织包埋机(Leica EG 1150H)；轮转式切片机(Leica 2235)；组织切片展片台；医用烘箱；数字切片扫描仪(江丰KF-PRO-005)。
1.3方法
1.3.1样本处理
取1病例制备2份组织切片，分改良美蓝法(实施例1)和B组未改良美蓝法(对比例1)2组切片，另外2病例各制备1份组织切片分别为实施例2、实施例3。选取的样本经过10％缓冲中性福尔马林常规固定24h，取材后放入脱水机常规脱水、组织包埋机常规包埋、轮转式切片机常规切片、捞片，厚3μm。均按照常规烤箱烤片75℃、30min，常规脱蜡至水备用。
具体的，选取的样本经过10％缓冲中性福尔马林固定24h，取材后放入全自动脱水机常规脱水包括如下步骤：10％福尔马林(甲醛溶液与蒸馏水比是1：9)3h，蒸馏水30min，75％乙醇1.5h，95％乙醇1.5h，无水乙醇 I 1h，无水乙醇II 1h，无水乙醇III 1.5h，二甲苯I 20min，二甲苯II 20min，二甲苯II 30min，包埋石蜡I 1h，包埋石蜡I 1h，包埋石蜡I 1h。
组织包埋机常规包埋包括：组织包埋机内融化的包埋石石蜡注入包埋摸具，然后把前面脱水好的组织放入摸具，注意组织的位置和包埋面。
轮转式切片机常规切片包括如下步骤：包埋组织的蜡块放入-18℃冷冻台预先冷冻，然后再加持在轮转式切片机上切片，厚度3μm，切片用镊子放入展片机进行展片。
捞片包括如下步骤：在组织切片展片台挑选合格的切片用载玻片捞取切片，粘贴于载玻片1/3至2/3处。
烘片包括如下步骤：把捞出的切片使用医用烘箱烘片，温度75℃、时间30min。
常规脱蜡至水包括如下步骤：从烘箱拿出切片，快速依次浸入两道二甲苯各10min，75％乙醇30s，95％乙醇1min，两道无水乙醇各1min，浸入蒸馏水清洗5min、备用。
1.3.2试剂配置
A组(实施例1)：改良组美蓝法试剂：蒸馏水500mL中加入硼酸钠2500mg，搅拌至完全溶解，后加入美蓝5000mg，充分搅拌混合后过滤，直接盛入避光密封染色缸，平时室温保存即可。
B组(对比例1)：未改良组美蓝法试剂：蒸馏水500mL中加入硼酸2500mg，搅拌至完全溶解，后加入美蓝5000mg，充分搅拌混合后过滤，放入4℃医用冰箱保存待用。
实施例2：改良组美蓝法试剂：蒸馏水500mL中加入硼酸钠1500mg，搅拌至完全溶解，后加入美蓝3000mg，充分搅拌混合后过滤，直接盛入避光密封染色缸，平时室温保存即可。
实施例3：改良组美蓝法试剂：蒸馏水500mL中加入硼酸钠4500mg，搅拌至完全溶解，后加入美蓝9000mg，充分搅拌混合后过滤，直接盛入避光密封染色缸，平时室温保存即可。
1.3.3染色步骤
实施例1：A组切片入实施例1改良美蓝染色液中5s→流水洗干净即可2s→95％乙醇浸泡2s→无水乙醇I浸泡1s→无水乙醇II浸泡3s→正丁醇浸泡3s→二甲苯I浸泡2s→二甲苯II浸泡3s→中性树胶湿封2s。 (总用时＜40s)
对比例1：B组切片入未改良美蓝染色液(对比例1)1min→水洗2 s→75℃烘箱烘干3min(不能用95％乙醇)→中性树胶干封2s。(总用时＞4min)。
实施例2：切片入实施例2改良美蓝染色液中10s→流水洗干净即可 2s→95％乙醇浸泡1s→无水乙醇I浸泡1s→无水乙醇II浸泡3s→正丁醇浸泡3s→二甲苯I浸泡1s→二甲苯II浸泡3s→中性树胶湿封2s。(总用时＜40s)
实施例3：切片入实施例3改良美蓝染色液中5s→流水洗干净即可2 s→95％乙醇浸泡10s→无水乙醇I浸泡1s→无水乙醇II浸泡5s→正丁醇浸泡8s→二甲苯I浸泡1s→二甲苯II浸泡5s→中性树胶湿封2s。(总用时＜40s)
1.4显微镜观察HP判读标准
按照《中国慢性胃炎共识意见(2017年，上海)》进行HP诊断判读：观察胃黏膜黏液层、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮表面的HP。无：特殊染色片上未见HP；轻度：偶见或小于标本全长1/3有少数HP；中度： HP分布超过标本全长1/3而未达2/3或连续性、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度：HP成堆存在，基本分布于标本全长(中华医学会消化病学分会.中国慢性胃炎共识意见(2017年,上海)[J].胃肠病学,2017,22(11):678)。
2结果
实施例1-3及对比例1经10×40倍显微镜下观察，并用数字切片扫描仪扫描整张切片在观察。显色结果：
A组(实施例1)HP显色深蓝色，菌体显示粗大，背景清晰(参见表 1，图1)。B组(对比例1)HP显色蓝色，背景常有透明晶体颗粒和褐色色素样细颗粒存在(参见表1，图2)。
实施例2中HP显色深蓝色，菌体显示粗大，背景清晰(参见表1，图3)。
实施例3中HP显色，深蓝色，菌体显示粗大，背景清晰(参见表1，图4)。
表1实施例与对比例染液染色结果对比分析表
临床试验：
选取上海市宝山区仁和医院病理科2017年胃镜活检HP阳性确诊病例 50例。每个病例制备2份组织切片，分改良美蓝法和未改良美蓝法两组切片。
用实施例1及对比例1两种染色液进行染色，高倍显微镜下判读结果： 50例HP阳性确诊病例使用对比例1未改良美蓝法判读结果为，轻度28 例、中度17例、重度5例。使用实施例1改良美蓝染色法判读结果为，轻度27例、中度18例、重度5例。其中实施例1改良法HP轻度少1例， HP中度多1例。在统计学上没有意义，故两种染色法判读无差异性。原因可能是由于组织经过深切后，多个面染色，HP数量增多。由此证实：本发明提供的染色液配制及染色方法能满足常规诊断需要，同时具有配置简单、储存便捷、成本低廉、染色时间短、菌体颜色深、镜下容易辨识菌体、眼睛不易疲劳等优点。
Claims (7)
1.一种幽门螺杆菌的染色方法，包括如下步骤：
步骤1：染色
将样本组织切片浸入幽门螺杆菌染色液进行染色，染色时间为1～10s，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：6-18mg/mL美蓝，3-9mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水，以质量体积比mg/mL为单位；
步骤2：脱水、湿封
将染色后的样本组织切片用流水冲洗，然后依次用95％乙醇、无水乙醇、正丁醇、二甲苯浸泡、脱水，脱水后用中性树胶湿封。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的染色方法，其特征在于，在步骤1染色之前还包括对样本处理，包括：将样本组织切片用固定液固定、脱水、包埋、切片、捞片、烘片、脱蜡。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的染色方法，其特征在于，步骤2中，将染色后的样本切片用流水冲洗后，用95％乙醇浸泡1～10s，再经过两道无水乙醇浸泡各1～10s，然后经正丁醇浸泡5～10s，最后经过两道二甲苯浸泡各5～10s，出二甲苯后用中性树胶湿封。
4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的染色方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：10mg/mL美蓝，5mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的染色方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：6mg/mL美蓝，3mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的染色方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌染色液由如下原料组成：18mg/mL美蓝，9mg/mL硼酸钠，其余为蒸馏水。
7.根据权利要求1-6任一项所述的幽门螺杆菌的染色方法，其特征在于，所述硼酸钠为十水合四硼酸钠。
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