CN103396351B - 吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂化合物及其制备、药物组合物与制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂化合物及其制备、药物组合物与制药用途。该化合物具有通式I的结构，本发明还提供该化合物的制备方法。活性筛选实验显示该化合物对Bcl-2抗凋亡蛋白成员和多种肿瘤细胞增殖具有抑制活性，可用于制备治疗Bcl-2抗凋亡蛋白成员过表达导致疾病的药物。本发明还涉及含有式I化合物的药物组合物及其制药用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂化合物及其制备、药物组合物与制药用途，属于医药技术领域。
背景技术
Bcl-2(B-cell lymphoma-2)家族蛋白是目前已知的细胞凋亡中最重要的调控因子，在细胞凋亡通路中起着重要的调节作用（Youle,R.;Strasser,A.,Nature Reviews Molecular CellBiology,2008,9,47-59）。现在哺乳动物体内已经发现超过25个Bcl-2蛋白家族成员。这些成员可以根据其同源结构域及在细胞凋亡中的功能分为两个亚家族（Youle,R.;Strasser,A.,Nature Reviews Molecular Cell Biology,2008,9,47-59.），一个叫做抗凋亡蛋白家族，是细胞生长所必须，包括Bcl-2,Bcl-xL,Mcl-1,Al,Bcl-w,Bcl-RAMBO和Boo。这个亚家族的蛋白成员（除了A1和Mcl-1）一般有四个保守的同源区域，命名为BH1,BH2,BH3,和BH4区域。另一个亚家族叫做促凋亡蛋白家族，可以根据其结构分为两个亚型，一个亚型包括Bax,Bak,Bcl-xS,Bok/Mtd和Bcl-GL，含有2-3个保守区域；另一个亚型，叫做BH3-only蛋白，只有一个保守的BH3区域(Chittenden,T.,Cancer Cell,2002,2,(3),165-166.)。BH3-only蛋白被认为在哺乳动物细胞凋亡中起到关键的调节作用(Du,H.;et al.Journal of BiologicalChemistry,2011,286,(1),491)。Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员的蛋白表面有一个疏水凹槽，是其与促凋亡成员相互作用的结合位点。
Bcl-2蛋白家族的抗凋亡成员与促凋亡成员相互作用共同调节细胞凋亡。在正常的细胞中，促凋亡家族蛋白Bax/Bak和抗凋亡家族蛋白结合成二聚体，使细胞保持正常生长状态，既避免细胞过早凋亡又避免细胞因不发生凋亡而转化为肿瘤细胞(Tsujimoto,Y.,Journal ofCellular physiology,2003,195,(2),158-167)。当细胞接受凋亡信号之后，一些BH3-only蛋白竞争性与Bcl-2抗凋亡成员的疏水结合域相结合，释放出被抑制的Bax和Bak蛋白。此后，另一些BH3-only蛋白可直接与Bax/Bak蛋白相互作用使其活化。活化的Bax和Bak蛋白在线粒体外膜上发生寡聚化，使细胞通透性孔打开，膜通透性增大而释放细胞色素c等细胞凋亡因子，诱导细胞凋亡。
Bcl-2家族中抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的相互作用决定着细胞的命运，他们之间的平衡是细胞正常生长或发生凋亡的决定因素，一旦平衡被打破，肿瘤便有可能产生(Tsujimoto,Y.,Journal of Cellular physiology,2003,195,(2),158-167)。基于此，有机会通过调节抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的平衡来恢复肿瘤细胞的正常凋亡。因此，对抗Bcl-2蛋白抗凋亡成员的治疗策略无疑会帮助我们找到新的肿瘤治疗方法。迄今为止，已经发现有三类能抑制Bcl-2抗凋亡蛋白的活性或者激活促凋亡蛋白活性的化合物，分别是寡义核苷酸，BH3模拟肽类以及小分子抑制剂。其中小分子抑制剂以其较高的透过率以及生物稳定性而成为近年来研究的热点。
近十年来，针对抗凋亡蛋白的小分子抑制剂不断涌现，有些已进入临床研究阶段，如ABT-263、AT-101、GX15-070等。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂，本发明还提供该化合物的制备方法。
本发明进一步还提供该化合物的药物组合物及医药用途。
本发明的技术方案如下：
一、吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂
一种吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂，是具有通式Ⅰ结构的化合物，以及其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药，
式Ⅰ中，R1是氢，C1-C6脂肪烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基，杂芳基烷基，或被一个或多个如下基团取代的芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基：羟基，卤素，硝基，氰基，胍基，羧基，卤C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷基，C1-C6环烷基；R1优选为没有取代或被一个或多个取代基取代的芳基，杂芳基，优选取代基为卤素，C1-C6烷基，卤C1-C6烷基；
R2是氢，（C1-C6）直链或支链烷基-氧羰基，没有取代或被一个或多个如下基团取代的芳基-（C1-C6）烷基-氧基羰基：羟基，卤素，硝基，氰基，胍基，羧基，卤C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷基，C1-C6环烷基，芳基，杂芳基；R2优选为氢，叔丁氧羰基和苄氧羰基；
R3是没有取代或被一个或多个如下基团取代的芳基，芳基烷基，杂芳基，杂芳基烷基（优选为芳基）：C1-C6脂肪烷基，羟基，卤素，硝基，氰基，羧基，卤C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷基羰基，C1-C6烷氧羰基，优选取代基为C1-C6脂肪烷基，硝基，卤素，氰基；
R4是天然或非天然氨基酸α碳上的取代基，优选为苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的残基。R4没有取代或被一个或多个如下基团取代：羟基，卤素，硝基，氰基，胍基，羧基，卤C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷基，C1-C6环烷基，优选取代基为羟基，卤素。
根据本发明优选的，式Ⅰ中，R1是：
或
R2是：或H；
R3是：或
R4是：或
根据本发明，进一步优选的，上述通式I化合物是下列之一：
1、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5a)，
2、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5b)，
3、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5c)，
4、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5d)，
5、（2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5e)，
6、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5f)，
7、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(对硝基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5g)，
8、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(对氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5h)，
9、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5i)，
10、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5j)，
11、(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5k)，
12、(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5l)，
13、(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5m)，
14、(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5n)，
15、(2S,4S)-4-(4’-对氯苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5o)，
16、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(苄氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5p)，
17、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(苄氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5q)，
18、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(苄氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5r)，
19、(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对羟基苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5s)或
20、(2S,4S)-4-联苯氧基-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(6)。
以上优选化合物，其前面的编号是顺序号，后面的括号内的编号是对应于下面合成路线及表1中的化合物结构的编号。
发明详述
本文中所用的术语和定义含义如下：
“芳基”是指芳族碳环基团。优选的芳环含有6-10个碳原子。
“杂芳基”是芳族杂环，可以是单环或双环基团。较佳的杂芳基包括，例如噻吩基，呋喃基、吡咯基、吡啶基、吡嗪基、噻唑基、嘧啶基、喹啉基、以及四氮唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吲哚基等。
“杂烷基”指饱和或不饱和、含碳原子和至少一个杂原子的链，其中任意一个杂原子不相邻。杂烷基中含有2-15个原子(碳原子)，优选含有2-10个原子。杂烷基可以是直连或支链、取代或未取代的。
“环烷基”是取代或未取代的，饱和或不饱和的环状基团，其含有碳原子和/或一个或多个杂原子。该环可以是单环或稠环，桥环或螺环的环系。单环通常有3-9个原子，优选有4-7个原子，多环含有7-17个原子，优选含有7-13个原子。
“卤素”包括氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。
“芳酰基”是指芳香族碳环末端连有羰基的基团，优选的芳环含有6-10个碳原子。
“杂芳酰基”指芳族杂环末端连有羰基的基团，可以是单环或双环基团。较佳的杂芳基包括噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，噻唑基，嘧啶基，喹啉基以及四氮唑基，苯并噻唑基，苯并呋喃基，吲哚基等。
“环烷酰基”指取代或为取代的，饱和或不饱和的环状末端连有羰基的基团，其含有碳原子和/或一个或多个杂原子。该环可以是单环或稠环，桥环或螺环的环系。单环通常有3-9个原子，优选有4-7个原子，多环含有7-17个原子，优选含有7-13个原子。
“药学上可接受的盐”是指通式I化合物具有疗效且无毒的盐形式。其可由任一酸性基团(如羧基)形成阴离子盐，或由任一碱性基团(如氨基)形成阳离子盐。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团(如羧基)上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团(如氨基)上形成的阴离子盐。这些盐有许多是本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属(如钠和钾)和碱土金属(如镁和钙)的盐以及有机盐(如铵盐)。还可通过使用相应的酸处理碱性形式的I方便地获得阴离子盐，这样的酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1,2,3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。这些盐是熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等因素取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。
“溶剂合物”是溶质(如金属蛋白酶抑制剂)和溶剂(如水)组合形成的配合物。参见J.Honig等，The Van Nostrand Chemist’s Dictionary,p.650(1953)。本发明采用的药学上可接受的溶剂包括不干扰Bcl-2蛋白小分子抑制剂的生物活性的那些溶剂(例如水、乙醇、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜以及该领域技术人员所知的或容易确定的溶剂)。
本文所用的“立体异构体”定义了本发明化合物或其生理上的衍生物所有可能的立体异构体的形式。除非另有指示，本发明化合物的化学命名包括所有可能的立体化学形式的混合物，所属混合物包含基本结构分子的所有非对映体和对映体，以及基本纯净的本发明化合物的单个异构体形式，即其中含有低于10％，优选低于5％，特别是低于2％，最优选低于1％的其它异构体。本发明类肽化合物各种立体异构体形式均明显包含于本发明的范围内。
通式I化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。
如上所述的取代基自身还可被一个或多个取代基取代。这样的取代基包括在C.Hansch和A.Leo,Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology(1979)中列出的那些取代基。优选的取代基包括烷基，烯基，烷氧基，羟基，氧基，硝基，氨基，氨基烷基(如氨甲基等)，氰基，卤素，羧基，羰基烷氧基(如羰基乙氧基等)，硫基，芳基，环烷基，杂芳基，杂环烷基(如哌啶基，吗啉基，吡咯基等)，亚氨基，羟烷基，芳基氧基，芳基烷基及其结合。
二、吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂的制备方法
一种吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂的制备方法，以N-叔丁氧羰基-L-羟脯氨酸甲酯为原料，与含有不同取代基的联苯酚通过Mitsunobu反应生成中间体2a-2c，再脱甲酯后得到羧酸3a-3c或先脱除Boc保护基后引入Cbz保护基再脱甲酯得3d。中间体3a-3d与不同氨基酸衍生的N-酰基磺酰胺经酰胺（4a-4k）经缩合反应得到目标化合物5a-5s。脱Boc后得到目标化合物6。
合成路线如下：
其中，R1、R2、R3、R4的定义同上通式(I)所述。
试剂和条件：(a)三苯基膦,偶氮二甲酸二乙酯,不同取代的联苯酚，室温反应过夜；(b)氢氧化钠，四氢呋喃，水，室温反应过夜；(c)分三步：i)氯化氢，乙酸乙酯,室温反应过夜；ii)氯甲酸苄酯,碳酸氢钠，四氢呋喃，水,0°C至室温反应15分钟；iii)氢氧化钠，四氢呋喃，水，室温反应过夜；(d)N-甲基吗啉,氯甲酸异丁酯,不同氨基酸衍生的N-酰基磺酰胺,-20°C至室温反应4小时；(e)氯化氢，乙酸乙酯,室温反应过夜。
以上制备方法及合成路线中化合物的编号在本申请文件中通用，具有相同的含义。
合成路线中目标化合物的结构式如下所示：
表1
所述化合物的具体操作步骤将在实施例中将加以详细说明。
本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene,Protecting Groups inOrganic Synthesis.
三、吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂的应用
本发明还提供了吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂在制备预防或治疗因Bcl-2抗凋亡蛋白过表达相关的哺乳动物疾病药物中的应用。所述的因Bcl-2抗凋亡蛋白过表达相关的哺乳动物疾病包括癌症、自身免疫疾病等。
此外，本发明还包括一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式I的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
此外，本发明还包括一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式I的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
进行抑制蛋白活性和细胞活性两方面测试评价化合物在体外的生物活性。
化合物竞争性抑制蛋白活性的测试采用荧光偏振法，荧光标记分子为5-FAM标记的Bid-BH3多肽，能够与Bcl-2家族蛋白抗凋亡成员Mcl-1发生特异性结合，二者结合的结果会产生较高的极化值。如果待测化合物也能够与这些蛋白特异性结合，则会与荧光标记多肽发生竞争，抑制其与蛋白的结合，从而导致极化值降低。将加入待测化合物产生的极化值与阴性对照和阳性对照比较，如果极化值相对阴性对照的降低水平达到阴性与阳性值之差的一半左右，则认为待测化合物有明显活性，可以进一步准确测定其IC50值，进而导出其竞争性抑制常数Ki。体外抑制蛋白活性实验结果表明，本发明中的化合物为吡咯烷类Bcl-2家族蛋白小分子抑制剂。
化合物的细胞活性的测试使用MTT检测方法，PC-3，MDA-MB-231细胞悬液分别接种于96孔板，每孔中加入含不同浓度化合物的培养基，经孵育后，用MTT染色，继续孵育后，于酶标仪上在570nm处测定每孔的吸光度OD值，计算出细胞生长抑制率，从而确定化合物的活性。
本发明中的化合物对于Mcl-1均有较强的抑制活性，其中化合物5f，5m，5n，5o，5q和6对Mcl-1均表现出明显的抑制活性，与阳性对照棉酚的抑酶活性相当，有很大的开发前景，并可指导发现新型高效Bcl-2蛋白小分子抑制剂。同时，化合物5n在体外抗肿瘤细胞增殖的试验中显示出与阳性对照棉酚接近的活性，具有良好的开发前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。实施例中所用化合物的编号与前述合成路线中化合物的编号及表1中化合物的编号具有相同的含义。
实施例1.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5a)的制备
(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-羧酸(3a)
将化合物1N-叔丁氧羰基-L-羟脯氨酸甲酯（9.8g，40mmol），4-苯基苯酚（8.17g，48mmol）,三苯基磷（15.74g，60mmol）用无水四氢呋喃（THF）使混合物溶解。冰浴下搅拌加入偶氮二甲酸二乙酯（DEAD，9.40g，60mmol），再升至室温反应过夜。蒸除溶剂后加入EtOAc，分别用0.5M氢氧化钠溶液、柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相干燥后，蒸除溶剂得浅黄色粘稠油状物2a。将2a溶于THF后加入等体积的1M NaOH水溶液，室温反应过夜。蒸除有机溶剂后，加1N盐酸调至pH2-3，所得白色固体经柱层析得到产物3a，收率30%，mp=165-168°C，ESI-MS m/z：382.5(M-H)-，1HNMR(DMSO-d6，400MHz),δ1.37(s,5H),1.41(s,4H),2.22(d,J=13.2Hz,1H),2.55-2.63(m,1H),3.43-3.46(m,1H),3.71-3.78(m,1H),4.26-4.32(m,1H),5.05(s,1H),6.95-6.97(m,2H),7.31(t,J=7.4Hz,1H),7.43(t,J=7.5Hz,2H),7.60(t,J=7.1Hz,4H),12.47(s,1H)。
用同样的方法合成化合物3b，3c。
(S)-2-氨基-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺盐酸盐(4a)
N-Boc-L-苯丙氨酸(4mmol,1.06g)溶于无水THF后，在-20℃加入N-甲基吗啉(4.4mmol,0.45g），搅拌10min后加入氯甲酸异丁酯(4.4mmol,0.60g)，反应45min后将混合液缓慢加入到含有苯磺酰胺(6mmol,0.94g)与NaH(12mmol,0.48g)的无水THF溶液中，缓慢升至室温并反应4h。蒸除THF后加入乙酸乙酯溶解，分别用柠檬酸和饱和NaCl溶液洗涤三次，有机相干燥后过滤，蒸除溶剂后经柱层析得到白色晶体。收率68%，mp133–136℃,HRMS(ESI):calcd.for C20H23N2O5S-403.1333,found403.1311[M–H]-.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ1.38(s,9H),2.93(dd,J=14.1Hz,6.9Hz,1H),3.05(dd,J=14.1Hz,6.3Hz,1H),4.31(s,1H),4.90(s,1H),7.02-7.04(m,2H),7.04-7.23(m,3H),7.52-7.57(m,2H),7.57-7.66(m,1H),8.05(d,J=7.5Hz,2H),9.34(s,1H)。将得到的白色晶体(0.46g,1.2mmol)溶于乙酸乙酯饱和的HCl中，室温反应过夜后，过滤得4a盐酸盐。
化合物4b-4k的合成方法同4a。
(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5a)
中间体3a（0.38g，1mmol）溶于无水THF（10mL），在-20°C条件下依次加入N-甲基吗啉（0.22g，2.2mmol）和氯甲酸异丁酯(0.16g，1.1mmol)，反应1h后加入预先干燥的4a（0.41g,1.2mmol）盐酸盐中间体，缓慢升至室温反应4h。然后蒸除溶剂，残渣溶于EtOAc后分别用柠檬酸，饱和NaHCO3，饱和食盐水洗涤，合并有机相，蒸除溶剂后经柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯=2:1）得粉末状目标化合物5a。收率40%，mp：94-97°C，HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C37H39N3O7S[M-H]-668.2430,Found:668.2436，1H NMR(CDCl3，600MHz)，δ1.32(s，9H)，δ2.49(s，1H)，2.63(s，1H)，2.91(m，1H)，3.40(m，1H)，3.73(m，2H)，4.46(d，1H)，4.83(s，1H)，4.94(s，1H)，6.71(d，1H)，6.91(d，2H)，7.01(d，2H)，7.14(m，2H)，7.22(s，1H)，7.34(m，1H)，7.45(m，2H)，7.56(m，6H)，7.66(m，1H)，8.06(m，2H)，10.00(s，1H)。
实施例2.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(对甲苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5b)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5b收率31%,mp:89-92°C,ESI-MSm/z:782.30[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)，δ1.37(s,9H),2.46(s,3H),2.49-2.50(m,1H),2.61(d,J=14.1Hz,1H),2.90(d,J=13.0Hz,1H),3.41(d,J=13.2Hz,1H),3.70-3.71(m,1H),3.75(d,J=10.7Hz,1H),4.44(d,J=10.1Hz,1H),4.79(brs,1H),4.92(s,1H),6.66(d,J=5.9Hz,1H),6.90(d,J=5.7Hz,2H),7.04(d,J=6.4Hz,2H),7.14-7.15(m,2H),7.21-7.23(m,1H),7.33-7.34(m,3H),7.42-7.44(m,2H),7.55-7.56(m,4H),7.93(d,J=5.2Hz,2H),9.87(s,1H)。
实施例3.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5c)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5c收率35%,mp:106-109°C,ESI-MSm/z:747.5[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)，δ1.35(s,9H),2.50-2.51(m,1H),2.56(d,J=14.2Hz,1H),2.2.92-2.94(m,1H),3.37-3.38(m,1H),3.68-3.40(m,1H),3.77(d,J=11.8Hz,1H),4.40(d,J=8.7Hz,1H),4.73(s,1H),4.91(s,1H),6.65(d,J=7.4Hz,1H),6.86(d,J=8.2Hz,2H),7.04(d,J=7.4Hz,2H),7.17(t,J=7.5Hz,2H),7.23(d,J=7.3Hz,1H),7.33(t,J=7.4Hz,1H),7.43(t,J=7.5Hz,2H),7.53-7.54(m,4H),7.74(d,J=8.6Hz,1H),8.23(d,J=8.4Hz,1H),8.48(s,1H),10.21(s,1H)。
实施例4.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5d)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5d收率51%,mp:96-100°C,ESI-MSm/z:748.50[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.40(s,9H),2.45-2.46(m,1H),2.62(d,J=13.4Hz,1H),2.84(d,J=10.7Hz,1H),3.32(d,J=11.4Hz,1H),3.71-3.74(m,2H),4.44(d,J=9.5Hz,1H),4.80(s,1H),4.91(s,1H),6.62(d,J=8.7Hz,1H),6.86(d,J=8.0Hz,2H),6.88(d,J=8.5Hz,2H),7.21(d,J=6.9Hz,2H),7.32(t,J=7.3Hz,1H),7.42(d,J=7.4Hz,2H),7.53-7.54(m,6H),7.65(t,J=7.0Hz,1H),8.04(d,J=6.1Hz,2H),9.96(s,1H)。
实施例5.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5e)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5e收率37%,mp:95-98°C,ESI-MSm/z:762.25[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.38(s,9H),2.44(s,3H),2.46-2.47(m,1H),2.59(d,J=13.7Hz,1H),2.82(d,J=7.6Hz,1H),3.32(d,J=15.4Hz,1H),3.69-3.74(m,2H),4.41(d,J=10.1Hz,1H),4.75(s,1H),4.88(s,1H),6.56(d,J=7.9Hz,1H),6.86-6.88(m,4H),7.20(d,J=7.4Hz,2H),7.30-7.32(m,3H),7.41(t,J=7.6Hz,2H),7.51-7.52(m,4H),7.89(d,J=7.0Hz,2H),9.85(s,1H)。
实施例6.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5f)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5f收率41%,mp:97-100°C,ESI-MSm/z:827.15[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.39(s,9H),2.46-2.50(m,1H),2.58(d,J=13.9Hz,1H),2.90(d,J=8.6Hz,1H),3.27(d,J=11.0Hz,1H),3.68(d,J=11.3Hz,1H),3.77(d,J=11.8Hz,1H),4.41(d,J=10.4Hz,1H),4.73(s,1H),4.90(s,1H),6.68(d,J=5.9Hz,1H),6.86(d,J=8.6Hz,2H),6.93(d,J=7.02Hz,2H),7.28(d,J=7.0Hz,2H),7.33(t,J=7.2Hz,1H),7.43(t,J=7.3Hz,2H),7.53-7.55(m,4H),7.71(d,J=8.1Hz,1H),8.18(d,J=7.7Hz,1H),8.52(s,1H),10.34(s,1H)。
实施例7.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(对硝基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5g)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5g收率30%,mp:128-131°C,HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C37H37BrN4O9S[M-H]-791.1386,Found:791.1387,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.35(s,9H),2.48-2.51(m,1H),2.57(d,J=13.8Hz,1H),2.90(dd,J=13.8Hz,4.2Hz,1H),3.31(d,J=11.4Hz,1H),3.69(d,J=9Hz,1H),3.79(d,J=12.6Hz,1H),4.41(d,J=9.6Hz,1H),4.71(s,1H),4.91(s,1H),6.64(d,J=7.8Hz,1H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),6.97(d,J=7.8Hz,2H),7.32(d,J=8.4Hz,2H),7.34(t,J=7.2Hz,1H),7.43(t,J=7.2Hz,2H),7.54-7.56(m,4H),8.24(d,J=8.4Hz,2H),8.37(d,J=8.4Hz,2H),10.2(s,1H)。
实施例8.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(对氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5h)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5h收率26%,mp:125-127°C,ESI-MSm/z:782.5[M-H]-,1H-NMR((CD3)2O,600Hz)δ1.20(s,5H),1.35(s,4H),2.19-2.27(m,1H),2.53-2.54(m,1H),2.91-2.92(m,1H),3.03(dd,J=13.2Hz,4.8Hz,1H),3.51-3.56(m,1H),3.75-3.76(m,1H),4.21-4.26(m,1H),4.60-4.70(m,1H),5.00(brs,1H),6.74-6.88(m,2H),6.98(d,J=7.8Hz,2H),7.20-7.23(m,3H),7.33(t,J=7.8Hz,2H),7.49-7.52(m,4H),7.58(d,J=7.8Hz,2H),7.89(d,J=7.8Hz,2H)。
实施例9.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5i)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5i收率28%,mp:115-117°C,ESI-MSm/z:707.6[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.11(s，9H),δ2.53-2.55(m,1H),δ2.61(d,J=14.3Hz,1H),3.15(dd,J=14.8Hz,4.1Hz,1H),3.56(dd,J=14.8Hz,3.4Hz,1H),3.62(dd,J=11.9Hz,3.7Hz,1H),3.76(d,J=12.1Hz,1H),4.41(d,J=9.5Hz,1H),4.87-4.88(m,1H),4.97(s,1H),6.81(s,1H),6.85-6.86(m,2H),7.00(d,J=8.4Hz,2H),7.17(t,J=7.4Hz,1H),7.33-7.36(m,2H),7.44(t,J=7.6Hz,2H),7.53-7.59(m,6H),7.65(d,J=7.1Hz,2H),8.05(d,J=7.7Hz,1H),8.07(s,1H),9.92(s,1H)。
实施例10.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5j)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5j收率33%,mp:123-126°C,ESI-MS m/z:786.5[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.09(s,1H),2.53-2.60(m,2H),3.14(dd,J=15Hz,4.2Hz,1H),3.52(d,J=15Hz,1H),3.62(d,J=8.4Hz,1H),3.78(d,J=6Hz,1H),4.37(d,J=8.4Hz,1H),4.84(s,1H),4.96(s,1H),6.74(s,1H),6.83-6.88(m,2H),6.95(d,J=7.8Hz,1H),7.17(t,J=7.2Hz,1H),7.26-7.36(m,2H),7.42(t,J=7.2Hz,2H),7.54-7.56(m,4H),7.62(d,J=7.8Hz,1H),7.73(d,J=7.8Hz,1H),8.12(brs,1H),8.24(d,J=8.4Hz,1H),8.33(s,1H),10.19(s,1H)。
实施例11.(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5k)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5k收率35%,mp:86-89°C,ESI-MSm/z:682.7[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.37(s,9H),2.41(s,3H),2.47-2.51(m,1H),2.61(d,J=14.4Hz,1H),2.90(dd,J=13.7Hz,5.0Hz,1H),3.43(dd,J=13.7Hz,3.2Hz,1H),3.70-3.72(m,1H),3.76(d,J=11.8Hz,1H),4.44(d,J=9.9Hz,1H),4.79(s,1H),4.92(s,1H),6.63(d,J=8.2Hz,1H),6.89(d,J=8.1Hz,2H),7.03(d,J=7.14Hz,2H),7.16(t,J=7.44Hz,2H),7.22-7.23(m,1H),7.26(d,J=7.9Hz,2H),7.46(d,J=7.7Hz,2H),7.53-7.57(m,4H),7.67(t,J=7.3Hz,1H),8.07(d,J=7.6Hz,2H),9.91(s,1H)。
实施例12.(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5l)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5l收率34%,mp:96-99°C,ESI-MSm/z:696.6[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.35(s,9H),2.38(s,3H),2.44(s,3H),2.47-2.48(m,1H),2.58(d,J=14.8Hz,1H),2.89(dd,J=13.8Hz,4.3Hz,1H),3.39(d,J=11.2Hz,1H),3.67(d,J=14.4Hz,1H),3.72(d,J=10.9Hz,1H),4.41(d,J=9.1Hz,1H),4.75(s,1H),4.89(s,1H),6.81(d,J=7.7Hz,1H),6.86(d,J=8.0Hz,2H),7.02(d,J=7.3Hz,2H),7.14(t,J=7.7Hz,2H),7.19-7.24(m,3H),7.31(d,J=7.6Hz,2H),7.43(d,J=7.9Hz,2H),7.51(d,J=7.9,2H),7.92(d,J=7.7Hz,2H),9.84(s,1H)。
实施例13.(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5m)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5m收率38%,mp:90-93°C,ESI-MSm/z:761.6[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.35(s,9H),2.39(s，3H),δ2.48-2.51(m,1H),2.55(d,J=13.8Hz,1H),2.93(dd,J=14.4Hz,5.4Hz,1H),3.37(dd,J=13.8Hz,4.8Hz,1H),3.67(dd,J=12.6Hz,3.0Hz,1H),3.76(d,J=12.6Hz,1H),4.39(d,J=8.4Hz,1H),4.70-4.74(m,1H),4.90(s,1H),6.64(s,1H),6.84(d,J=8.3Hz,2H),7.04(d,J=7.2Hz,2H),7.17(t,J=7.2Hz,2H),7.23(m,3H),7.43(d，J=7.8Hz,2H),7.51(d，J=8.4Hz,2H),7.73(d,J=8.4Hz,1H),8.23(d,J=7.8Hz,1H),8.46(s,1H),10.21(s,1H)。
实施例14.(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5n)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5n收率31%,mp:111-114°C,HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C38H38BrClN4O9S[M-H]-839.1153.Found:839.1159,1H-NMR(CDCl3,300Hz)δ1.39(s,9H),2.39(s,3H),2.47-2.60(m,2H),2.90(dd,J=13.8Hz,5.1Hz,1H),3.31(d,J=13.2,1H),3.68(dd,J=12.0Hz,3.0Hz,1H),3.77(d,J=12.3Hz,1H),4.40(d,J=9.0Hz,1H),4.70-4.73(m,1H),4.90(s,1H),6.61(m,1H),6.84(d,J=8.4Hz,2H),6.94(d,J=7.5Hz,2H),7.23(m,2H),7.31(m,2H),7.44(d,J=7.8Hz,2H),7.53(d,J=8.4Hz,2H),7.72(d,J=8.1Hz,1H),8.20(d,J=7.8Hz,1H),8.53(s,1H)。
实施例15.(2S,4S)-4-(4’-对氯苯基苯氧基)-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5o)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5o收率26%,mp:125-128°C,HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C37H35BrCl2N4O9S[M-H]-859.0607,Found:859.0610,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.40(s,9H),2.47-2.50(m,1H),2.57(d,J=14.4Hz,1H),2.90(d,J=13.8Hz,1H),3.30(d,J=10.8Hz,1H),3.69(d,J=11.4Hz,1H),3.77(d,J=11.4Hz,1H),4.40(d,J=10.2Hz,1H),4.73(s,1H),4.90(s,1H),6.64(d,J=7.2Hz,1H),6.85(d,J=8.4Hz,2H),6.94(d,J=7.8Hz,2H),7.30(d,J=7.2Hz,2H),7.40(d,J=7.8Hz,2H),7.47(d,J=7.8Hz,2H),7.51(d,J=7.8Hz,2H),7.73(d,J=8.4Hz,1H),8.20(d,J=7.2Hz,1H),8.53(s,1H),10.26(s,1H)。
实施例16.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(苄氧羰基)-N-[(2S)-3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5p)的制备
将2a溶于氯化氢饱和的乙酸乙酯中，室温反应过夜后，过滤得白色固体，经甲醇重结晶后得到白色盐酸盐中间体6.0g，收率38%，mp=218-220°C,1H NMR(MeOD，300Hz)，δ2.68-2.72(m，2H)，3.62(dd，1H)，3.75(d，1H)，3.85(s，1H)，4.71(t，1H)，5.28(d，1H)，7.0(d，2H)，7.31(t，1H)，7.42(t，2H)，7.59(t，3H)。将此白色盐酸盐中间体(1.67g,5mmol)混悬于THF：H2O(1:1,20mL)溶液中，加入NaHCO3至溶液澄清。冰浴搅拌，将氯甲酸苄酯(0.86ml,6mmol)缓慢滴入上述反应液中。缓慢升至室温，继续反应15min后停止反应。蒸干溶剂，残渣用EtOAc(50mL)转移至分液漏斗，水洗(3×5mL)，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。将残渣溶于THF(25mL)，加入等体积的1M NaOH水溶液，室温反应过夜。蒸除有机溶剂，加入少量水后用1M HCl溶液调酸至pH2-3，过滤得到白色固体，以MeOH重结晶得到3d的白色晶体1.37g，收率66%，mp188-190°C，ESI-MS m/z：416.5[M-H]ˉ。
其他中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5p收率33%,mp:83-86°C,ESI-MS m/z:702.6[M-H]-,1H-NMR(CDCl3,300Hz)δ2.36-2.44(m,1H),2.60(d,J=14.4Hz,1H),3.00-3.16(m,2H),3.70-3.81(m,2H),4.46(d,J=9.6Hz,1H),4.70-4.72(m,1H),4.88(s,1H),4.96(d,J=12.3Hz,1H),5.17(d,J=12.3Hz,1H),6.74(d,J=8.1Hz,1H),6.79(d,J=8.4Hz,2H),6.95-6.96(m,2H),7.07-7.09(m,3H),7.29-7.44(m,8H),7.48-7.53(m,4H),7.62(t,J=14.4Hz,7.2Hz,1H),8.06(d,J=7.2Hz,2H),9.98(s,1H)。
实施例17.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(苄氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5q)的制备
3d的制备方法如实施例16，其他中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5q收率23%,mp:88-91°C,HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C40H36BrN3O7S[M-H]-780.1379.Found:780.1381.1H-NMR(CDCl3,300Hz)δ2.38-2.46(m,1H),2.57(d,J=13.8Hz,1H),3.03(m,2H),3.68-3.72(m,1H),3.81(d,J=12.3Hz,1H),4.46(d,J=9.6Hz,1H),4.68-4.70(m,1H),4.87(s,1H),5.07(d,J=12.0Hz,1H),5.26(d,J=12.6Hz,1H),6.65(d,J=7.8Hz,1H),6.77(d,J=8.4Hz,2H),6.83(d,J=7.8Hz,2H),7.18(d,J=8.1Hz,2H),7.30-7.45(m,8H),7.50-7.56(m,6H),7.65(t,J=14.7Hz,7.5Hz,1H),8.06(d,J=7.5Hz,2H),9.95(s,1H)。
实施例18.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(苄氧羰基)-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5r)的制备
3d的制备方法如实施例16，其他中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5r收率22%，mp:94-97°C，HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C40H34BrClN4O9S[M-H]-859.0840.Found:859.0846,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ2.43(m,1H),2.55(d,J=14.4Hz,1H),2.92(m,1H),3.82(d,J=10.8Hz,1H),4.43(d,J=9Hz,1H),4.67(d,J=6Hz,1H),4.87(s,1H),5.07(d,J=10.8Hz,1H),5.21(d,J=11.4Hz,1H),6.74(d,J=7.8Hz,1H),6.82(s,1H),6.86(d,J=6Hz,1H),7.21(d,J=5.4Hz,1H),7.33-7.37(m,3H),7.41-7.42(m,5H),7.51-7.53(m,4H),7.66(d,J=7.2Hz,1H),8.15(d,J=6Hz,1H),8.54(s,1H)。
实施例19.(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)-3-对羟基苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺(5s)的制备
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。化合物5s收率26%，HRMS(AP-ESI)m/zCalcd for C37H37ClN4O10S[M-H]-763.1841.Found:763.1830,1H-NMR(CDCl3,600Hz)δ1.38(s,9H),2.50(m,2H),2.84(dd,J=13.8Hz,4.2Hz,1H),3.31(d,J=11.4Hz,1H),3.69(d,J=10.2Hz,1H),3.81(d,J=12.6Hz,1H),4.39(d,J=9.6Hz,1H),4.69(s,1H),4.91(s,1H),5.38(brs,1H),6.61(d,J=7.8Hz,2H),6.69(d,J=6.6Hz,1H),6.88-6.89(m,4H),7.32(t,J=7.2Hz,1H),7.42(t,J=7.8Hz,2H),7.53-7.55(m,4H),7.72(d,J=7.8Hz,1H),8.82(d,J=8.4Hz,1H),8.45(s,1H),10.19(s,1H).
实施例20.(2S,4S)-4-联苯氧基-N-[(2S)-3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(6)的制备
将化合物5f溶于HCl饱和的乙酸乙酯中反应过夜，脱Boc形成盐酸盐化合物6。收率88%，mp：152-154°C，HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C32H28BrClN4O7S[M+H]+727.0629,Found:727.0622,1H-NMR(DMSO,600Hz),δ2.10(d,J=10.2Hz,1H),2.72-2.78(m,2H),3.01(d,J=13.2Hz,2.1Hz,1H),3.43-3.46(m,1H),3.52-3.54(m,1H),4.26-4.27(m,1H),4.52(s,1H),5.13(s,1H),6.95(d,J=8.4Hz,2H),7.07(d,J=7.8Hz,2H),7.31-7.35(m,3H),7.44(t,J=7.2Hz,2H),7.59-7.63(m,4H),7.95(d,J=8.4Hz,1H),8.10(d,J=8.4Hz,1H),8.50(s,1H),8.83(brs,2H),9.85(s,1H)。
目标化合物活性评价
实验例1、目标化合物对靶蛋白竞争性结合试验（In vitro）
在测试缓冲液（1×PBS）中加入靶蛋白和不同浓度的待测小分子化合物（1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,50μM,100μM），混匀后室温避光孵育30min。再加入荧光标记的Bid BH3多肽，使各溶液的总体积均为200μL，混匀后室温避光孵育20min。将上述溶液及校正溶液（1nM fluorescein，10mM NaOH）各取60μL转移至黑色384孔板中（平行三组），立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，极化值测定结果取平均值。用GraphPad Prism软件处理数据和做图，得出该化合物的IC50值。根据测量中所使用的蛋白总浓度、荧光多肽的总浓度、蛋白-多肽复合物的解离常数以及检测化合物的IC50值，使用下列文献中的计算方法得出检测化合物的竞争性抑制常数Ki(Nikolovska-Coleska,Z.;et al.Development andoptimization of a binding assay for the XIAP BIR3domain using fluorescence polarization.AnalBiochem.2004,332,261-273)。实验结果见表2。
表2.目标化合物的体外抑酶实验结果
a表中数值为三次试验的平均值
上述测试结果表明，吡咯烷类化合物表现出对Mcl-1较强的抑制活性，其中化合物5f，5m，5o，5q和6对Mcl-1的抑制活性Ki均低于0.6μM，与棉酚的抑酶活性相当，有很大的开发前景，并可藉此发现新型高效Bcl-2蛋白小分子抑制剂。
实验例2.目标化合物抑制细胞增殖的活性试验（In vitro）
选取酶活性较好的化合物5f，5m，5n，5o，5q，5r进行体外抑制癌细胞增殖的活性试验，结果见表2。
术语说明：
PC-3：前列腺癌细胞株。
MDA-MB-231：人乳腺癌细胞株。
DMSO：二甲基亚砜
IC50：半数抑制浓度。
1.[材料]PC-3，MDA-MB-231细胞株，四甲基偶氮唑蓝MTT，10%胎牛血清，96孔板
2.[方法]
细胞培养 PC-3，MDA-MB-231两种肿瘤细胞株都采用常规培养。实验时均用对数生长期细胞。
细胞生长检测（MTT法）PC-3，MDA-MB-231细胞悬液均调整至5×104/ml，分别接种于96孔板(100μl/孔)，5000个细胞/孔。铺板4h后，每孔中加入100ul含不同浓度化合物的培养基，使孔中化合物终浓度分别为：43、40、36、33、30uM，每个浓度设三个复孔，不加细胞的孔读数时作空白，加细胞不加化合物的孔作化合物空白孔，棉酚作化合物阳性对照。于37℃，5%CO2中孵育48h，每孔加入10μl0.5%的MTT染色液，继续孵育4h后，2500rpm，离心30min，然后抛弃板孔中培养基，加入DMSO，150ul/孔。酶标仪上于570nm处测定每孔的吸光度OD值，细胞生长抑制率按下式计算：
| 化合物 | IC50of PC-3(μM)a | IC50of MDA-MB-231(μM)a |
| 5f | 34.7±2.9 | 47.2±0.8 |
| 5m | 32.0±2.7 | 45.8±0.9 |
| 5n | 28.1±0.9 | 35.4±0.7 |
| 5o | 36.0±2.0 | 48.6±0.6 |
| 5q | 42.8±1.8 | 42.8±1.8 |
| 5r | 42.7±1.2 | 43.3±0.3 |
| 棉酚 | 19.0±3.7 | 21.4±1.8 |
a表中数值为三次试验的平均值，“±”后的数值表示标准偏差。
上表测试数据表明，化合物5n在体外抗肿瘤细胞增殖的试验中显示出与阳性对照棉酚接近的活性。
Claims (5)
1.一种吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂，是具有通式I结构的化合物，
I
式Ⅰ中，
R1是：， ， 或；
R2是：， ，或H；
R3是：， ， ， ，或；
R4是：， ， 或。
2.如权利要求1所述的吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂，其特征在于，通式I化合物是下列之一：
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5a)，
(2S,4S)-4-联苯氧基-1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5b)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5c)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5d)，
2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5e)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5f)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(对硝基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5g)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(对氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5h)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-(1H-吲哚-3-基)-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5i)，
(2S,4S)-4-联苯氧基- 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-(1H-吲哚-3-基)-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5j)，
(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基) - 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5k)，
(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基) - 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(对甲基苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5l)，
(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基) - 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5m)，
(2S,4S)-4-(4’-对甲基苯基苯氧基) - 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5n)，
(2S,4S)-4-(4’-对氯苯基苯氧基) - 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5o)，
(2S,4S)-4-联苯氧基 - 1-(苄氧羰基)-N-[(2S)- 3-苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5p)，
(2S,4S)-4-联苯氧基 - 1-(苄氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5q)，
(2S,4S)-4-联苯氧基 - 1-(苄氧羰基)-N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5r)，
(2S,4S)-4-联苯氧基 - 1-(叔丁氧羰基)-N-[(2S)- 3-对羟基苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺 (5s) 或
(2S,4S)-4-联苯氧基 - N-[(2S)- 3-对溴苯基-N-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)丙酰胺-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(6)。
3.权利要求1或2所述的吡咯烷类Bcl-2蛋白小分子抑制剂在制备预防或治疗因Bcl-2抗凋亡蛋白过表达相关的哺乳动物疾病药物中的应用。
4.一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含权利要求1或2所述化合物，和药学上可接受载体，任选地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
5.一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含权利要求1或2所述化合物，和药学上可接受载体，任选地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
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