CN109730223A - 一种寒葱饮料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及保健产品加工领域，具体公开了一种寒葱饮料，由如下质量份的原料制成，寒葱提取物冻干粉1‑8份，大枣0.5～1.5份，枸杞0.5～1.5份和桔梗蜂蜜糖4～5份。一种寒葱饮料的制备方法，包括制备寒葱提取物及寒葱提取物冻干粉，辅料预处理，制备桔梗蜂蜜糖以及寒葱饮料的调配与灌装。本发明利用桔梗蜂蜜糖可去除寒葱的辛辣味，制备而成的寒葱饮料具有肝脏保护及生殖系统补助保护的功能。

Description

一种寒葱饮料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及保健产品加工领域，具体涉及一种寒葱饮料及其制备方法与应用。

背景技术

寒葱(Allium Victorialis L.AV)是百合科、葱属的多年生草本植物，学名为茖葱，别名山葱、天葱、天韭、鹿耳葱等，是一种长白山地区的特色野生植物。寒葱具有独特的风味和丰富的营养物质，如核黄酸、尼克酸、胡萝卜素、矿物质及多种维生素等。且寒葱具备强抗氧化活性，研究表明寒葱具有抗菌、降低高血脂、抗肥胖症、抗糖尿病、血栓等作用，而且没有毒性，所以近些年来寒葱作为新开发的特色山野菜而受到重视。

当前社会，身体健康受到越来越多的关注，日常摄入功能性食品的人群数量在逐渐上升，保健饮料作为功能性食品的先驱者占领了保健食品中的大部分市场份额。而寒葱作为近年来新兴的山野菜，已有专家学者对其功能性进行研究，但是对于寒葱功能饮料的开发尚属起步阶段。专家学者们对于寒葱饮料的开发大多仿照现有的饮料制备工艺，通过调味剂进行调配。但是由于寒葱属于葱属植物，具有葱类特有的味道，且寒葱内含硫化合物丰富，使得寒葱还具有辛辣的味道，导致由寒葱制备而成的功能性饮料具有很大的辛辣味，口感不佳。且经过长期的试验和尝试，传统的糖或甜味剂对辛辣味的掩盖或去除效果并不理想。

发明内容

本发明意在提供一种寒葱饮料及其制备方法与应用，以解决现有技术中葱类饮料制备过程中辛辣味的掩盖或去除效果不佳的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种寒葱饮料，由如下质量份的原料制成，寒葱提取物冻干粉1-8份，大枣0.5～1.5份，枸杞0.5～1.5份和桔梗蜂蜜糖4～5份。

本技术方案还提供一种寒葱饮料的制备方法，包括如下步骤：

步骤a，制备寒葱提取物，取寒葱鲜叶，将寒葱鲜叶固态发酵后，将发酵后的寒葱鲜叶用蒸馏水浸提后进行初次回流提取；过滤初次回流提取液，滤渣用蒸馏水二次回流提取后再过滤，将二次回流提取液的滤渣用蒸馏水三次回流提取，过滤后合并三次滤液；将合并后的滤液减压蒸馏至浸膏状得寒葱水提取物；

步骤b，制备寒葱提取物冻干粉，将步骤a中的寒葱水提取物置于-80℃下预冻4h后冷冻干燥48h得冻干物，将冻干物研磨成粉得寒葱提取物冻干粉；

步骤c，辅料预处理，将大枣、枸杞切碎后备用；

步骤d，制备桔梗蜂蜜糖，将桔梗去皮、清洗后进行固态发酵，将发酵后的桔梗进行干燥，干燥温度60℃，干燥后粉碎、过筛制得桔梗粉，将桔梗粉水浴提取后，过滤得桔梗提取液；将桔梗提取液与甜味剂混合搅拌溶解后，进行熬煮；熬煮后加入淀粉糖浆及蜂蜜搅拌混合后制得桔梗蜂蜜糖；

步骤e，寒葱饮料的调配，将粉碎后的枸杞和大枣置于水中煮沸，15min后滤出滤渣，并冷却，在冷却后的滤液中加入寒葱提取物冻干粉和桔梗蜂蜜糖，溶解后即得寒葱饮料；

步骤f，将寒葱饮料灌装。

本技术方案的原理及有益效果在于：本技术方案在制备寒葱饮料的过程中，利用多次处理去除寒葱饮料中的辛辣味。首先，采用寒葱鲜叶的提取物作为饮料制备的原料，并对寒葱鲜叶进行固态发酵。发酵的微生物菌种为大酱中的乳酸菌和枯草芽孢杆菌，利用乳酸菌及枯草芽孢杆菌的生物转化作用去除寒葱鲜叶内的硫化物，采用“发酵转化法”初步去除寒葱内的辛辣味；其次，在寒葱饮料调配时，利用桔梗蜂蜜糖进行寒葱辛辣味的再次去除。桔梗蜂蜜糖在制备时，通过对桔梗的固态发酵，利用微生物发酵剂将桔梗中的淀粉糖化，增加桔梗蜂蜜糖的甜味；同时，桔梗发酵后，黄酮类物质及酚类物质含量及基团活性增加，会与寒葱的辛辣味物质--硫化物进行耦合反应，使硫化物含量减少，进而达到进一步去除寒葱辛辣味的作用；再次，通过桔梗蜂蜜糖中含有的桔梗提取物以及蜂蜜中的天然活性成分可掩盖寒葱的辛辣味及寒葱浓缩过程中由于焦糖化产生的焦糖味的效果，使寒葱饮料口感清爽，焦糖味和辛辣味祛除效果显著。而现有技术中通过白糖进行调配时，由于白糖制备工艺的原因，使得白糖具有与寒葱提取物同源性的焦糖味，不仅不利于焦糖味的祛除，反而会影响寒葱饮料的口感。而且，桔梗与寒葱同属长白山地区的特色山野菜，如此也实现了长白山地区资源的综合利用。此外，在饮料制作过程中，通过添加大枣与枸杞，一方面可利用大枣和枸杞内的糖分进行辅助的甜度调和，另一方面大枣和枸杞内的芳香类物质具有消减寒葱辛辣味的作用，一举两得。

并且，采用提取物作为原料相较于直接采用寒葱鲜叶榨汁来说，由于通过溶剂进行特定的功能性成分的提取，一方面提高了寒葱功能成分的浓度与纯度，另一方面由于功能性成分完全溶解在溶剂内，稳定性较高，还避免了寒葱饮料调配后产生絮凝和沉淀的问题。通过三次回流提取再将回流提取液合并进行减压蒸馏，既可保证寒葱内的功能性成分提取完全，又可保证不同批次提取的功能性成分混合均匀；而在浓缩的过程中，通过减压蒸馏的方式一方面可加快浓缩的速度，另一方面还可降低浓缩的温度，避免温度过高对寒葱内热敏性功能成分产生影响。此外，将寒葱提取物冷冻干燥的目的在于进一步去除寒葱水提取物内的水分，即对寒葱提取物进一步纯化，整个纯化过程在低温下进行，进一步避免寒葱内的热敏性成分的损失。

进一步，原料的质量份为寒葱提取物冻干粉5～8份，大枣1～1.5份，枸杞1～1.5份和桔梗蜂蜜糖4～5份。

采用上述原料的配比，可去除寒葱饮料中的辛辣味和焦糖味，寒葱饮料的口感良好。

进一步，原料的质量份为寒葱提取物冻干粉7份，大枣1份，枸杞1份和桔梗蜂蜜糖4.5份。

采用上述原料的配比，可去除寒葱饮料中的辛辣味和焦糖味，寒葱饮料的口感良好。

进一步，寒葱提取物冻干粉为寒葱水提取物冻干粉。

将寒葱功能成分提取时的提取溶剂定为水，可在达到提取目的的同时避免后续饮料调配过程中产生酒精味。

进一步，步骤a中，初次回流提取时，寒葱鲜叶与蒸馏水的料水比(W/V)为1:15；二次回流提取时，滤渣与蒸馏水的料水比(W/V)为1:10；三次回流提取时，滤渣与蒸馏水的料水比(W/V)为1:5。

初次提取时，需保证提取溶剂的足够充足，在初次提取后，寒葱内的功能性成分被提取大部分，剩余的未提取的功能性成分逐步缩减，因此在二次回流提取和三次回流提取中逐渐减少溶剂的占比，一方面避免水资源的浪费，另一方面也减少后续浓缩的难度。

进一步，步骤d中，桔梗粉水浴提取的条件为提取温度80℃，提取时间3h，料水比(W/V)为1:25。

在此条件下提取桔梗多糖，可使提取率最高。

进一步，步骤d中熬煮采用常压熬煮。

将熬煮方式选择为常压熬煮可避免减压熬煮过快造成糖浆过沸，从而避免糖浆中存在大量气泡。

进一步，寒葱饮料用于肝脏保护保健品制备的应用。

进一步，寒葱饮料用于生殖系统补助保护保健品制备的应用。

附图说明

图1为寒葱提取物对CCl₄诱导肝损伤小鼠血清谷丙酸氨基转氨酶活性的影响数据图；

图2为寒葱提取物对CCl4诱导肝损伤小鼠血清天冬氨酸氨基转氨酶活性的影响数据图；

图3为免疫印迹检测寒葱提取物对CCl4诱导急性肝损伤小鼠MPO蛋白表达情况；

图4为免疫印迹检测寒葱提取物对CCl4诱导小鼠的炎症因子的蛋白表达情况；

图5为RT-PCR检测寒葱提取物对CCl4诱导的小鼠肝脏的炎症因子mRNA表达情况；

图6为免疫印迹法检测寒葱对CCl4诱导的小鼠肝脏α-SMA、Collagen-Ⅰ和TIMP-1蛋白的表达；

图7为RT-PCR法检测寒葱对CCl4诱导的小鼠肝脏α-SMA、Collagen-Ⅰ和TIMP-1mRNA表达；

图8为蛋白免疫印迹检测寒葱提取物对CCl4诱导的小鼠肝脏Caspase家族蛋白表达情况；

图9为蛋白免疫印迹检测寒葱提取物对CCl4诱导的小鼠肝脏PARP、cIAP蛋白表达的情况；

图10为蛋白免疫印迹检测寒葱提取物对CCl4诱导的小鼠肝脏Bcl-2家族蛋白表达的情况；

图11为蛋白免疫印迹检测寒葱提取物对CCl4诱导的小鼠肝脏p-STAT3蛋白表达情况；

图12为寒葱提取物对大鼠精子A级活力的影响；

图13寒葱提取物对大鼠精子活力A+B级的影响；

图14寒葱提取物对大鼠精子活率的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

具体实施方式中出现的英文缩略词及对应的英文全称和中文注释如表1所示：

表1英文缩略词表

本发明的寒葱为取自吉林省珲春市春化林场的野生寒葱，实施例1-6为本发明的实施例，对比例1-2为本发明的对比例，每100mL寒葱饮料中各个原料的质量(g)如表2所示。

表2寒葱饮料中原料组成表

	寒葱水提取物(g)	大枣(g)	枸杞(g)	桔梗蜂蜜糖(g)	白砂糖(g)
						实施例1	4.0	0.5	0.5	4.0	0
实施例2	4.0	0.5	0.5	4.5	0
						实施例3	4.0	0.5	0.5	5.0	0
实施例4	7.0	1.0	1.0	4.5	0
						实施例5	7.5	1.5	1.5	4.5	0
实施例6	8.0	1.5	1.5	4.5	0
						对比例1	7.0	1.0	1.0	0	4.5
对比例2	7.0	1.0	1.0	0	5.0
						对比例3	4.0(寒葱未发酵)	0.5	0.5	4.5(桔梗未发酵)	0
对比例4	4.0(寒葱未发酵)	0.5	0.5	4.5	0
						空白例	7.0	1.0	1.0	0	0

以实施例1为例，阐述寒葱饮料的制备方法：

步骤a，制备寒葱提取物

将新鲜野生寒葱茎部与叶部分离，取寒葱叶片部分进行固态发酵，固态发酵的菌种为大酱中的乳酸菌及枯草芽孢杆菌，固态发酵的具体步骤如下：

取寒葱鲜叶1kg置于容器内，取寒葱鲜叶质量的2.5％的乳酸菌发酵液及2.5％的枯草芽孢杆菌的发酵液倒入容器内，而后密封容器并置于20℃下对寒葱鲜叶进行发酵，3天后，取发酵后的寒葱叶清洗沥干后进行水提取。水提取法是取鲜叶1kg，先用15L蒸馏水浸泡24h后回流提取2h；而后过滤，渣浸入10L蒸馏水回流提取1h；过滤后的滤渣浸入5L蒸馏水回流提取30min后再次过滤；合并3次的滤液，减压蒸馏除去水分至浸膏状得寒葱水提取物；

步骤b，制备寒葱提取物冻干粉

将步骤a中的寒葱水提取物放入-80℃下预冻4h，然后用冷冻干燥机(厂家：上海天美仪器设备有限公司)冻干48h后取出研磨成粉末，得寒葱提取物冻干粉，-20℃冰箱(厂家：Frio Labor)保存备用；

步骤c，辅料预处理

将将大枣(去核)、枸杞清洗后切碎后备用；

步骤d，制备桔梗蜂蜜糖

取新鲜桔梗将其外皮用毛刷刷掉，并用清洁自来水洗净，将洗净桔梗进行固态发酵，固态发酵的菌种为大酱中的乳酸菌及枯草芽孢杆菌，固态发酵的具体步骤如下：

取桔梗1kg置于容器内，取桔梗质量的2.5％的乳酸菌发酵液及2.5％的枯草芽孢杆菌的发酵液倒入容器内，而后密封容器并置于20℃下对桔梗进行发酵，3天后，取发酵后的桔梗洗沥干后放入60℃电热恒温鼓风干燥箱(厂家：黄石恒丰医疗器有限公司)内干燥72h，将干燥后的桔梗放入组织捣碎机内进行捣碎，并过40目筛得桔梗粉；

将桔梗粉水浴提取，水提工艺条件为温度80℃，时间3h，料水比1:25(W:V)，而后过滤得桔梗提取液；

溶糖：在溶糖锅内放入桔梗提取液，桔梗提取液占原料糖总质量的30％，加热至70℃后加入白砂糖并搅拌，而后加热至90℃加速溶解；

熬煮：将溶糖后的混合液置于锅内进行常压熬煮，在此过程中持续加热使糖液处于沸腾状态；

混合；先将淀粉糖浆缓慢加入到沸腾的糖液中，并迅速搅拌溶解，然后再将蜂蜜缓慢加入糖液中，并再次迅速搅拌溶解，制得桔梗蜂蜜糖；

步骤e，寒葱饮料的调配

取步骤c中的大枣和枸杞各0.5g放入装有100mL水的容器内进行煮沸，15min后减压过滤并补充水至100mL，当滤液冷却至50℃时，在滤液内加入4.0g寒葱提取物冻干粉和4.0g桔梗蜂蜜糖溶解，完成调配制得寒葱饮料；

步骤f，将寒葱饮料灌装。

随机选择20人对表2各配方制得的寒葱饮料进行感官评价，感官评价标准如表3所示。

表3寒葱饮料感官评价标准

表4寒葱饮料感官评价结果

上述感官评价结果表明，在寒葱饮料中加入实施例4所对应的原料时，制得的寒葱饮料感官评价最佳。寒葱饮料呈黄褐色，有寒葱独特的口味和香气，且有大枣的口味，甜度适中，而对比例1与对比例2用白砂糖代替桔梗蜂蜜糖，则寒葱饮料中存在辛辣味和焦糖味无法去除；对比例3与对比例4分别进行了寒葱鲜叶及桔梗发酵效果的对比，结果表明，未发酵寒葱鲜叶制备的寒葱饮料中即使添加了桔梗蜂蜜糖等调味剂，寒葱的辛辣味仍无法有效去除，而寒葱鲜叶及桔梗均未发酵制备的寒葱饮料，寒葱辛辣味去除效果差，且甜度不足。综上，将寒葱鲜叶进行发酵，结合发酵桔梗制备的桔梗蜂蜜糖能够掩盖寒葱的辛辣味和焦糖味，制得的寒葱饮料有大枣的口味，甜度适中。

实验例1：药理学试验-肝脏保护

1.材料与方法

1.1试验材料

实验原料为寒葱提取物(水提取物)；实验动物为周龄6～8，体重18～22g的雄性近交系BALB/c小鼠(购自吉林省长春市亿斯有限公司)。

1.2分组与给药

将小鼠称重后随机分为6组，每组6只，分别为正常组(Normal)，CCl₄模型组(CCl4-2mL/kg)，寒葱给药低剂量组(CCl₄+AV-100mg/kg)，寒葱给药中剂量组(CCl₄+AV-200mg/kg)，寒葱给药高剂量组(CCl₄+AV-300mg/kg)，和水飞蓟素组(CCl₄+Silymarin-100mg/kg)。正常组不进行灌胃，其它组别都使用上述剂量灌胃1周。

1.3急性肝损伤小鼠模型建立

除正常组外，所有组别的小鼠均在灌胃的最后一天一次性腹腔注射使用食用油溶解的10％CCl₄(2mL/kg)造急性肝损伤的模型。

腹腔注射16h后，小鼠吸入乙醚麻醉后，颈动脉取血1.5mL，室温下静置20min，用离心机以3500rpm离心30min，分离出血清，测定血清中ALT、AST水平。取血后立即剖腹采集小鼠肝脏，用4℃0.9％NaCl Saline轻轻洗净，滤纸吸干肝脏表面多余水分，将最大肝叶浸泡固定在10％的福尔马林溶液中，准备后续用于石蜡包埋、切片，观察H&E染色、免疫组化结果，或冷冻切片后进行免疫荧光等实验。剩余的其他肝叶平均分为五份，标记并储存在-80℃超低温冰箱内，后续用于蛋白免疫印迹与RT-PCR实验。

2.结果

2.1寒葱提取物对CCl₄诱导小鼠血清转氨酶及组织病理学影响

机体出现肝损伤时，肝细胞膜因磷脂过氧化而被破坏，血清转氨酶从细胞质流到血液中，进而使得血液中转氨酶表达水平显著升高，因此血清转氨酶的活力可以证明肝细胞的损伤程度。在本实验中通过对血清中转氨酶水平的表达进行检测，探究寒葱提取物对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤的改善作用。结合图1、图2所示，由实验结果可以看出，与正常组相比，给予小鼠单次腹腔注射CCl₄后，小鼠血清中ALT、AST表达水平显著升高；但是给予不同浓度的寒葱提取物后，小鼠血清中ALT、AST表达水平有所降低，说明寒葱提取物抑制了血清转氨酶类的活性，有效减轻了细胞的损伤。

2.2寒葱提取物对CCl₄诱导小鼠氧化应激的调控

GSH是一种抗氧化剂，防止活性氧，如自由基和过氧化物对重要细胞组分造成损害。GSH-ST是一类存在于动物与人类体内与肝脏解毒有关的酶，在肝细胞中存在量很大。GSH-ST的含量代表细胞是否发挥抗氧化作用；GSH-Px是具有过氧化物酶活性的酶家族的总称，其主要生物学作用是保护生物免受氧化损伤。因而GSH-ST以及GSH-Px的含量可作为肝脏损伤的敏感指标。本发明对肝脏中GSH-ST以及GSH-Px的活力进行检测，以探究寒葱提取物对CCl₄诱导的小鼠肝损伤的改善作用，表5所示，与正常组相比，CCl₄模型组的GSH-ST以及GSH-Px的水平含量明显下降；但是给予不同浓度的寒葱提取物以后，小鼠肝脏中GSH-ST以及GSH-Px的水平明显升高。

表5小鼠肝脏中GSH-ST和GSH-Px数值

注：数据表示为平均值±标准差，(n＝6)。与正常组相比^###p<0.001；与CCl₄组对比*p<0.05，***p<0.001。

表6小鼠肝MDA的数值

注：数据表示为平均值±标准差，(n＝6)。与正常组相比^###p<0.001；与CCl₄组对比*p<0.05，***p<0.001。

细胞膜脂质过氧化的终产物MDA的含量多少是可以当做检查肝脏细胞多大程度受到损害的指标之一。因此在实验中，对肝脏中MDA的表达水平进行检测。实验结果如表6所示，与正常组相比，CCl₄模型组小鼠肝脏中MDA的含量特别高，细胞损伤严重；但是给予寒葱提取物以后，MDA的表达水平显著降低，由此可以说明寒葱提取物给药后，可以在一定程度上改善CCl₄对小鼠肝细胞造成的不良影响。

2.3寒葱提取物对CCl4诱导小鼠肝炎症的影响

MPO是嗜中性粒细胞功能成熟和活化的指标。肝脏出现炎症反应时，MPO随着嗜中性粒细胞积聚而释放到炎症部位。检测寒葱提取物对CCl₄诱导急性肝损伤的小鼠肝脏中MPO的活性至关重要。

结合图3所示，蛋白免疫印迹实验结果中发现，与正常组相比，腹腔注射给予CCl₄后，MPO蛋白表达水平显著升高；但是给予不同浓度的寒葱提取物以后，MPO的蛋白表达水平显著下降；寒葱高剂量的灌胃效果与Silymarin的效果相当。说明寒葱提取物能抑制炎症部位MPO的活性，从而发挥抗炎作用。

任何原因导致的肝损伤一定伴随着炎症的出现，当肝脏受到炎症影响时，巨噬细胞将被招募。F4/80作为成熟巨噬细胞的表面标记分子，炎症的发生使得F4/80的阳性表达增加。结合图4所示，由蛋白印迹结果可以看出，与正常对照组相比，单次腹腔注射CCl₄会导致F4/80蛋白表达的增多。巨噬细胞成熟与活化后，会使得被释放出的炎症因子IL-1β、IL-1α、IL-18、IL-6、caspase-1的阳性表达的增加；给予灌胃不同浓度的寒葱提取物以后与模型组相比，F4/80的蛋白表达明显下降，炎症因子IL-1β、IL-1α、IL-18、IL-6、caspase-1等的蛋白表达水平也出现逐步降低的趋势。

结合图5所示，由炎症因子的基因水平的探究结果中可以看出，基因表达水平与蛋白表达水平的结果相一致。CCl₄可以在基因水平上诱导小鼠肝脏中炎症因子mRNA表达的增加。Caspase-1、IL-6、IL-18、IL-1β、IL-1α、TNF-αmRNA的表达水平呈现模型升高，给药逐步降低的趋势。说明寒葱提取物可以阻断caspase-1、IL-6、IL-18、IL-1β、IL-1α等炎症因子和炎性介质TNF-α的释放。

综上结果表明，寒葱提取物给药能够降低F4/80的阳性表达，抑制caspase-1的活化，阻止活化的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-1α、IL-18、IL-6等炎症相关因子的释放，寒葱提取物具有一定程度改善肝炎症的发生。

2.4寒葱提取物对CCl4诱导肝纤维化的影响

各种原因的肝损伤都会伴随着不同程度的肝纤维化，肝纤维化进程与机体炎性相关因子的调控有着密不可分的联系，CCl₄可导致肝脏炎性细胞因子的释放，甚至诱发小鼠肝纤维化的发生。为了研究寒葱提取物是否可以逆转CCl₄诱导的肝纤维化，因此测试了寒葱提取物对肝纤维化指标的表达造成的影响。

结合图6所示，由蛋白印迹实验结果可以看出，单次腹腔注射CCl₄后，小鼠肝脏中肝纤维化指标α-SMA、Collagen-Ⅰ和TIMP-1的表达均明显高于正常组；给予低、中、高浓度的寒葱提取物以后，与CCl₄组相比，小鼠肝脏中α-SMA、Collagen-Ⅰ和TIMP-1的蛋白表达呈显著下降的趋势。由此可以说明寒葱提取物可以在蛋白水平上抑制CCl₄诱导的小鼠肝脏中肝纤维化指标的阳性表达。

接着我们又对其进行了基因水平上的检测，结合图7，由实验结果可以看出寒葱提取物可以在基因水平上抑制单次腹腔注射CCl₄诱导的肝纤维化指标α-SMA、Collagen-Ⅰ和TIMP-1阳性表达的升高。实验结果可以表明，寒葱提取物可以在一定程度上逆转CCl₄导致的小鼠肝纤维化。

2.5寒葱提取物对CCl4诱导的细胞凋亡的作用

细胞凋亡的发生是通过caspase家族成员的激活来启动的，因此，研究又通过蛋白免疫印迹法对caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP以及其裂解片段进行探究。结合图8，实验结果发现，给予CCl₄腹腔注射造模的小鼠肝脏中caspase-3、caspase-8、caspase-9的裂解片段cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的蛋白表达明显增加，寒葱提取物却可以随着剂量的提高逐步下调这些不良变化。

PARP作为caspase-3的下游靶蛋白参与调控，能诱导肝细胞凋亡，而cIAP1、cIAP2可直接抑制下游caspase-3活性。结合图9，通过实验发现，高剂量的寒葱给药可以明显抑制PARP的裂解，不同剂量的寒葱提取物对于cIAP1、cIAP2的表达均有明显的激活作用，并呈现剂量依赖性。由此可以认定，寒葱提取物可以抑制CCl₄诱导的小鼠肝脏中发生细胞凋亡的现象。

在细胞凋亡的过程中Bcl-2家族成员是一类起着重要作用的蛋白质。该家族分为两大类，如Bcl-2和Bcl-xL是抑制凋亡的基因，而Bcl-xS/L和Bid是促进凋亡的基因。P53可特异性胁制Bcl-2的表达，因此P53的过度表达也是证明细胞凋亡的重要指标。Bid及其磷酸化形态p-Bid也是有关肝细胞凋亡的重要成员。在本研究中，如图10所示，发现给予小鼠腹腔注射CCl₄后，小鼠肝脏中Bcl-xS/L、Bid、p-Bid和P53的表达显著增加，Bcl-2和Bcl-xL的表达显著降低。但是给予不同浓度的寒葱提取物可以逆转这些由CCl₄诱导而产生的变化。综上得知，寒葱提取物可以调节Bcl-2家族相关蛋白的表达，发挥控制肝细胞凋亡进程的良好作用。

2.6寒葱提取物对STAT3信号通路的影响

结合图11所示，由蛋白印迹结果可以看出，与正常组相比，腹腔注射CCl₄后，虽然对小鼠肝脏中STAT3的表达基本上没有改变，但是肝脏中STAT3的磷酸化程度明显增加；给予不同浓度的寒葱提取物以后，小鼠肝脏中STAT3的磷酸化水平显著下降；寒葱提取物高剂量组的p-STAT3的蛋白表达水平比Silymarin组的p-STAT3的蛋白表达水平低，说明高剂量的寒葱可以有效降低STAT3的活化。

结果表明，寒葱提取物可以影响肝细胞的多种生物学特性，寒葱提取物可以增强机体抗氧化功能、减轻肝细胞的病变程度、遏止肝脏出现炎症反应、逆转肝纤维化的进程、抑制肝脏细胞的凋亡，从而改善CCl₄诱导的化学性肝损伤。

实验例2：药理学试验-生殖系统辅助保护

1.材料与方法

1.1试验材料

实验原料为寒葱提取物；试验动物：SD大鼠，雄性，月龄为4月，体重为200g±20g，试验雄性大鼠购于辽宁省长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001；雌性SD大鼠月龄为3月，体重为220g±20g，试验雌性大鼠购于延边大学动物试验中心。

1.2试验分组

试验动物雄性大鼠，适应性饲养一周，随机分配，分别为空白组，阳性对照组，模型对照组，寒葱提取物高剂量组、寒葱提取物中剂量组、寒葱提取物低剂量组，每组均8只。挑选出最佳剂量组进行阴茎海绵体的测定：空白组，模型组，寒葱提取物高剂量组每组均8只。

1.3大鼠肾阳虚模型的建立和给药

每日上午进行灌胃，除空白组外各组大鼠均肌肉注射氢化可的松注射液，每日一次，每只25mg/kg，连续14d。建立大鼠肾阳虚模型。

模型建立的第5d开始，每天上午进行灌胃给药。给药剂量如下：

(1)空白组：每只灌服生理盐水4m1，每日1次，连续28d。

(2)模型组：每只灌服生理盐水4m1，每日1次，连续28d。

(3)寒葱提取物高剂量组：每只灌服水提溶液1000mg/kg，每日一次，连续28d。

(4)寒葱提取物中剂量组：每只灌服水提溶液800mg/kg，每日一次，连续28d。

(5)寒葱提取物低剂量组：每只灌服水提溶液400mg/kg，每日一次，连续28d。

阳性对照组：每只13.5g/kg浓度灌胃(金匮肾气丸溶液)，每日一次，连续28d。

1.4测定指标

1.4.1大鼠性行为参数的测定

正式试验前48小时皮下注射苯甲酸雌二醇注射液30μg/只，4小时前再注射黄体酮注射液50μg/只，使雌鼠处于发情期。试验结束的最后一周，每天夜间19:00-22:00之间分别将各组雄性大鼠随机挑选一只与发情雌性大鼠1:1的比例合笼，在安静的试验室中进行交配试验，在笼子上方安装摄像头进行录像。统计各组大鼠的性行为参数，包括插入潜伏期(与雌鼠同笼至第1次插入阴道所需时间)、骑跨次数(与雌鼠同从骑跨到射精前进行的骑跨次数)、插入次数(射精前插入雌性大鼠阴道次数)。

1.4.2大鼠生殖功能的测定

大鼠生殖功能的测定包括大鼠性器官的脏器指数、大鼠精子活力及活率睾丸切片的显微结构观察、血清中睾酮含量、大鼠性激素含量、大鼠血清中超氧化物歧化酶与丙二醛含量以及大鼠阴茎海绵体中一氧化氮合酶与环磷酸鸟苷含量。

2.结果

2.1寒葱提取物对大鼠性行为的影响

寒葱提取物对大鼠性行为的影响如表7所示。与空白组相比，模型组插入潜伏期显著增加，插入次数，骑跨次数显著降低，说明氢化可的松已导致大鼠交配能力下降。通过灌服寒葱提取物后，寒葱提取物高剂量组大鼠与模型组相比显著地缩短了插入的潜伏期，高剂量组和中剂量组的插入次数和骑跨次数显著多于模型组；与阳性组相比：高剂量组的插入潜伏期，高、中、低剂量组的插入次数，高、中剂量组的骑跨次数与阳性组比较无显著性差异。说明寒葱提取物对肾阳虚大鼠的性行为有一定的促进作用，其中高剂量组的作用相当于阳性对照组的效果，并从与空白对照的比较结果来看，寒葱提取物高剂量灌服后可使大鼠的性行为基本恢复到正常的水平。

表7寒葱提取物对大鼠性行为的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)

2.2寒葱提取物对大鼠生殖器官脏器系数的影响

表8寒葱提取物对大鼠生殖器官脏器系数的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)

寒葱提取物对大鼠脏器系数的影响如表8所示。肾阳虚模型组生殖器官的脏器系数都显著低于空白组，说明氢化可的松导致大鼠生殖器官萎缩。寒葱提取物灌服处理组生殖器官的脏器系数显著高于模型组。寒葱提取物处理组的肾脏系数和附睾系数随着剂量的增加呈现上升的趋势，但是处理间无显著差异，并与阳性对照组相比也无显著差异。寒葱提取物处理组的睾丸脏器系数显著高于阳性组并高剂量组显著高于空白组；寒葱提取物高剂量组的精囊+前列腺脏器系数显著高于阳性组和空白组。由此可知寒葱提取物对肾阳虚大鼠的生殖器官具有增重的作用，尤其是高剂量组的效果尤为显著。

2.3寒葱提取物对大鼠精子活力和活率的影响

寒葱提取物对大鼠精子活力A级的比例如图12所示。肾阳虚模型组的精子活力A级的比例显著低于空白组，说明氢化可的松导致大鼠精子的活动能力下降。灌服寒葱提取物处理组大鼠附睾中的精子活力A级的比例都显著高于模型组(P<0.05)，寒葱提取物处理组的精子活力A级比例显著高于阳性组(P<0.05)。从图可以看出随着灌胃剂量的增加，精子活力A级的比例呈上升的趋势，高剂量组和中剂量组显著高于低剂量组。由此可以说明寒葱的水提物可以提高肾阳虚大鼠附睾中精子活力A级的比例，从与阳性对照的结果来看，灌服寒葱提取物高剂量组提高精子活力的效果优于阳性组。

寒葱提取物对大鼠精子活力A+B级的比例如图13所示。寒葱提取物处理组大鼠附睾中的精子活力A+B级的比例整体呈增长的趋势，其中寒葱提取物高剂量组大鼠附睾中的精子活力A+B级的比例都显著高于与肾阳虚模型组，且高剂量组显著高于阳性组，与空白组无显著差异。由此可以说明了寒葱提取物可以提高肾阳虚大鼠的精子活力。灌服高剂量的寒葱提取物对肾阳虚大鼠附睾中精子活力的改善效果优于阳性组，已经恢复到了正常大鼠的水平。

寒葱提取物对大鼠精子活率的影响如图14所示。寒葱提取物处理组中、高剂量组的大鼠附睾中精子活率显著高于模型组，且与阳性组相比无明显差异。由此可以说明寒葱提取物可以改善精子的活率从阳性的结果来看，灌服寒葱提取物中剂量组和高剂量组提高活率的作用相当于阳性对照组。

2.4寒葱提取物对大鼠血清中睾酮含量的影响

寒葱提取物对大鼠血清中睾酮的影响如表9所示。寒葱提取物处理组的大鼠血清中睾酮含量为138.387～146.383pg/ml，显著高于肾阳虚模型组的睾酮的含量114.862pg/ml说明寒葱提取物对肾阳虚模型大鼠血清中的睾酮水平有一定的提高作用。其中，中剂量和高剂量组的睾酮含量与阳性组之间无显著差异，但是低于空白组的睾酮含量161.640pg/ml，由此可知，中、高剂量的寒葱提取物灌服处理对肾阳虚大鼠血清中的睾酮含量增加效果相当于阳性药物处理的效果。

表9寒葱提取物对大鼠血清中睾酮含量的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)

2.5寒葱提取物对大鼠性激素的影响

表10寒葱提取物对大鼠血清中性激素的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)。CRH：促肾上腺皮质激素释放激素；LH：黄体生成素；GnRH：促性腺激素释放激素。

寒葱提取物对大鼠性激素的影响如表10所示。肾阳虚模型组的大鼠血清中CRH，GnRH，LH的含量与空白组无显著差异，说明氢化可的松导致了大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的激素内分泌紊乱。给肾阳虚大鼠进行寒葱提取物灌服处理后，除低剂量组的GnRH含量与模型组无显著差异外，其他处理组的CRH、GnRH和LH的含量都较模型组有显著的升高或降低。随着寒葱提取物灌服剂量的增加，大鼠血清中CRH含量逐渐增加，其中低、中剂量组的CRH含量与阳性对照组无显著差异，但是高剂量组的显著高于阳性组，并其含量基本达到空白组水平，为96.575U/mL。寒葱提取物低剂量和中剂量处理组的肾阳虚大鼠血清中LH含量显著高于阳性和空白对照组，高剂量组的含量略高于阳性组和空白组，但是无显著差异。随着寒葱提取物剂量的增加，大鼠血清中GnRH含量也增加，并不同剂量组之间其含量有显著差异，其中高剂量组的含量为28.287U/mL，基本接近于阳性对照组的29.420U/mL水平。说明经过灌服寒葱提取物对肾阳虚大鼠的下丘脑-垂体-性腺轴的激素内分泌功能具有调节作用，肾阳虚大鼠经灌服水提物高剂量后，CRH，LH，GnRH的分泌逐渐恢复到了正常水平。

2.6寒葱提取物对大鼠血清中MDA含量的影响

表11寒葱提取物对大鼠血清中MDA含量的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)

细胞膜脂质过氧化的终产物MDA是可以反映机体受自由基攻击严重程度的重要指标之一。寒葱提取物对大鼠血清中MDA含量的影响如表11所示。肾阳虚模型组的大鼠血清中MDA的含量为9.298nmol/mL，显著高于空白对照组的4.012nmol/mL，说明氢化可的松导致大鼠机体中的氧化因子积聚，机体受到损伤。经寒葱提取物灌服后，肾阳虚大鼠血清中MDA积累显著减少，并随着寒葱提取物灌服剂量的增加而下降。其中，水提物中剂量组血清中MDA含量略高于阳性组，为4.845nmol/mL，但无显著差异；高剂量组的MDA含量为4.243nmol/mL，略高于空白组，但两者间无显著性差异。由此可知，寒葱提取物在大鼠体内起到抗氧化作用，减轻机体的氧化损伤，且高剂量处理可以使机体的氧化损伤基本恢复。

2.7寒葱提取物对大鼠血清中SOD活力的影响

寒葱提取物对肾阳虚大鼠血清中SOD活力的影响如表12。由表可知，低、中、高剂量的寒葱提取物灌服处理的肾阳虚大鼠血清中SOD活力分别为92.872nmol/mL、104.202nmol/mL和115.660nmol/mL，均显著大于模型组，其中高剂量组的SOD活力显著大于中剂量和低剂量组，但是未达到阳性组(128.697nmol/mL)和空白组(124.415nmol/mL)的水平。说明寒葱提取物具有增强肾阳虚大鼠机体抗氧化的能力，但是其SOD活力未及金匮肾气丸药物的效果。

表12寒葱提取物对大鼠血清中SOD活力的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)

2.8寒葱提取物对大鼠阴茎海绵体中NOS和cGMP的影响

在机体内NOS的作用下释放一氧化氮，游离鸟苷酸环化酶被一氧化氮激活进而合成cGMP。大鼠阴茎海绵体中NOS活性和cGMP含量测定结果如表13所示。由表可知，肾阳虚模型组大鼠阴茎海绵体中NOS活性和cGMP含量显著低于空白组，说明模型组大鼠阴茎勃起机制受到了阻碍。经过寒葱提取物灌服处理后，大鼠阴茎海绵体中NOS活性和cGMP含量都得到了很好的提高和改善，寒葱提取物高剂量组和醇提物高剂量组的NOS活性为18.594U/mL和19.013U/mL，其活性大小均与阳性组无显著差异。寒葱提取物高剂量组的cGMP含量为9.549nmol/mL，显著高于寒葱醇提物高剂量组的cGMP含量8.679nmol/mL，但两者均低于阳性组。说明寒葱提取物可以提高NOS活性以及增加cGMP的量，从而起到改善肾阳虚大鼠的性功能，其效果基本接近金匮肾气丸。

表13寒葱提取物对大鼠阴茎海绵体中NOS和cGMP的影响(N＝8)

注:不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)

上述实验证明，寒葱提取物可以提高肾阳虚大鼠精液质量，对性行为有促进作用，促进生殖器官各脏器的增重，增强机体抗氧化功能，对下丘脑-垂体-性腺轴激素的分泌具有调节的作用，对睾丸组织的损伤有修复的作用，寒葱提取物能够增加阴茎海绵体中的NOS表达和cGMP的含量从而诱发睾丸勃起提高交配能力。寒葱提取物对生殖系统损伤的大鼠具有补助保护的作用。

以上试验结果证明，寒葱提取物可以增强机体抗氧化功能、减轻肝细胞的病变程度、遏止肝脏出现炎症反应、逆转肝纤维化的进程、抑制肝脏细胞的凋亡，从而改善CCl₄诱导的化学性肝损伤；且对大鼠的生殖系统具有损伤修复等补助保护作用。而本技术方案中的寒葱饮料取具备上述功能的寒葱提取物作为主要原料，制备而成的寒葱饮料同样具备肝脏保护和生殖系统补助保护的保健功能，能够为寒葱在肝脏保护和肾脏补助保护保健品的制备中提供参考。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种寒葱饮料，其特征在于：由如下质量份的原料制成，寒葱提取物冻干粉1-8份，大枣0.5～1.5份，枸杞0.5～1.5份和桔梗蜂蜜糖4～5份。

2.根据权利要求1所述的一种寒葱饮料，其特征在于：所述原料的质量份为寒葱提取物冻干粉5～8份，大枣1～1.5份，枸杞1～1.5份和桔梗蜂蜜糖4～5份。

3.根据权利要求2所述的一种寒葱饮料，其特征在于：所述原料的质量份为寒葱提取物冻干粉7份，大枣1份，枸杞1份和桔梗蜂蜜糖4.5份。

4.根据权利要求1所述的一种寒葱饮料，其特征在于：所述寒葱提取物冻干粉为寒葱水提取物冻干粉。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种寒葱饮料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤a，制备寒葱提取物，取寒葱鲜叶，将寒葱鲜叶固态发酵后，将发酵后的寒葱鲜叶用蒸馏水浸提后进行初次回流提取；过滤初次回流提取液，滤渣用蒸馏水二次回流提取后再过滤，将二次回流提取液的滤渣用蒸馏水三次回流提取，过滤后合并三次滤液；将合并后的滤液减压蒸馏至浸膏状得寒葱水提取物；

步骤b，制备寒葱提取物冻干粉，将步骤a中的寒葱水提取物置于-80℃下预冻4h后冷冻干燥48h得冻干物，将冻干物研磨成粉得寒葱提取物冻干粉；

步骤c，辅料预处理，将大枣、枸杞切碎后备用；

步骤d，制备桔梗蜂蜜糖，将桔梗去皮、清洗后进行固态发酵，将发酵后的桔梗进行干燥，干燥温度60℃，干燥后粉碎、过筛制得桔梗粉，将桔梗粉水浴提取后，过滤得桔梗提取液；将桔梗提取液与甜味剂混合搅拌溶解后，进行熬煮；熬煮后加入淀粉糖浆及蜂蜜搅拌混合后制得桔梗蜂蜜糖；

步骤e，寒葱饮料的调配，将粉碎后的枸杞和大枣置于水中煮沸，15min后滤出滤渣，并冷却，在冷却后的滤液中加入寒葱提取物冻干粉和桔梗蜂蜜糖，溶解后即得寒葱饮料；

步骤f，将寒葱饮料灌装。

6.根据权利要求5所述的一种寒葱饮料的制备方法，其特征在于：步骤a中，初次回流提取时，寒葱鲜叶与蒸馏水的料水比(W/V)为1:15；二次回流提取时，滤渣与蒸馏水的料水比(W/V)为1:10；三次回流提取时，滤渣与蒸馏水的料水比(W/V)为1:5。

7.根据权利要求5所述的一种寒葱饮料的制备方法，其特征在于：步骤d中，桔梗粉水浴提取的条件为提取温度80℃，提取时间3h，料水比(W/V)为1:25。

8.根据权利要求7所述的一种寒葱饮料的制备方法，其特征在于：步骤d中熬煮采用常压熬煮。

9.根据权利要求1-4任一所述的一种寒葱饮料用于肝脏保护保健品制备的应用。

10.根据权利要求1-4任一所述的一种寒葱饮料用于生殖系统补助保护保健品制备的应用。