CN109824583A - 一种苯基草酰胺类hiv-1抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苯基草酰胺类HIV‑1抑制剂及其制备方法和应用，所述化合物具有式I所示的结构。本发明还涉及含有式I结构化合物的药物组合物。本发明还提供上述化合物以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种苯基草酰胺类HIV-1抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术
艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是主要由人免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)引起的危害人类生命健康的重大传染性疾病。在临床上，以多种药物联合应用为特征的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)成为目前艾滋病防治的主要手段。但由于HIV-1高变异性而导致的耐药性问题，以及长期大量用药带来的严重的毒副作用及并发症，极大限制了其临床应用。因此，急需研发针对新靶标的抗HIV-1药物。HIV-1在人免疫细胞中的复制周期包括吸附、融合、逆转录、整合、表达和组装等环节。其中，病毒吸附是HIV-1感染宿主细胞的第一步，此环节是HIV-1通过病毒表面的gp120糖蛋白与宿主细胞表面CD4蛋白特异性结合，识别和靠近宿主细胞。因此，干扰gp120与CD4相互作用的gp120抑制剂与可以达到抑制病毒的目的。
NBD-556、NBD-557和JRC-II-191是通过数据库筛选发现的苯基草酰胺类gp120-CD4相互作用抑制剂，属于CD4模拟小分子(Small-molecule CD4 mimics，SMCMs)，功能与可溶性CD4(sCD4)类似，结合到gp120上保守的“Phe43口袋”，与gp120作用形成不稳定的构象，进而转变为无功能的构象，阻止与CD4的结合。该类抑制剂有明确的结合模式，构效关系明确，结构相对简单，有很大的改造空间。目前该类抑制剂存在一定的耐药性，且抗病毒活性有待提高。因此，研发高效低毒、抗耐药的新型苯基草酰胺类gp120抑制剂是目前抗艾滋病药物研究的热点之一。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种苯基草酰胺类HIV-1抑制剂及其制备方法，本发明还提供上述化合物作为HIV-1抑制剂的活性筛选结果及其应用。
本发明的技术方案如下：
1.苯基草酰胺类HIV-1抑制剂
一种苯基草酰胺类HIV-1抑制剂，或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有通式I所示的结构：
其中，
R1为：NO2、CF3或者OCH3；
R2为：OCH3、OH、NH2、胍基、脂肪胺、芳香胺或取代苯环、取代萘环、各种含氮的六元杂环、各种含氮的五元杂环。
根据本发明优选的，R2为OCH3、OH、NH2、胍基、吡咯环、哌嗪环、哌啶环、吗啉环、咪唑环、吡唑环或吡啶环。
进一步优选的，苯基草酰胺类HIV-1抑制剂是下列化合物之一：
本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19页。
本发明中所述的“前药”是指药学上可接受的衍生物，以便这些衍生物所得的生物转换产物是如式I化合物所定义的活性药物。
2.苯基草酰胺类HIV-1抑制剂的制备方法
苯基草酰胺类HIV-1抑制剂的制备方法，包括步骤：以各种对位取代的苯甲醛1为起始原料，在乙醇溶液中与丙二酸、醋酸铵经克脑文盖尔缩合反应生成中间体2，然后中间体2经酯化反应生成中间体3；同时，以4-氯-3氟苯胺4为起始原料，与草酰氯单乙酯反应生成中间体5，之后水解得到中间体6，中间体6与中间体3进行缩合反应得到中间体7，水解脱去甲酯得到中间体8，最后与盐酸胍或氨基取代的五元或六元杂环进行缩合反应得到目标产物I；
反应路线：
试剂及条件：(i)丙二酸，醋酸铵，乙醇，78℃；(ii)氯化亚砜，甲醇，70℃；(iii)草酰氯单乙酯，碳酸钾，二氯甲烷，室温；(iv)氢氧化钠，乙醇:水＝1:1，室温；(v)中间体3，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸，三乙胺，二氯甲烷，室温；(vi)氢氧化钠，四氢呋喃:水＝1:1，室温；(vii)盐酸胍或氨基取代的五元或六元杂环，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，二氯甲烷，室温。
R1、R2同上述通式I所示。
所述的氨基取代的五元或六元杂环为吡啶环、N-甲基哌啶环、咪唑环、1,2,4-三氮唑环。
本发明所述的室温为20-30℃。
3.苯基草酰胺类HIV-1抑制剂的抗HIV-1野生株活性及应用
本发明对按照上述方法合成的部分苯基草酰胺类衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1(NL4-3)活性筛选，以NBD-556为阳性对照。它们的抗HIV-1活性和毒性数据列于表1。
由表1可以看出，本发明的部分苯基草酰胺类化合物表现出了良好的抑制HIV-1病毒活性。其中，化合物LL-2和LL-12活性较为突出，对HIV-1病毒株的EC50值分别为1.90和3.27μM，均优于先导化合物NBD-556(EC50＝3.61μM)。LL-2和LL-12亦表现出了较高的安全性，在活性测试浓度下均未对细胞产生毒性作用(CC50值大于40μM)。因此该类苯基草酰胺类化合物具有进一步研发价值，可作为抗HIV-1的先导化合物加以利用。
本发明的苯基草酰胺类化合物可作为HIV-1抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的苯基草酰胺类HIV-1抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明提供了结构全新的苯基草酰胺类HIV-1抑制剂及其制备方法，本发明还提供了化合物抗HIV-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的苯基草酰胺类衍生物可作为HIV-1抑制剂应用并具有很高的应用价值。
具体实施方式
通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
实施例中所涉及的合成路线如下：
实施例1：N1-(4-氯-3-氟苯基)-N2-(1-(4-硝基苯基)-3-氧代-3-(吡啶-4-氨基)丙基)草酰胺(LL-1)的制备
称取对硝基苯甲醛(1g,6.6mmol)，丙二酸(0.69g,6.6mmol)与醋酸铵(1.02g,13.2mmol)溶于30mL无水乙醇中，回流反应24h，过滤，甲醇洗涤3次，真空干燥箱干燥，得到淡黄色固体粗品即为化合物10a，收率22％，熔点225-228℃。
称取化合物10a(0.50g,2.4mmol)溶于10mL甲醇中，在冰浴条件下，将氯化亚砜(0.52mL,0.85g,7.2mmol)缓慢滴加至此烧瓶中，0.5h后撤冰，回流反应6h。待反应液冷却到室温后，浓缩反应液，乙酸乙酯(50mL)溶解后，饱和碳酸氢钠溶液(20mL×2)和饱和氯化钠溶液(20mL)依次洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后硅胶柱色谱分离得到淡黄色油状产物11a，收率97％，沸点>300℃。
称取4-氯-3-氟苯胺(0.50g,3.4mmol)，无水碳酸钾(0.95g,6.9mmol)溶于20mL二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加草酰氯单乙酯(0.37mL,0.44g,3.4mmol)，滴加完毕后撤离冰浴，室温搅拌7h。反应完毕后，用水(15mL×2)和饱和氯化钠溶液(15mL)依次洗涤反应液，分取有机层，无水硫酸钠干燥，得到白色针状化合物13粗品。收率95％，熔点215-219℃。
称取化合物13(0.40g,1.6mmol)于水:乙醇＝1:1的混合溶液(水、乙醇各8mL)中，加入氢氧化钠固体(0.13g,3.2mmol)，室温搅拌2h。然后向反应液中加入1mol/LHCl溶液将反应液pH值调至5，有白色固体析出，过滤后将滤饼干燥，得白色粗品中间体14，直接用于下一步。收率98％，熔点258-262℃。
称取化合物14(1.0g,4.6mmol)，化合物11a(1.03g,4.6mmol)，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(1.62g,5.0mmol)，三乙胺(1.28mL,0.93g,9.2mmol)溶于30mL二氯甲烷中，室温搅拌过夜。反应完毕后，用1mol/L盐酸(15mL)，5％碳酸氢钠溶液(15mL)，饱和食盐水(15mL)一次洗涤反应液，分取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后硅胶柱色谱分离得到淡黄色固体15a。收率88％，熔点213-215℃。
称取化合物15a(1.27g,3.0mmol)于水:四氢呋喃＝1:1的混合溶液(水、四氢呋喃各10mL)中，加入氢氧化钠固体(0.12g,3.0mmol)，室温搅拌2h。然后向反应液中加入1mol/LHCl溶液将反应液pH值调至5，有淡黄色色固体析出，过滤后将滤饼干燥，得淡黄色粗品中间体16a，直接用于下一步。收率97％，熔点249-251℃。
称取化合物将16a(0.2g,0.49mmol)、4-氨基吡啶(0.046g,0.49mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.19g,0.50mmol)溶于乙腈(15mL)中，然后向溶液中加入三乙胺(135μL,0.98mmol)。室温下搅拌过夜，反应完全后浓缩蒸干。二氯甲烷(50mL)溶解后，水(2×20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后用硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯/石油醚中重结晶得到目标产物LL-1。
产物为黄色固体，收率72％，熔点202-205℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.45(s,1H,N1-NH),8.66-8.52(m,4H,pyridine-H),8.45(s,1H,N2-NH),8.06(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.87(s,1H,NH),7.70-7.58(m,5H),5.20(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),2.74-2.64(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ163.0,162.5,161.7,152.4,149.9,145.6,135.6,130.6,123.4,122.5,121.8,116.5,116.3,109.1,52.1,48.4.ESI-MS:m/z 486.3(M+1).C22H17ClFN5O5(485.1).
实施例2：目标产物LL-(2-5)的制备
称取化合物将16a(0.2g,0.49mmol)、氨基取代杂环(0.49mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.19g,0.50mmol)溶于乙腈(15mL)中，然后向溶液中加入三乙胺(135μL,0.98mmol)。室温下搅拌过夜，反应完全后浓缩蒸干。二氯甲烷(50mL)溶解后，水(2×20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后用硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯/石油醚中重结晶得到目标产物LL-(2-5)。
以不同的氨基取代杂环和16a用上述方法分别制得化合物LL-(2-5)的目标产物，结果如下：
操作同上，所不同的是使用N-甲基-4-氨基哌啶。
产物为淡黄色固体，收率：74％，熔点208-211℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.64(s,1H,N1-NH),8.88(s,1H,N2-NH),8.18(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),8.14(s,1H,NH),7.69-7.49(m,5H),5.23(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.60(t,J＝7.0Hz,1H),2.51-2.41(m,4H),2.18(S,3H,CH3),1.76-1.62(m,6H).13CNMR(100MHz,DMSO):δ163.0,162.5,161.7,149.9,145.6,135.6,130.6,123.4,122.5,121.8,116.5,116.3,53.5,55.0,47.8,42.8,40.3.ESI-MS:m/z 506.3(M+1).C23H25ClFN5O5(505.2).
操作同上，所不同的是使用4-氨基哌啶。
产物为淡黄色固体，收率：46％，熔点227-229℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.56(s,1H,N1-NH),9.10(s,1H,N2-NH),8.43(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),8.12(s,1H,NH),7.72-7.48(m,5H),5.48(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.53(t,J＝7.0Hz,1H),3.28(s,1H,piperidine-NH),2.52-2.38(m,4H),1.82-1.64(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ173.0,168.5,161.7,147.9,146.2,134.6,132.8,122.3,121.5,120.4,119.6,114.3,53.4,51.2,45.3,42.3.ESI-MS:m/z 506.3(M+1).C23H17ClF4N4O3(508.1).
操作同上，所不同的是使用2-氨基咪唑。
产物为淡黄色固体，收率：78％，熔点221-223℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.80(s,1H,imidazole-NH),10.77(s,1H,N1-NH),8.79(s,1H,N2-NH),8.26(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.83(s,1H,NH),7.73-7.59(m,5H),7.08(d,J＝7.2Hz,2H),4.56(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),2.76-2.68(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ169.2,168.7,163.5,153.9,151.8,148.1,146.6,127.8,123.4,122.5,121.8,116.5,116.3,109.1,54.4,49.2.ESI-MS:m/z 475.2(M+1).C20H16ClFN6O5(474.1).
操作同上，所不同的是使用3-氨基-1,2,4-三氮唑。
产物为淡黄色固体，收率：78％，熔点229-232℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.38(s,1H,imidazole-NH),10.75(s,1H,N1-NH),8.59(s,1H,N2-NH),8.17(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.92(s,1H,NH),7.74-7.51(m,5H),7.43(s,1H),5.02(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),2.81-2.72(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ171.4,168.3,163.2,153.9,151.8,150.2,146.3,124.3,122.8,122.3,121.5,117.5,115.3,110.2,53.9,44.3.ESI-MS:m/z 476.2(M+1).C19H15ClFN7O5(475.1).
实施例3：目标产物LL-(7-11)的制备
称取对三氟甲基苯甲醛(1.15g,6.6mmol)，丙二酸(0.69g,6.6mmol)与醋酸铵(1.02g,13.2mmol)溶于30mL无水乙醇中，回流反应24h，过滤，甲醇洗涤3次，真空干燥箱干燥，得到淡黄色固体粗品即为化合物10b，收率46％，熔点230-232℃。
以化合物10b为原料用合成LL-(1-5)的方法分别制得化合物LL-(7-11)的目标产物，结果如下：
操作同上，所不同的是使用4-氨基吡啶。
产物为白色固体，收率：80％，熔点231-234℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.60(s,1H,N1-NH),8.56-8.69(m,4H,pyridine-H),8.47(s,1H,N2-NH),8.10(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.85(s,1H,NH),7.73-7.54(m,5H),5.22(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),2.63-2.78(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ164.2,160.5,158.3,150.4,147.9,146.6,134.6,130.6,123.4,122.9 122.0,119.7,114.5,114.1,106.2,50.8,47.4.ESI-MS:m/z 509.9(M+1).C23H17ClF4N4O3(508.9).
操作同上，所不同的是使用N-甲基-4-氨基哌啶。
产物为白色固体，收率：78％，熔点215-217℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.62(s,1H,N1-NH),8.90(s,1H,N2-NH),8.23(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),8.12(s,1H,NH),7.70-7.52(m,5H),5.24(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.60(t,J＝7.0Hz,1H),2.40-2.50(m,4H),2.19(S,3H,CH3),1.60-1.78(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ163.0,162.5,161.7,149.9,145.6,135.6,130.6,124.2,123.4,122.5,121.8,116.5,116.3,53.5,55.0,47.8,42.8,40.3.ESI-MS:m/z 529.3(M+1).C24H25ClF4N4O3(528.2).
操作同上，所不同的是使用4-氨基哌啶。
产物为白色固体，收率：52％，熔点233-235℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.65(s,1H,N1-NH),8.93(s,1H,N2-NH),8.20(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),8.14(s,1H,NH),7.81-7.64(m,5H),5.20(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.62(t,J＝7.0Hz,1H),2.53-2.41(m,4H),2.37(s,1H,piperidine-NH),1.70-1.58(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ163.0,162.5,161.7,149.9,145.6,135.6,130.6,124.2,123.4,122.5,121.8,116.5,116.3,53.5,55.0,47.8,42.8,40.3.ESI-MS:m/z 515.4(M+1).C23H23ClF4N4O3(514.1).
操作同上，所不同的是使用2-氨基咪唑。
产物为淡黄色固体，收率：73％，熔点219-222℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.76(s,1H,imidazole-NH),10.21(s,1H,N1-NH),8.53(s,1H,N2-NH),8.22(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.83(s,1H,NH),7.76-7.58(m,5H),7.23(d,J＝7.2Hz,2H),5.41(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),2.74-2.58(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ173.2,172.7,164.5,153.8,153.4,146.8,144.6,127.3,126.4,122.9,122.1,114.2,113.8,112.1,59.6,57.5,46.3.ESI-MS:m/z 498.1(M+1).C21H16ClF4N5O3(497.1).
操作同上，所不同的是使用3-氨基-1,2,4-三氮唑。
产物为白色固体，收率：74％，熔点233-234℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.83(s,1H,imidazole-NH),10.15(s,1H,N1-NH),8.41(s,1H,N2-NH),8.17(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.80(s,1H,NH),7.74-7.52(m,5H),7.21(s,1H),5.33(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),2.72-2.63(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ171.9,170.7,163.6,152.5,151.4,148.3,148.1,130.2,127.1,123.6,122.5,115.2,114.3,111.6,56.9,52.3,48.4.ESI-MS:m/z 499.2(M+1).C20H15ClF4N6O3(498.1).
实施例3：目标产物LL-(13-17)的制备
称取对甲氧基苯甲醛(0.90g,6.6mmol)，丙二酸(0.69g,6.6mmol)与醋酸铵(1.02g,13.2mmol)溶于30mL无水乙醇中，回流反应24h，过滤，甲醇洗涤3次，真空干燥箱干燥，得到淡黄色固体粗品即为化合物10c，收率69％，熔点212-215℃。
以化合物10c为原料用合成LL-(1-5)的方法分别制得化合物LL-(13-17)的目标产物，结果如下：
操作同上，所不同的是使用4-氨基吡啶。
产物为白色固体，收率：84％，熔点217-219℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.58(s,1H,N1-NH),8.78-8.53(m,4H,pyridine-H),8.45(s,1H,N2-NH),7.83(s,1H,NH),7.65(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.57-7.44(m,5H),5.20(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.77(s,3H,OCH3),2.72-2.61(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ163.2,161.8,156.3,150.8,145.3,144.2,134.6,131.8,123.4,121.3,120.5,119.8,113.5,112.4,105.4,56.5,50.8,47.4.ESI-MS:m/z 571.3(M+1).C23H17ClF4N4O3(470.1).
操作同上，所不同的是使用N-甲基-4-氨基哌啶。
产物为白色固体，收率：82％，熔点204-207℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.78(s,1H,N1-NH),8.81(s,1H,N2-NH),8.15(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),8.13(s,1H,NH),7.73-7.53(m,5H),5.20(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.81(s,3H,OCH3),3.60(t,J＝7.0Hz,1H),2.55-2.35(m,4H),2.13(S,3H,CH3),1.75-1.62(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ163.0,162.5,161.7,149.9,145.6,135.6,130.6,123.4,122.5,121.8,116.5,116.3,56.2,55.0,53.5,47.8,42.8,40.3.ESI-MS:m/z 491.3(M+1).C24H28ClFN4O4(490.2).
操作同上，所不同的是使用4-氨基哌啶。
产物为白色固体，收率：54％，熔点220-223℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.27(s,1H,N1-NH),8.93(s,1H,N2-NH),8.37(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),8.10(s,1H,NH),7.64-7.48(m,5H),5.18(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.77(s,3H,OCH3),3.54(t,J＝7.0Hz,1H),2.49-2.38(m,4H),2.13(S,3H,CH3),1.73-1.62(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ164.2,163.4,161.8,147.6,145.9,138.4,132.7,126.2,123.5,122.1,114.3,116.3,55.2,54.0,51.7,45.8,42.8.ESI-MS:m/z 476.3(M+1).C23H26ClFN4O4(476.2).
操作同上，所不同的是使用2-氨基咪唑。
产物为淡黄色固体，收率：68％，熔点210-212℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.76(s,1H,imidazole-NH),10.53(s,1H,N1-NH),8.47(s,1H,N2-NH),7.90(s,1H,NH),7.72(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.68-7.51(m,5H),7.01(d,J＝7.2Hz,2H),5.15(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.74(s,3H,OCH3),2.73-2.58(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ174.2,171.5,162.3,159.8,158.6,148.5,143.3,127.3,126.4,122.9,122.1,118.1,114.3,112.0,62.4,57.9,45.1.ESI-MS:m/z 460.4(M+1).C21H19ClFN5O4(459.1).
操作同上，所不同的是使用3-氨基-1,2,4-三氮唑。
产物为白色固体，收率：78％，熔点221-223℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.14(s,1H,imidazole-NH),10.77(s,1H,N1-NH),8.54(s,1H,N2-NH),7.90(s,1H,NH),7.82(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.66-7.53(m,5H),6.88(s,1H),5.34(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.62(s,3H,OCH3),2.75-2.59(m,2H).13CNMR(100MHz,DMSO):δ173.1,172.6,162.7,159.3,158.1,149.8,146.1,125.2,125.0,122.7,122.3,116.9,114.7,112.2,62.1,58.3,48.1.ESI-MS:m/z 461.3(M+1).C20H18ClFN6O4(460.1).
实施例4：N1-(4-氯-3-氟苯基)-N2-(3-胍基-1-(4-硝基苯基)-3-氧代丙基)草酰胺(LL-6,LL-12,LL-18)的制备
称取甲醇钠(0.23g,4.2mmol)，盐酸胍(0.40g,4.2mmol)溶于10mL甲醇中，室温搅拌0.5h后过滤除去白色不溶物，将滤液减压蒸干后，称取化合物16a(0.6g,1.4mmol)，N,N'-羰基二咪唑(0.23g,1.4mmol)于另一烧瓶，用N,N-二甲基甲酰胺:二氧六环＝1:1(N,N-二甲基甲酰胺，二氧六环各8mL)混合溶剂溶解，室温搅拌2h后，加入之前减压蒸干的胍，室温搅拌5h。浓缩反应液，加入20mL乙酸乙酯溶解，用5％碳酸氢钠溶液(12mL×2)，饱和食盐水(12mL)依次洗涤，分取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后硅胶柱色谱分离得到目标产物N1-(4-氯-3-氟苯基)-N2-(3-胍基-1-(4-硝基苯基)-3-氧代丙基)草酰胺(LL-6)。
产物为棕色固体，收率35％，熔点238-241℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.25(s,1H,N1-NH),8.76(s,1H,N2-NH),8.18(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.75(s,1H,guanidine-NH),7.53-7.32(m,5H),6.77(s,2H,guanidine-NH2),5.39(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.71(s,1H,guanidine-NH),2.70-2.54(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ170.1,169.3,164.8,153.7,146.2,144.0,127.8,126.4,123.2,122.0,113.2,112.5,112.3,58.3,54.2,45.6.ESI-MS:m/z 498.1(M+1).C21H16ClF4N5O3(497.1).
分别以化合物16b,16c为原料用合成LL-6的方法分别制得化合物LL-12,LL-18的目标产物，结果如下：
操作同上，所不同的是使用16b为原料。
产物为白色固体，收率：39％，熔点229-231℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.18(s,1H,N1-NH),8.51(s,1H,N2-NH),8.20(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.83(s,1H,guanidine-NH),7.71-7.59(m,5H),6.68(s,2H,guanidine-NH2)5.38(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.83(s,1H,guanidine-NH),2.71-2.53(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO):δ171.1,170.5,163.4,158.7,149.6,144.5,127.1,126.5,122.0,118.7,114.4,113.2,112.8,61.5,54.2,48.1.ESI-MS:m/z 474.2(M+1).C19H16ClF4N5O3(473.1).
操作同上，所不同的是使用16c为原料。
产物为白色固体，收率：42％，熔点222-224℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.48(s,1H,N1-NH),8.52(s,1H,N2-NH),7.81(s,1H,guanidine-NH),7.76(d,J＝7.5Hz,2H,C2,C6-Ph’-H),7.68-7.53(m,5H),5.08(t,J＝7.0Hz,1H,N2-CH),3.91(s,1H,guanidine-NH),3.78(s,3H,OCH3),2.71-2.57(m,2H).13CNMR(100MHz,DMSO):δ168.7,167.4,163.2,158.7,158.2,148.9,141.3,126.5,125.7,130.2,124.1,119.2,115.6,112.5,60.8,58.2,48.9.ESI-MS:m/z 436.3(M+1).C19H19ClFN5O4(435.1).
实施例5：目标化合物的体外抗HIV活性测试实验及细胞毒性实验
体外抗HIV活性测试实验方法：
以单轮病毒感染TZM-bl细胞后荧光素酶基因表达水平的降低程度来测定化合物对HIV-1感染的抑制活性。简言之，在不同浓度的化合物(LL-(1-18)及NBD-556)存在下，使用200TCID50的病毒(NL4-3)感染TZM-bl细胞。感染2天后，移除培养液，并向每孔中加入100μL Bright Glo试剂(Promega，San Luis Obispo，CA)再使用Victor 2光度计检测其荧光活性。化合物抑制HIV-1菌株的有效浓度(EC50)定义为与病毒对照孔相比导致荧光素酶活性(相对光单位)降低50％的浓度。活性结果如表1所示。
细胞毒性实验方法：
使用CytoTox-GloTM荧光细胞毒性试剂盒(购自Promega)测定合成化合物的细胞毒性。与抗HIV-1活性试验平行测定，TZM-bl细胞在不同浓度的化合物(LL-(1-18)及NBD-556)的存在下培养1天。然后根据试剂盒要求的操作步骤，确定所测试目标化合物的细胞毒性(CC50)，即目标化合物使细胞生存率降低50％时所需的浓度。活性结果如表1所示。
表1.部分苯基草酰胺类化合物抗HIV-1活性与毒性结果
aEC50:抑制50％的病毒诱导的致细胞突变效应的化合物浓度或保护50％感染病毒的细胞免于细胞病变的化合物浓度。
bCC50：使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度。
Claims (7)
1.一种苯基草酰胺类HIV-1抑制剂，或其药学上可接受的盐、酯或前药，其特征在于，具有通式I所示的结构：
其中，
R1为：NO2、CF3或者OCH3；
R2为：OCH3、OH、NH2、胍基、脂肪胺、芳香胺或取代苯环、取代萘环、各种含氮的六元杂环、各种含氮的五元杂环。
2.如权利要求1所述的苯基草酰胺类HIV-1抑制剂，其特征在于，R2为OCH3、OH、NH2、胍基、吡咯环、哌嗪环、哌啶环、吗啉环、咪唑环、吡唑环或吡啶环。
3.如权利要求1或2所述的苯基草酰胺类HIV-1抑制剂，其特征在于是下列化合物之一：
4.如权利要求1或2所述的苯基草酰胺类HIV-1抑制剂的制备方法，以各种对位取代的苯甲醛1为起始原料，在乙醇溶液中与丙二酸、醋酸铵经克脑文盖尔缩合反应生成中间体2，然后中间体2经酯化反应生成中间体3；同时，以4-氯-3氟苯胺4为起始原料，与草酰氯单乙酯反应生成中间体5，之后水解得到中间体6，中间体6与中间体3进行缩合反应得到中间体7，水解脱去甲酯得到中间体8，最后与盐酸胍或氨基取代的五元或六元杂环进行缩合反应得到目标产物I；
反应路线：
试剂及条件：(i)丙二酸，醋酸铵，乙醇，78℃；(ii)氯化亚砜，甲醇，70℃；(iii)草酰氯单乙酯，碳酸钾，二氯甲烷，室温；(iv)氢氧化钠，乙醇:水＝1:1，室温；(v)中间体3，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸，三乙胺，二氯甲烷，室温；(vi)氢氧化钠，四氢呋喃:水＝1:1，室温；(vii)盐酸胍或氨基取代的五元或六元杂环，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，二氯甲烷，室温；
R1、R2同权利要求1或2中通式I所示。
5.如权利要求4所述的苯基草酰胺类HIV-1抑制剂的制备方法，其特征在于，所述的氨基取代的五元或六元杂环为吡啶环、N-甲基哌啶环、咪唑环、1,2,4-三氮唑环。
6.一种如权利要求1-3任一项所述苯基草酰胺类HIV-1抑制剂在制备治疗和预防艾滋病药物中的应用。
7.一种抗HIV药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
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