CN109715204A - 新的ehv插入位点orf70 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及(载体)疫苗的领域，且尤其涉及新的EHV插入位点ORF70。本发明进一步涉及适于表达所关注的基因，尤其抗原编码序列的相关表达盒及载体。本发明的病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。

Description

新的EHV插入位点ORF70
序列表
本申请案含有根据37C.F.R.1.821-1.825的序列表。伴随本申请案的序列表的全部内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及(载体)疫苗的领域，且尤其涉及新的EHV插入位点ORF70。本发明进一步涉及适于表达所关注的基因，尤其抗原编码序列的相关表达盒及载体。本发明的病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。
背景技术
马病原体马α疱疹病毒1(马流产病毒，EHV-1)属疱疹病毒目(Herpesvirales)疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)水痘病毒属(Varicellovirus)。其是具有约150,000个碱基对的双链DNA基因组的大的包膜病毒。水痘病毒亚属的其他重要成员是人类α疱疹病毒3(水痘带状疱疹病毒)、猪α疱疹病毒1(伪狂犬病病毒)、牛α疱疹病毒1(感染性支气管炎病毒)及马α疱疹病毒4(马鼻肺炎病毒，EHV-4)(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy：2015年发布EC 47，London,UK，2015年7月；电子邮件批准2016(MSL编号30)EHV-1及EHV-4在全世界地方性流行并侵袭马。尽管EHV-4引起大部分上呼吸道轻度感染，但依赖于宿主的应变及免疫状态，EHV-1可引起全身感染自呼吸症状至流产及致死性脑脊髓病的一系列疾病。目前，在美国及欧洲，有两种针对EHV-1的经许可的修饰的活疫苗(MLV)：(BoehringerIngelheim)及(MSD)。两者均含有经典减毒的EHV-1 RacH毒株，其在猪上皮细胞中传代256次以进行减毒(Ma等人，2013)。减毒的机制已经在分子层级上进行了研究。Osterrieder等人(1996)显示RacH缺乏orf67的两个基因组拷贝且一个拷贝的恢复即足以恢复毒力。另外，RacH携带1283个bp的缺失，从而去除编码免疫抑制病毒蛋白的orf1的编码序列的90％以上。迄今为止，其他突变亦可能影响减毒，但尚未详细研究。此皆使RacH成为一种非常安全的疫苗毒株，此乃因通过在经疫苗接种的动物中传代而毒力返强是基本不可能的(若可能)。
具有马α疱疹病毒1(EHV-1)疫苗毒株RacH的整个基因组的大肠杆菌细菌人工染色体(BAC)的两种变体pRacH及pRacH-SE称作用于载体疫苗研发的平台。BAC pRacH-SE是基于pRacH产生，该pRacH是最初在Klaus Osterrieder,FU Berlin的实验室中克隆的BAC。pRacH缺失orf71编码糖蛋白II(gpII；Wellington等人，1996)。在其位置引入BAC载体序列及GFP表达盒。为了自pRacH复活未经修饰的EHV-1 RacH，必须与含有整个orf71加侧翼区的质粒共转染，使得在病毒复制过程期间经由同源重组使BAC载体序列部分及GFP表达盒经orf71替代，使初始RacH基因组恢复。pRacH在本发明中经修饰，使得在细胞培养物中转染后，BAC载体序列/GFP表达盒变得可自我切除(SE)(Tischer等人，2007)。此改良的BAC命名为pRacH-SE。pRacH及pRacH-SE二者皆可用作载体疫苗研发的平台，唯一区别是pRacH-SE显著地促进orf71修复的病毒的复活。
已显示，基于EHV-1 RacH的载体疫苗能够在包括猪、牛及狗在内的若干哺乳动物物种中引发免疫性(Rosas等人，2007，Rosas等人2008，Trapp等人，2005，Said等人2013)。编码病原体的抗原性蛋白的基因可由重组EHV-1 RacH表达。EHV-1-RacH基因组在大肠杆菌中以其BAC形式经操控，并通常通过插入转基因表达盒经调整以表达其他蛋白质(Tischer等人，2010)。在培养的允许细胞中转染pRacH-SE DNA后，EHV-1复制由细胞转录因子起始。病毒DNA聚合酶的活性导致缺失所有BAC载体相关序列及EHV-1 RacH基因组恢复至其初始状态。产生与RacH无法区分的传染病毒。
当通过(例如)插入转基因表达盒在大肠杆菌中操纵pRacH-SE时，在允许的细胞中转染后重构的病毒将具有修饰形式并将表达其他基因。重组EHV-1 RacH可用作载体疫苗。
野生型EHV-1毒株在其基因组的长独特区段(序列坐标1298-3614；图1)的一端具有三个开放阅读框(orf)，称为orf1、orf2及orf3。Orf1及orf3连续布置于DNA的一条链上，而orf 2由互补链编码。疫苗毒株RacH在影响orfs 1及2的该区域中具有1283个bp缺失，指示该基因对于病毒复制是非必需的。因此，该位点用作转基因插入位点。此插入位点称为ORF1/3。
然而，可插入至ORF1/3插入位点中的转基因的大小及数量通常是有限的。因此，为了增强EHV-1载体的能力，对于自EHV-1载体，尤其重组EHV-1 RacH载体插入并表达转基因的新颖的替代方法存在未满足的需求。
发明简述
为了增强EHV-1载体的能力，本发明提供自EHV-1载体主链插入及表达转基因的新颖替代性方式。
本发明涉及可用于自EHV-1载体，尤其重组EHV-1 RacH插入转基因序列及表达转基因蛋白的新颖替代性转基因插入位点ORF70。
EHV-1载体中的新“ORF70插入位点”的特征在于相对于ORF70的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类。预计完全ORF70的缺失将对病毒复制及因此疫苗制造及效能是不利的，此乃因ORF70的完全缺失将影响编码gpII的ORF71的启动子。新ORF70插入位点和/或插入(表达盒)至ORF70中是以ORF71保持功能或完整的方式在功能上经定义。
在具体方面中，ORF70插入位点涵盖RacH的ORF70内约801bp部分(SEQ ID NO.:20)或其70％、80％、85％、90％、95％、99％同源序列的缺失。RacH基因组序列中的缺失部分显示为SEQ ID NO.:20(由于完全RacH基因组序列未知，无可用核苷酸编号)。在另一具体方面中，ORF70插入位点涵盖野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内的理论801bp缺失。缺失部分位于核苷酸127681与128482之间的野生型ab4(Genbank登录号AY665713.1)基因组序列(SEQ ID NO.:19)中。
在本发明中，“侧翼区”将包含所关注的序列或基因，优选抗原编码序列的表达盒的重组引导至EHV-1基因组中。该侧翼区天然存在于EHV-1中。Up70侧翼区(417bp，SEQ IDNO.:13)及Up71侧翼区(431bp，SEQ ID NO.:14)经选择用于所有用于orf70位点的转移载体/质粒的经典同源重组。在野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中，相应序列位于核苷酸127264-127680(侧接orf70上游区域，SEQ ID NO.:15)及128483-128913(侧接orf71上游区域，SEQ ID NO.:16)。对于RED重组，由于XbaI限制性消化，侧翼区经截短。该经截短的侧翼区与上述417bp“经典”侧翼区(Up70侧翼区，SEQ ID NO.:13)的3’283bp及431bp“经典”侧翼区(Up71侧翼区，SEQ ID NO.:14)的5’144bp相同。该经截短的侧翼区命名为Up70侧翼区(283bp)(如SEQ ID NO.:17所包括)及Up71侧翼区(144bp)(如SEQ ID NO.:18所包括)。该各个侧翼区定义相同ORF70插入位点。侧翼区总是成对使用一个“左”侧翼区(例如EQ ID NO.:13、15、17)及一个“右”侧翼区(例如SEQ ID NO.:14、16、18)。
图3中转移质粒pU-mC70-BGH(SEQ ID NO.:21)、图4中转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO.:22)及图5中转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO.:23)的质粒/载体图谱是包含包括新ORF70插入位点的表达盒的载体的实例。图10中转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO.:24)及图11中转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO.:25)的质粒/载体图谱是包含包括ORF1/3插入位点的表达盒的载体的实例。
本发明进一步涉及EHV-1载体，其在不偶联两个转基因的情况下在一个启动子控制下通过RNA-病毒源功能(2a肽，IRES位点)自一个载体主链表达两个不同转基因。
本发明进一步涉及马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，优选RacH或RacH-SE，其包含插入新颖ORF70插入位点中的所关注的第一序列或基因及插入确立插入位点(例如ORF1/3)中的所关注的第二序列或基因。另外，本发明进一步涉及基于其他疱疹病毒、特定而言α疱疹病毒、特定而言水痘病毒(包括马α疱疹病毒3(EHV-3)、马α疱疹病毒4(EHV-4)、马α疱疹病毒8(EHV-8)、马α疱疹病毒9(EHV-9)、牛α疱疹病毒1(BHV-1)、牛α疱疹病毒5(BHV-5)、犬α疱疹病毒1及猫α疱疹病毒1)的载体。
本发明进一步涉及包含此类载体的哺乳动物宿主细胞及使用此类宿主细胞生成载体疫苗的方法、以及包含本发明的马α疱疹病毒1(EHV-1)载体的免疫原性组合物及疫苗。
因此，上述技术问题的解决方案是通过申请专利范围中表征的说明及实施例实现，且本发明的不同方面是根据申请专利范围执行。
此类性质容许产生基于EHV-1 RacH的重组载体疫苗，其自新近阐述的ORF70插入位点表达至少一种抗原或自新近阐述的ORF70插入位点及另一插入位点(如ORF1/3)以类似效率平行表达至少两种不同抗原。若疫苗靶由两种不同病原体组成，则与确立插入位点(如ORF1/3)平行的新颖ORF70插入位点的施加可显著降低商品成本且相对于仅表达一种抗原性组分的载体具有明显优点。
发明详述
本发明解决了先前技术中固有的问题并提供了先前技术的显著进步。
通常，本发明提供包含以下的表达盒：
(i)至少一个所关注的外源核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列，其中该所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列可操作连接至启动子序列，及
(ii)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQ ID NO.:15及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、及SEQ ID NO.:17及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列，及
(iii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:14及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQ ID NO.:16及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、及SEQ ID NO.:18及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
本发明进一步提供马疱疹病毒(EHV)，具体而言马α疱疹病毒，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9，更具体而言马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体而言包含本发明的表达盒的毒株RacH。
本发明提供马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，优选地包含本发明的表达盒的毒株RacH。
此外，本发明涉及马疱疹病毒(EHV)，具体而言马α疱疹病毒，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9，更具体而言马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体而言包含以下的毒株RacH：
(i)至少一个所关注的外源核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列，其中该所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列可操作连接至启动子序列，及
(ii)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQ ID NO.:15及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、及SEQ ID NO.:17及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列，及
(iii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:14及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQ ID NO.:16及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、及SEQ ID NO.:18及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
本发明进一步涉及马疱疹病毒(EHV)，具体而言马α疱疹病毒，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9，更具体而言马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体而言毒株RacH，其包含插入ORF70中的所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列。
本发明进一步涉及马疱疹病毒(EHV)，具体而言马α疱疹病毒，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9，更具体而言马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体而言毒株RacH，其包含插入ORF70中的所关注的第一核苷酸序列或基因，优选抗原编码序列，及插入第二插入位点，优选ORF1/3中的所关注的第二核苷酸序列或基因，优选另一抗原编码序列。在本发明的该EHV-1载体的具体方面中，至少两个所关注的基因可操作连接至调节序列，优选启动子序列。
在本发明载体的具体方面中，插入至ORF70中的特征在于ORF70的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类，其中ORF71保持功能。
在本发明载体的另一具体方面中，插入至ORF70中的特征在于对于RacH的ORF70内约801bp部分(SEQ ID NO.:20)或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列的缺失。
在本发明载体的另一具体方面中，插入至ORF70中的特征在于RacH的ORF70内约801bp部分(SEQ ID NO.:20)的缺失，或任何其他毒株中其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列缺失。
在本发明载体的又一具体方面中，插入至ORF70中的特征在于野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内约801bp部分的缺失，其中野生型ab4基因组序列中的缺失部分位于核苷酸127681与128482之间(SEQ ID NO.:19)；或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列的缺失。
在本发明载体的又一具体方面中，插入至ORF70中的特征在于野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内约801bp部分的缺失，其中野生型ab4基因组序列中的缺失部分位于核苷酸127681与128482之间(SEQ ID NO.:19)；或任何其他毒株中其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列的缺失。
在本发明载体的又一具体方面中，EHV载体、具体而言EHV-1载体包含至少一个选自由以下组成的群的侧翼区：SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15、SEQ IDNO.:16、SEQ ID NO.:17及SEQ ID NO.:18以及这些序列中的任一者的70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
在本发明载体的另一具体方面中，EHV载体、具体而言EHV-1载体包含(i)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:15及SEQ ID NO.:17，及(ii)至少一个的选自由以下组成的群右ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16及SEQ ID NO.:18。
在本发明的载体或表达盒的又一具体方面中，该所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列是非天然和/或重组的。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，该所关注的核苷酸序列是重组的和/或异源和/或外源的。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，该抗原编码序列涉及感染产食性动物(例如猪和/或牛)的病原体。
a)在本发明的载体或表达盒的具体方面中，该抗原编码序列涉及感染猪的病原体。在又一具体方面中，该病原体是猪流行性感冒A病毒(IAV)。在又一具体方面中，该抗原是血凝素(HA)抗原，尤其该血凝素抗原是源自流行性感冒A病毒。举例而言，流行性感冒A病毒是流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/116114/2010(H1N2))、流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))、流行性感冒A病毒(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))和/或流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/4675/2003(H1N2))。在又一具体方面中，该抗原包含由选自由以下组成的群的SEQ ID NO编码的序列或由其组成：SEQ ID NO.:26、27、28及29。在另一具体方面中，该抗原包含编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的序列或由其组成。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，该抗原编码序列涉及感染牛的病原体。在又一具体方面中，该病原体是施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)。在又一具体方面中，该抗原是SBV的Gc蛋白(SBV-Gc)。在更具体方面中，该抗原是截短形式的SBV-Gc，例如SBV-Gc的编码区的234氨基酸部分。在具体方面中，SBV-GC的编码区的该234氨基酸部分是源自SBV糖蛋白Gc的氨基-末端。在又一具体方面中，SBV-GC的编码区的该234氨基酸部分经修饰以实现有效转运至感染细胞的质膜并插入其中(例如通过将信号肽插入SBV-Gc的序列中和/或通过将跨膜锚肽插入SBV-Gc的序列中)，和/或该234氨基酸部分经密码子使用优化用于在EHV-1中表达，和/或将GS接头(例如SEQ ID NO.:30)插入Gc部分与信号肽/跨膜锚之间。在又一具体方面中，该抗原是由与如SEQ ID NO:31中所阐述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％相同性的序列编码。在另一具体方面中，该抗原包含由SEQ ID NO.:31编码的序列或由其组成。
在本发明载体的具体方面中，所关注的基因可操作连接至调节序列，优选启动子序列。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，该载体或表达盒进一步包含至少一个其他额外调节序列，例如终止信号或多聚腺苷酸化序列。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，该载体或表达盒进一步包含额外调节序列，例如终止信号和/或多聚腺苷酸化序列。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，该载体或表达盒进一步包含至少一个所关注的其他核苷酸序列，优选所关注的另一基因，更优选抗原编码序列。在一个方面中，经由(例如)IRES/2a肽将至少一个所关注的其他核苷酸序列，优选所关注的另一基因，更优选抗原编码序列插入相同插入位点ORF70中。在另一方面中，将该载体或表达盒包含至少一个所关注的其他核苷酸序列，优选所关注的另一基因，更优选抗原编码序列插入另一插入位点中，优选插入ORF1/3中。
在本发明的载体或表达盒的具体方面中，至少两个所关注的基因可操作连接至调节序列，优选启动子序列。
在本发明的载体或表达盒的又一方面中，可操作连接至一个或两个或更多个所关注的序列或基因的启动子序列是选自由以下组成的群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子、4pgG600(SEQ ID No.1)的功能片段(优选地该功能片段是p430(SEQ ID NO.:3))、4pgG600(SEQ ID No.1)的互补核苷酸序列的功能片段、4pMCP600(SEQ ID No.2)的功能片段(优选地该功能片段是p455(SEQ ID NO.:4))、4pMCP600(SEQ ID No.2)的互补核苷酸序列的功能片段。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，可操作连接至至少两个所关注的基因的激活子序列是不同的。
在本发明的载体或表达盒的另一具体方面中，可操作连接至至少一个所关注的基因的激活子序列是p455(SEQ ID No.4)或其功能片段或衍生物或其互补核苷酸序列，且其中可操作连接至另一所关注的基因的启动子序列是p430(SEQ ID No.3)或其功能片段或衍生物或其互补核苷酸序列。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体(例如转移质粒pU-mC70-BGH(SEQ ID NO:21)、和/或转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO.:22)、和/或转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO.:23)、和/或转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO.:24)、和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQID NO.:25))的orf1/3位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体的orf70位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体及调节性核酸，优选启动子，优选p430(例如转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQID NO.:24)、和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO.:25))的orf1/3位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体及调节性核酸，优选启动子，优选p455(例如转移载体pU70-p455-71K71(SEQ IDNO.:22)、和/或转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO.:23))的orf70位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体及调节性核酸，优选启动子，优选p430(例如转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQID NO.:24)、和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO.:25))的orf1/3位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体及调节性核酸序列，优选启动子，优选p430及第二调节性核酸，优选多聚腺苷酸化序列，优选BGH多聚腺苷酸化序列(例如转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO.:24)、和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO.:25))的orf1/3位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及包含用于同源重组或RED介导的重组(参见上文所述的二者)至病毒载体基因组中的特异性靶位点中，优选重组至EHV载体、具体而言EHV-1、更具体而言RacH载体及调节性核酸序列，优选启动子，优选p455，及第二调节性核酸，优选多聚腺苷酸化序列，优选71pA多聚腺苷酸化序列(例如转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO.:22)、和/或转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO.:23))的orf70位点中的侧翼区的质粒。
本发明进一步涉及产生本发明的载体的方法，其包含：
a.将所关注的第一核苷酸序列，优选所关注的基因，例如抗原编码序列插入ORF70中，
b.任选地可操作连接该所关注的第一基因与调节性核酸序列/启动子序列，优选p455或p430。
c.任选地可操作连接该所关注的第一基因与(其他)调节性核酸，例如多聚腺苷酸化序列，优选71pA或BGHpA。
在具体方面中，该方法进一步包含
d.将所关注的核苷酸序列，优选所关注的第二基因插入第二插入位点，优选ORF1/3中，
e.任选地可操作连接该所关注的第二基因与调节性核酸序列/启动子序列，优选p455或p430。
f.任选地可操作连接该所关注的第一基因与调节性核酸，例如多聚腺苷酸化序列，优选71pA或BGHpA。
本发明进一步涉及由本发明的载体、任选的转染试剂及插页说明书组成的试剂盒。
本发明亦涉及特征在于包含本发明的载体的哺乳动物宿主细胞。
本发明进一步涉及制备宿主细胞的方法，其特征在于以下步骤：
a.用本发明的载体感染本发明的哺乳动物宿主细胞，
b.在适宜条件下培养经感染细胞，
c.任选地收获该宿主细胞。
本发明进一步涉及马疱疹病毒(EHV)载体、具体而言马α疱疹病毒(例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)、更具体而言马α疱疹病毒1(EHV-1)载体、最具体而言RacH中的ORF70作为该马疱疹病毒(EHV)载体中的插入位点的用途，其中该插入位点支持/有利于所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，例如抗原编码序列的表达，其中包含ORF70的部分缺失、截短、取代、修改或诸如此类的该ORF70插入位点及其中ORF71保持功能。
本发明进一步涉及本发明的载体或本发明的哺乳动物宿主细胞的用途，其用于制造免疫原性组合物或疫苗。
本发明进一步涉及包含以下的免疫原性组合物：
a.本发明的载体，和/或
b.由本发明的载体表达的多肽，例如病毒、经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)或诸如此类，及
c.任选的医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地该载剂适于经口、皮内、肌内或鼻内施加，
优选地该免疫原性组合物包含病毒。在具体方面中，该病毒是感染性病毒。
本发明进一步涉及包含以下的疫苗或医药组合物：
a.本发明的载体，和/或
b.由本发明的载体(例如病毒、经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)或诸如此类)表达的多肽，及
c.医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地该载剂适于经口、皮内、肌内或鼻内施加，
d.任选地该疫苗进一步包含佐剂。
本发明展现在各种物种，尤其猪及牛中使用本发明的载体或表达盒的成功的疫苗接种。举例而言，显示基于在新近阐述的ORF70插入位点中表达经修饰施马伦贝格病毒(SBV)抗原的EHV-1 RacH的实验疫苗构建体在牛中有效(参见实例9)。所有经疫苗接种的动物在经有毒力的施马伦贝格病毒攻击后皆显示降低的病毒复制程度，如通过量化反转录PCR(qRT-PCR)所评估。四只经疫苗接种的动物中的两只经完全保护，贯穿整个取样时段未检测到病毒复制。在该组中的其他两只动物中，通过qRT-PCR检测SBV基因组复制，但较攻击对照组中的程度低。(图27A)。此外，在未经疫苗接种的对照动物中，在攻击感染之前通过血清中和测试未检测到SBV特异性抗体。自感染后一周或两周内，所有未经疫苗接种的动物中皆可检测到中和抗体(图27B)。与未经疫苗接种的对照组相比，在攻击感染当天，在经rEHV-SBV-Gc免疫的四头牛中的两头中可检测到SBV特异性中和抗体。在该组的其余两只动物中，在攻击感染之前未检测到SBV特异性中和抗体，但在感染后两周，存在中和抗体(图27B)。所有四只动物中的SBV特异性中和抗体皆低于攻击对照，指示攻击后病毒复制强烈减少。
因此，在具体方面中，该免疫原性组合物或疫苗或医药组合物包含本发明的载体或表达盒，其中该抗原编码序列涉及感染牛的病原体。在又一具体方面中，该病原体是施马伦贝格病毒(SBV)。在又一具体方面中，该抗原是SBV的Gc蛋白(SBV-Gc)。在更具体方面中，该抗原是截短形式的SBV-Gc，例如SBV-Gc的编码区的234氨基酸部分。在具体方面中，SBV-GC的编码区的该234氨基酸部分是源自SBV糖蛋白Gc的氨基-末端。在又一具体方面中，SBV-GC的编码区的该234氨基酸部分经修饰以实现有效转运至感染细胞的质膜并插入其中(例如通过将信号肽插入SBV-Gc的序列中和/或通过将跨膜锚肽插入SBV-Gc的序列中)，和/或该234氨基酸部分经密码子使用优化用于在EHV-1中表达，和/或将GS接头(例如SEQ IDNO.:30)插入Gc部分与信号肽/跨膜锚之间。在又一具体方面中，该抗原是由与如SEQ IDNO:31中所阐述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％相同性的序列编码。在另一具体方面中，该抗原包含由SEQ ID NO.:31编码的序列或由其组成。
此外，在另一具体方面中，该免疫原性组合物或疫苗或医药组合物包含本发明的载体或表达盒，其中该抗原编码序列涉及感染猪的病原体。在又一具体方面中，该病原体是猪流行性感冒A病毒(IAV)。在又一具体方面中，该抗原是血凝素(HA)抗原，尤其该血凝素抗原是源自流行性感冒A病毒。举例而言，流行性感冒A病毒是流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/116114/2010(H1N2))、流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))、流行性感冒A病毒(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))和/或流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/4675/2003(H1N2))。在又一具体方面中，该抗原包含由选自由以下组成的群的SEQ ID NO编码的序列或由其组成：SEQ ID NO.:26、27、28及29。在另一具体方面中，该抗原包含编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的序列或由其组成。
本发明进一步涉及制备用于降低一或多种与感染相关或由感染引起的临床体征的发病率或严重程度的免疫原性组合物或疫苗的方法，该方法包含以下步骤：
a.用本发明的载体感染本发明的哺乳动物宿主细胞，
b.在适宜条件下培养经感染细胞，
c.收集感染的细胞培养物，
d.任选地纯化步骤c)的收集的感染的细胞培养物
e.任选地混合该收集的感染的细胞培养物与医药上可接受的载剂。
医学用途：
本发明进一步涉及本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于减轻或预防动物中由病原体感染引起的临床体征或疾病的方法中，或用于治疗或预防动物病原体感染的方法中，该动物优选是产食性动物，例如猪或牛，尤其猪。
本发明进一步涉及针对动物(例如产食性动物，包括猪)中由病原体引起的临床疾病对该动物进行免疫的方法，该方法包含向该动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗的步骤，其中该免疫原性组合物或疫苗不能引起感染的临床体征，但能诱导针对该病原体的病原体形式对动物进行免疫的免疫反应。
在本发明上述医学用途或如上文所述对动物进行免疫的方法的具体方面中，该抗原编码序列涉及感染猪的病原体。在又一具体方面中，该病原体是猪流行性感冒A病毒(IAV)。在又一具体方面中，该抗原是血凝素(HA)抗原，尤其该血凝素抗原是源自流行性感冒A病毒。举例而言，流行性感冒A病毒是流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/116114/2010(H1N2))、流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))、流行性感冒A病毒(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))和/或流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/4675/2003(H1N2))。在又一具体方面中，该抗原包含由选自由以下组成的群的SEQ ID NO编码的序列或由其组成：SEQ IDNO.:26、27、28及29。在另一具体方面中，该抗原包含编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所阐述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的序列或由其组成。
c)在本发明上述医学用途或如上文所述对动物进行免疫的方法的另一具体方面中，该抗原编码序列涉及感染牛的病原体。在又一具体方面中，该病原体是施马伦贝格病毒(SBV)。在又一具体方面中，该抗原是SBV的Gc蛋白(SBV-Gc)。在更具体方面中，该抗原是截短形式的SBV-Gc，例如SBV-Gc的编码区的234氨基酸部分。在具体方面中，SBV-GC的编码区的该234氨基酸部分是源自SBV糖蛋白Gc的氨基-末端。在又一具体方面中，SBV-GC的编码区的该234氨基酸部分经修饰以实现有效转运至感染细胞的质膜并插入其中(例如通过将信号肽插入SBV-Gc的序列中和/或通过将跨膜锚肽插入SBV-Gc的序列中)，和/或该234氨基酸部分经密码子使用优化用于在EHV-1中表达，和/或将GS接头(例如SEQ ID NO.:30)插入Gc部分与信号肽/跨膜锚之间。在又一具体方面中，该抗原是由与如SEQ ID NO:31中所阐述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％相同性的序列编码。在另一具体方面中，该抗原包含由SEQ ID NO.:31编码的序列或由其组成。
本发明亦涉及用于针对与病原体相关的疾病对动物(优选产食性动物，例如猪或牛)疫苗接种和/或降低动物中一或多种与病原体相关或由病原体引起的临床体征的发病率或严重程度的试剂盒，其包含：
a)能向该动物施用疫苗的分配器；及
b)本发明的免疫原性组合物或疫苗，及
c)任选的插页说明书。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与归档时熟习本发明所属技术领域者通常所了解含义相同的含义。术语的含义及范畴应当明确；然而，在任何潜在的模糊性的情况下，本文提供的定义先于任何辞典或外在定义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语包括复数形式且复数术语包括单数。在本文中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其他形式(例如“includes”及“included”)不具有限制性。本文中提及的所有专利及出版物皆以引用方式并入本文中。
除非另外指示，否则本发明实践将采用熟习此项技术者熟知的病毒学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学的习用技术。这些技术全面阐释于文献中。参见(例如)Sambrook、Fritsch及Maniatis、Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第I、II及III卷，第2版(1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986)；Perbal,B.,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；the series,Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Protein purification methods-a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal编辑，IRL Press at Oxford University Press)；及Handbookof Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编辑，1986,Blackwell Scientific Publications)。
应当理解，在详细阐述本发明之前，本发明并不限于特定DNA、多肽序列或过程参数，因此，当然可变。亦应理解，本文所用术语仅是出于阐述本发明的特定实施例的目的，而非意欲为限制性。必须注意，除非上下文另外明确说明，否则本说明书及随附申请专利范围中所用的单数形式“一(a及an)”及“该(the)”包括复数个指示物。因此，例如，在提及“抗原”时包括两种或更多种抗原的混合物，在提及“赋形剂”时包括两种或更多种赋形剂的混合物，及诸如此类。
分子生物学定义
如业内已知的术语“载体”是指用于将遗传物质传递至宿主细胞的多核苷酸构建体，通常为质粒或细菌人造染色体。载体可为(例如)细菌、病毒、噬菌体、细菌人造染色体、黏粒或质粒。如本文使用的载体可由DNA或RNA组成或含有DNA或RNA。在一些实施例中，载体由DNA组成。在一些实施例中，载体是感染性病毒。该病毒载体含有以携带外源基因的方式经操控的病毒基因组，其在细胞培养物中以及宿主动物中病毒载体的复制中具有功能。根据本发明的具体方面，载体可用于各种方面，例如仅传递遗传物质，用于转染宿主细胞或生物体，用作疫苗(例如DNA疫苗)或用于基因表达目的。基因表达是阐述如由称为基因的特异性多核苷酸序列引导的细胞中蛋白质的生物合成的术语。在具体方面中，载体可为“表达载体”，其是当其存在于适当环境中时能够引导由载体携带的一或多种基因编码的蛋白质的表达的载体。
载体及制备和/或使用载体(重组体)进行表达的方法可通过以下中揭示的方法或类似于这些方法来进行：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virus vectors tovaccination:An update”，PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Geneticallyengineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,andsafety”，PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编辑),Methods in Molecular Biology 39,“Baculovirus Expression Protocols”(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”，Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；于1986年10月16日提出的美国申请案第920,197号；EP专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function of herpes simplex virus genes:Aprimer for genetic engineering of novel vectors”，PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineered herpessimplex viruses to the treatment of experimental brain tumors”，PNAS USA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors for genedelivery to B lymphocytes”，PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications”，PNAS USA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；容许的美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号，二者皆是于1996年7月3日提出申请(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，“Adenovirus as cloning vectors”，Seminars in Virology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham,Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,induces protective immunity in animal models ofherpes simplex virus-2disease”,PNAS USA 93:11414-11420,1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature，及尤其Furth等人，AnalyticalBiochemistry,relating to DNA expression vectors。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人，(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology第9卷，第271-283页(1997)，(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的用途)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文中引用的其他文件。
术语“病毒载体”阐述通过重组DNA技术操纵的经遗传修饰的病毒，使得其进入宿主细胞产生特异性生物活性，例如由载体携带的转基因的表达。在具体方面中，转基因是抗原。病毒载体在靶细胞、组织或生物体中可复制胜任或可不复制胜任。
病毒载体的产生可使用业内熟知的任何适宜基因工程技术来完成，包括但不限于限制内核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化、DNA测序、细胞培养物转染的标准技术，例如如以下中所述：Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press,N.Y.(1989))或K.Maramorosch及H.Koprowski(Methods inVirology Volume VIII,Academic Press Inc.London,UK(2014))。
病毒载体可纳入来自任何已知生物体的基因组的序列。序列可以其天然形式纳入或可以任何方式经修饰以获得期望活性。举例而言，序列可包含插入、缺失或取代。
病毒载体可包括两种或更多种所关注的蛋白质的编码区。举例而言，病毒载体可包括所关注的第一蛋白质的编码区及所关注的第二蛋白质的编码区。所关注的第一蛋白质及所关注的第二蛋白质可相同或不同。在一些实例中，病毒载体可包括所关注的第三或第四种蛋白质的编码区。所关注的第三及第四蛋白质可相同或不同。由一种病毒载体编码的两种或更多种所关注的蛋白质的总长度可变。举例而言，两种或更多种蛋白质的总长度可为至少约200个氨基酸。至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。
优选病毒载体包括(例如)源自EHV-1或EHV-4或其他水痘病毒(如PrV(伪狂犬病病毒)或BHV-1(牛疱疹病毒1))的疱疹病毒载体。
根据本发明的具体方面，术语“病毒载体”或“病毒构建体”是指源自病毒的重组病毒构建体，其选自疱疹病毒科，例如EHV-1、EHV-4。优选病毒载体包括(例如)源自EHV-1或EHV-4的疱疹病毒载体。
术语“病毒载体”及“病毒构建体”可互换使用。
如本文所用术语“构建体”是指人工产生的重组核酸，例如质粒、BAC或重组病毒。
术语“质粒”是指独立于细菌宿主细胞内的细菌染色体复制的细胞质DNA。在本发明的具体方面中，术语“质粒”和/或“转移质粒”是指用于构建(例如)表达盒用于插入病毒载体中的重组DNA技术的组件。在另一具体方面中，术语“质粒”可用于指定可用于DNA疫苗接种目的的质粒。
如本文所用术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任何核酸。
如本文所用的术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“RNA序列”或“DNA序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分，且是指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可为单链或双链且代表有义链或反义链。序列可为非编码序列、编码序列或二者的混合物。本发明的核酸序列可使用熟习此项技术者熟知的标准技术来制备。
术语“核酸”及“多核苷酸”亦具体而言包括由除5种生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基组成的核酸。
术语“调节性核酸”、“调节组件”及“表达控制组件”可互换使用，且是指可影响特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的表达的核酸分子。这些术语广泛用于并涵盖促进或调节转录的所有组件，包括启动子、启动子序列、RNA聚合酶及转录因子的基本相互作用所需的核心组件、上游组件、增强子及反应组件。原核生物中的实例性调节组件包括启动子、操纵子序列及核糖体结合位点。真核细胞中使用的调节组件可包括但不限于转录及翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入位点(IRES)、小核糖核酸病毒2A序列及诸如此类，其提供和/或调节宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生。
“内部核糖体进入位点”或“IRES”阐述独立于IRES的基因5′在功能上促进翻译起始并容许两个顺反子(开放阅读框)自动物细胞中的单个转录物翻译的序列。IRES提供独立的核糖体进入位点用于在其下游立即翻译开放阅读框。不同于可是多顺反子、即编码自mRNA顺序翻译的几种不同多肽的细菌mRNA，动物细胞的大部分mRNA是单顺反子，且编码仅一种多肽的合成。在真核细胞中具有多顺反子转录物，翻译将自最5′翻译起始位点起始，终止于第一终止密码子，且转录物将自核糖体释放，导致仅翻译mRNA中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有可操作连接至转录物中的第二或后续开放阅读框的IRES的多顺反子转录物容许该下游开放阅读框的顺序翻译以产生由相同转录物编码的两种或更多种多肽。IRES可具有不同长度且来自各种来源，例如，脑心肌炎病毒(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒、FMDV或脊髓灰白质炎病毒(PV))或C型肝炎病毒(HCV)。各种IRES序列及其在载体构建中的用途已经阐述且为业内所熟知。下游编码序列可在不负面地影响下游基因的表达的任何距离可操作连接至IRES的3'端。IRES与下游基因开始之间的最佳或允许的距离可以容易地通过改变距离及测量随距离变化的表达来测定。
术语“2a”或“2a肽”是指阐述为2a及“2a样”的短寡肽序列，其用作能够通过定义为核糖体跳跃的过程介导蛋白质之间的共翻译裂解的接头。可使用这些2a及“2a样”序列(来自小核糖核酸病毒科及其他病毒或细胞序列)将多个基因序列浓缩成单个基因，确保其在相同细胞内共表达(参见Luke及Ryan，2013)。
如本文所用术语“启动子”或“启动子序列”是指允许RNA聚合酶结合并引导基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区中，靠近基因的转录起始位点。在起始转录中起作用的启动子内的序列组件通常以共有核苷酸序列表征。启动子的实例包括(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及动物(例如哺乳动物(包括马、猪、牛及人类))、鸟或昆虫的启动子。启动子可以是诱导型的、抑制型的和/或组成型的。诱导型启动子因应于培养条件的一些变化(例如温度变化)，在其控制下起始增加的自DNA的转录程度(Ptashne,2014)。熟习此项技术者熟知的启动子的实例是(例如)SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子。
如本文在本发明上下文中所使用的术语启动子尤其是指功能片段，例如，截短4pgG600(SEQ ID No.1)或其互补核苷酸序列，优选地序列相同性在整个长度上是(至少是)72％(或更高)。此外，如本文在本发明的上下文中所使用的术语启动子尤其是指功能片段，例如，截短4pMCP600(SEQ ID No.2)或其互补核苷酸序列，优选地序列相同性在整个长度上是(至少是)78％(或更高)。最优选地，“启动子”是指p430(SEQ ID NO.:3)或p455(SEQ IDNO.:4)。如本文中在本发明上下文中进一步使用的术语启动子尤其是指p430(SEQ ID NO.:3)或p455(SEQ ID NO.:4)或4pgG600(SEQ ID No.1)或4pMCP600(SEQ ID No.2)的功能衍生物，其具有(例如)小的取代、突变或倒位，使得序列相同性为70％、80％、85％、90％、95％、99％相同或同源。
术语“p430”、“gG 430”及“430”在整个说明书、图、序列表等中同义且可互换使用。术语“p455”、“MCP455”及“455”在整个说明书、图、序列表等中同义且可互换使用。
术语“增强子”表示在顺式位置中作用于启动子的活性且因此刺激与该启动子功能连接的基因或编码序列的转录的多核苷酸序列。不同于启动子，增强子的效应与位置及取向无关，且因此其可以位于转录单元的前面或后面，在内含子内，或甚至在编码区内。增强子可位于转录单位的邻近区域并且距离启动子相当远。亦可与启动子具有物理及功能重迭。熟习此项技术者将明了来自各种来源的多种增强子(并且保藏于诸如Genbank等数据库中，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤增强子、腺病毒增强子)，其用作独立组件或克隆于多核苷酸序列内的组件(例如，保藏于ATCC或来自商业及个人来源)。多种启动子序列亦含有增强子序列，例如经常使用的CMV启动子。人类CMV增强子是迄今鉴别的最强的增强子之一。可诱导型增强子的一个实例是金属硫蛋白增强子，其可由糖皮质激素或重金属刺激。
术语“互补核苷酸序列”阐述多核苷酸的两条配对链的一条链，例如DNA或RNA。互补链的核苷酸序列反映其配对链的核苷酸序列，使得对于每一腺苷，其含有胸腺激素(或对于RNA为尿嘧啶)，对于每一鸟嘌呤为胞嘧啶，且反的亦然。例如，5’-GCATAC-3’的互补核苷酸序列是3’-CGTATG-5’或对于RNA为3’-CGUAUG-5’。
如本文所用术语“基因”、“所关注的基因”具有相同含义且是指编码所关注的产物的任何长度的多核苷酸序列。基因可进一步包含编码序列之前的调控序列(5'非编码或非翻译序列)及随后的调控序列(3'非编码或非翻译序列)。选择的序列可是全长或截短的、融合或标记的基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段。通常理解，编码多肽或RNA的基因组DNA可包括自成熟信使RNA(mRNA)剪接的非编码区(即内含子)且因此不存在于编码相同多肽或RNA的cDNA中。其可以是天然序列，即天然形式，或可经突变，或包含源自不同来源的序列或视需要进行其他修饰。这些修饰包括密码子优化，以优化所选宿主细胞中的密码子使用或标记。此外，其可包括去除或添加顺式作用位点，例如(隐藏)剪接供体、受体位点及分支点、多聚腺苷酸化信号、TATA-盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、转录因子或其他调节因子的结合位点、限制性内切酶位点等，仅给出几个但并非限制性实例。选择的序列可编码分泌的、细胞质、核、膜结合的或细胞表面多肽。
如本文所用的术语“所关注的核苷酸序列”是比所关注的基因更通用的术语，此乃因其不一定包含基因，但可包含基因的组件或部分或其他遗传信息(例ori(复制起点))。所关注的核苷酸序列可为任何DNA或RNA序列，与其是否包含编码序列无关。
“开放阅读框”或“ORF”是指包含翻译起始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)及终止密码子的一段长度的核酸序列(DNA或RNA)，且可潜在翻译成多肽序列。
术语“转录”阐述细胞中mRNA的该生物合成。
如本文所用的术语“表达”是指宿主细胞内核酸序列的转录和/或翻译。根据本发明的具体方面，术语“表达”是指宿主细胞内异源和/或外源核酸序列的转录和/或翻译。在宿主细胞中期望产物的表达程度可基于存在于细胞中的相应RNA或mRNA的量或由所选序列编码的期望多肽的量来测定。举例而言，自所选序列转录的mRNA可通过Northern印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA原位杂交或通过RTqPCR(反转录，之后量化PCR)来量化。自所选序列表达的蛋白质可通过各种方法量化，例如通过ELISA、蛋白印迹法、通过放射免疫分析、通过免疫沈淀、通过分析蛋白质的生物活性或通过蛋白质的免疫染色、之后FACS分析。
术语“表达盒”或“转录单元”或“表达单元”定义含有一或多个欲转录基因的载体、构建体或多核苷酸序列内的区，其中编码转录基因的核苷酸序列以及含有包含于表达盒内的调节组件的多核苷酸序列彼此可操作地连接。其是自激活子转录，且转录是由至少一个聚腺苷酸化信号终止。在一个具体方面中，其是一个单一启动子转录。因此，不同基因至少经转录连接。可自每一转录单元(多顺反子转录单元)转录及表达一种以上蛋白质或产物。每一转录单元将包含转录及翻译包含于单位内的任何所选序列所需的调节组件。且每一转录单元可含有相同或不同调节组件。举例而言，每一转录单元可含有相同终止子，IRES组件或内含子可用于转录单元内基因的功能性连接。载体或多核苷酸序列可含有一个以上转录单元。
术语“增加的表达”、“增加的效价或生产力”或“改良的表达或生产力”意指通过与适宜对照相比(例如由cDNA编码的蛋白质相对于由含内含子的基因编码的蛋白质)，例如编码治疗性蛋白质的基因的引入宿主细胞中的异源和/或外源序列的表达、合成或分泌增加。若本发明的细胞是根据本文阐述的本发明方法培养，且若此细胞具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍的比生产力或效价增加，则效价或生产力增加。若本发明的细胞是根据本文阐述的本发明方法培养，且若此细胞具有至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍的比生产力或效价增加，则效价或生产力亦增加。若本发明的细胞是根据本文阐述的本发明方法培养，且若此细胞具有至少1.2倍至5倍，优选1.5倍至5倍，更优选2倍至5倍的比生产力或效价增加，则特定而言效价或生产力亦增加。“增加的表达”亦可能意味着更多细胞实际上表达所关注的基因/序列。举例而言，增加的表达可能意味着本发明的新颖启动子相对于其他启动子在病毒复制周期期间更长时间段有活性。
增加的表达、效价或生产力可通过使用本发明的异源载体获得。此可与诸如FACS辅助选择重组宿主细胞等其他方法组合，该重组宿主细胞含有作为额外可选标记物的一或多种荧光蛋白(例如GFP)或细胞表面标志物。亦可使用获得增加的表达的其他方法及不同方法的组合，其是(例如)基于使用顺式活性组件来操纵染色质结构(例如LCR、UCOE、EASE、隔离件、S/MAR、STAR组件)、使用(人工)转录因子、用天然或合成试剂处理细胞以上调内源或异源和/或外源基因表达、改良mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)、改良mRNA翻译的起始、通过使用游离型质粒(基于使用病毒序列作为复制起点，例如SV40、多瘤、腺病毒、EBV或BPV)增加基因剂量、使用扩增促进序列或基于DNA多联体的活体外扩增系统。
用以量测“增加的表达”的分析是基于LC-MS/MS的蛋白质量测，例如多反应监测(MRM)；基于抗体的检测方法，例如蛋白印迹法、斑点印迹法或免疫扩散及流式细胞术；及通过血球凝集分析量测生物活性。
通过对各别启动子控制下转录的mRNA进行量化间接量测“启动子活性”。通过RTqPCR相对于内源标准量化mRNA。
术语“病毒效价”是每体积的病毒制剂的感染单位的量度。病毒效价是生物程序中的终点并定义为平行实施的一定比例的测试显示效应的稀释度(Reed及Muench，1938)。具体而言，每毫升组织培养物感染剂量50(TCID50/ml)给出病毒制剂的稀释度，其中感染与该稀释度平行接种的50％数量的细胞培养物。
“转录调节组件”通常包含欲表达的基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点及多聚腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”是指构建体中对应于纳入一级转录物(即mRNA前体)中的第一核酸的核酸。转录起始位点可能与启动子序列重迭。
“终止信号”或“终止子”或“多聚腺苷酸化信号”或“多A”或“转录终止位点”或“转录终止组件”是引起在真核mRNA的3'端的特异性位点裂解及在裂解的3'端转录后纳入约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列(多A尾)，且因此引起RNA聚合酶终止转录。多聚腺苷酸化信号包含在裂解位点上游约10-30个核苷酸的序列AATAAA及位于下游的序列。已知各种多聚腺苷酸化组件，例如tk多A、SV40晚期及早期多A、BGH多A(阐述于例如美国专利第5,122,458号中)或仓鼠生长激素多A(WO2010010107)。
“翻译调节组件”包含欲表达的每一个别多肽的翻译起始位点(AUG)、终止密码子及多A信号。一些构建体中可包括内部核糖体进入位点(IRES)。为了优化表达，可能建议去除、添加或改变欲表达的核酸序列的5'和/或3'非翻译区，以消除任何潜在的额外不适当的替代性翻译起始密码子或可能在转录或翻译程度上干扰或降低表达的其他序列。可紧接起始密码子的上游插入共有核糖体结合位点(Kozak序列)，以增强翻译并由此表达。此核糖体结合位点附近增加的A/U含量促进更有效的核糖体结合。
根据定义，插入宿主细胞中的每个多核苷酸序列或每个基因以及由此编码的个别蛋白质或RNA当其来自不同(病毒)物种时，被称为相对于宿主细胞的“外源”、“外源序列”、“外源基因”、“外源编码序列”。因此，鉴于EHV-1病毒载体，本发明的基于EHV-4的启动子是外源的。如本文关于所关注的序列或基因(例如抗原)所使用的术语“外源”意指该所关注的序列或基因、具体而言该抗原在其天然物质的背景外表达。因此，来自猪IAV的H3抗原相对于EHV-1载体是外源抗原的一个实例(参见实例3)。因此，所关注的任何非马科动物序列或基因，例如非马科动物抗原是所关注的外源序列或基因或根据本发明的具体方面的抗原。
根据定义，插入宿主细胞中的每个多核苷酸序列或每个基因以及由此编码的各别蛋白质或RNA被称为相对于宿主细胞的“异源”、“异源序列”、“异源基因”、“异源编码序列”、“转基因”或“异源蛋白质”。即使欲引入的序列或欲引入的基因与宿主细胞的内源序列或内源基因相同，此亦适用。举例而言，根据定义，相对于EHV-4野生型病毒中于不同位点或以经修饰形式引入EHV-4病毒载体中的EHV-4启动子序列是异源序列。如本文关于所关注的序列或基因(例如抗原)所使用的术语“异源”意指该所关注的序列或基因、具体而言该抗原在其天然亚物质的背景外表达。因此，因此，所关注的任何非EHV-1特异性序列或基因，例如抗原，例如除EHV-1外的任何马α疱疹病毒的抗原(例如EHV-3、EHV-8)是所关注的异源序列或基因或根据本发明的具体方面的抗原。
术语“非天然”意指在此背景下天然存在的所关注的任何序列或基因(例如抗原)，例如杂交序列或来自不同物种的所关注的序列或基因(例如抗原)、或由于人造突变、插入、缺失或诸如此类而并非自然产物的所关注的序列或基因(例如抗原)。
在本发明的整个说明书中，术语“重组”可与术语“非天然”、“异源”及“外源”互换使用。因此，“重组”蛋白是自异源或外源多核苷酸序列表达的蛋白质。关于病毒使用的术语重组意指通过人工操纵病毒基因组产生的病毒。包含异源或外源序列(例如外源抗原编码序列)的病毒是重组病毒。术语重组病毒与术语非天然病毒可互换使用。
因此，术语“异源载体”意指包含异源或外源多核苷酸序列的载体。术语“重组载体”意指包含异源或重组多核苷酸序列的载体。
如本文所用术语“可操作连接”用于阐述调节组件与基因或其编码区之间的连接。通常，将基因表达置于一或多种调控组件(例如但不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调节组件及增强子)的控制下。基因或编码区与调节组件称为“可操作连接”(“operablylinked to”或“operatively linked to”)或“可操作相联”时，表示该基因或编码区受调节组件控制或影响。举例而言，若启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子是可操作连接至编码序列。
此外，在本说明书的范畴内，术语“功能连接”(“functional linking”或“functionally linked”)或“可操作连接”意指两个或更多个核酸序列或序列组件的定位方式将允许其等以其预期方式发挥功能。举例而言，若启动子/增强子或终止子能够依顺式位置控制或调节所连接基因序列的转录时，则该启动子/增强子或终止子是功能连接该编码基因序列。通常(但并非必需)，功能连接的DNA序列是邻接，且若需要接合两个多肽编码区或在分泌信号肽的情形下是邻接并在阅读框中。然而，尽管可操作连接的启动子通常位于上游，或者可操作连接的终止子通常位于编码序列下游，但不一定与的邻接。增强子不一定邻接，只要其可增加编码序列的转录即可。为此，其等可位于编码序列的上游或下游，且甚至位于一定距离处。若多聚腺苷酸化位点位于编码序列的3'端，则该多聚腺苷酸化位点是可操作连接至编码序列，因此得以透过编码序列转录成聚腺苷酸化信号。可通过业内已知的重组方法来完成连接，例如通过在适当限制性位点或钝端连接或通过使用融合PCR方法。若没有适宜限制位点时，则可按照习用操作法，使用合成的寡核苷酸接头或衔接子。
因此，术语启动子序列的“功能片段”或“功能衍生物”意指片段或衍生物仍然影响启动子活性。如何评估启动子活性的功能分析法为是熟习此项技术者所熟知(Bustin2000，Nolan等人2006)。该功能分析法的例示性实施例包括(例如)启动子动力学实验。将经过携带表达盒的载体病毒感染的细胞培育不同时间，其中启动子或其片段引导报导子转基因的转录。从感染后不同时间点所收集的试样制备总RNA。通过DNAse I消化而破坏污染的DNA后，RNA进行逆转录。一个重复试样在添加反转录酶(RT)下进行处理，第二重复在不添加RT下进行处理，以展现自RNA制备成功去除污染DNA。纯化所得cDNA并在习用PCR中用作模板。仅在添加RT下处理的试样产生PCR产物。随后可将这些cDNA用于使用报导子转基因的引物及平行使用病毒载体的必需基因(内标准基因)的qPCR中，其转录为感染及复制效率提供内标准。使用内标准基因的qPCR值在不同构建体及感染后时间之间正规化报导子的qPCR值。此可解释不同启动子及其片段的启动子活性。
如本文所用的“序列同源性”是指测定两个序列的相关性的方法。为了测定序列同源性，将两个或更多个序列优化比对，且若需要，引入间隙。然而，与“序列相同性”相反，当测定序列同源性时，将保守氨基酸取代计数为匹配。
换言之，为了获得与参照序列具有95％序列同源性的可比较的多肽或多核苷酸，参照序列中的85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的氨基酸残基或核苷酸必须与另一氨基酸或核苷酸匹配或包含经另一氨基酸或核苷酸的保守取代。或者，可向参照序列中插入占参照序列中总氨基酸残基或核苷酸(不包括保守取代)多达15％，优选多达10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选多达5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的数目的氨基酸或核苷酸。优选地，同系物序列至少包含50个、甚至更优选100个、甚至更优选250个、甚至更优选500个核苷酸的段。
术语“序列相同性”已为业内所习知且是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个聚核苷酸多核苷酸序列、亦即参照序列与欲与参照序列进行比较的给定序列之间的关系。通过在将序列最佳地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参照序列来测定序列相同性，如通过这些序列串之间的匹配所测定。在该比对后，基于逐个位置来确定序列相同性，例如，若核苷酸或氨基酸残基在一个位置相同，则这些序列在该位置“相同”。然后将这些位置相同性的总数除以参照序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可通过已知方法容易地计算，这些方法包括但不限于以下中所述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford University Press,NewYork(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教示以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将用以测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。这些程序的实例包括(但不限于)GCG程序包(Devereux,J.,等人，Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示以引用方式并入本文中)。这些程序使用默认空位权重最佳地比对序列以在给定序列与参照序列之间产生最高序列相同性程度。作为阐释，对于聚核苷酸多核苷酸具有与参照核苷酸序列具有至少(例如)85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％“序列相同性”的核苷酸序列而言，预计给定聚核苷酸多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只是给定聚核苷酸多核苷酸序列可包括多达15个，优选多达10个、甚至更优选多个5个点突变/参照核苷酸序列的100个核苷酸。换言之，在具有相对于参照核苷酸序列具有至少85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的核苷酸序列的聚核苷酸多核苷酸中，参照序列中高达15％，优选10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或可向参照序列插入占参照序列中总核苷酸的高达15％，优选10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的数目的核苷酸。参照序列的这些突变可发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参照序列中的各核苷酸之间或在参照序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于多肽具有与参照氨基酸序列具有至少(例如)85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定氨基酸序列而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参照序列相同，只是给定多肽序列可包括高达15个，优选高达10、9、8、7、6个、甚至更优选高达5、4、3、2、1个氨基酸改变/参照氨基酸序列的100个氨基酸。换言之，为了获得与参照氨基酸序列具有至少85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定多肽序列，参照序列中高达15％，优选高达10％、9％、8％、7％、甚至更优选高达5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可向参照序列中插入占参照序列中氨基酸残基的总数的高达15％，优选高达10％、9％、8％、7％、甚至更优选高达5％、4％、3％、2％、1％的数目的氨基酸。参照序列的这些改变可发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参照序列中的各残基之间或在参照序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列相同性时，并不包括保守取代作为匹配。
术语“序列相同性”或“相同性％”在本文中可互换使用。出于本发明目的，此处定义为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性％，将序列进行比对以达到最佳比较目的(例如，可在第一氨基酸或核酸的序列中引入间隙，用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置相同。两个序列之间的相同性％随这些序列所共享的相同位置数变化(即，相同性％＝相同位置数/总位置(即重迭位置)数×100)。优选地，两个序列的长度相同。
序列比较可在比较的两个序列的整个长度上实施，或在两个序列的片段上实施。通常，比较将在所比较的两个序列的整个长度上实施。然而，序列相同性可在(例如)20、50、100或更多个邻接氨基酸残基的区上实施。
熟习此项技术者将明了以下事实：若干不同计算机程序可用于测定两个序列之间的同源性。两条序列之间的序列比较及同源性％的测定可使用数学算法来完成。举例而言，可使用数学算法来实现两个序列之间的序列比较及相同性％的测定。在优选实施例中，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法测定两个氨基酸或核酸序列之间的相同性％，该算法纳入Accelrys GCG软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)中的GAP程序中，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵、及16、14、12、10、8、6或4的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重。熟习此项技术者应了解，所有这些不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时，两个序列的总体相同性％并不显著改变。
可使用本发明的蛋白质序列或核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索，以例如鉴别其他家族成员或相关序列。这些搜索可使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN及BLASTP程序(2.0版)来实施。BLAST蛋白搜索可利用BLASTP程序、评分＝50、字长＝3来实施，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位化比对，可如以下中所述利用空位化BLAST：Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402。在利用BLAST及空位化BLAST程序时，可使用各别程序(例如，BLASTP及BLASTN)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
EHV-1及EHV-4/重组载体技术定义
术语“马科动物”或“马”(“equine”或“equin”)意指或属马科动物科，其包括马、驴及斑马，优选地马。另外，术语“马科动物”或“马”(“equine”或“equin”)亦涵盖马科动物科的成员的杂种(例如骡子(mules)、駃騠(hinnies)等)。
“疱疹病毒”或“疱疹病毒载体”是指疱疹病毒目疱疹病毒科中的物种。
术语“马疱疹病毒载体”或“马疱疹病毒”或“EHV”意指影响马的疱疹病毒科的成员。迄今为止，已经鉴别了八种不同物种的马疱疹病毒，其中五种属亚科α疱疹病毒亚科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)且三种属丙型疱疹病毒亚科。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015年发布EC 47,London,UK，2015年7月；电子邮件批准2016(MSL编号30)
术语“EHV-1”意指马α疱疹病毒1，即疱疹病毒科α疱疹病毒亚科属亚属水痘病毒属的成员。EHV-1的非限制性参照序列将为(例如)野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)或RacH(Hübert 1996)。
术语EHV-4意指马α疱疹病毒4，即疱疹病毒科α疱疹病毒亚科属亚属水痘病毒属的成员。
术语“插入ORF70中”意指在编码马α疱疹病毒1开放阅读框70的位置将DNA片段插入基因组DNA中。在本发明的具体方面中，所提及的插入导致缺失ORF70的801个5'碱基对，使得3'端的423个bp完整，但消除了orf70基因产物糖蛋白G的表达。显示包括EHV-1在内的若干α疱疹病毒的糖蛋白G可自经感染细胞分泌并通过结合促发炎细胞介素用作免疫调节蛋白。与具有完整糖蛋白G表达的野生型EHV-1相比，消除其在病毒载体中的表达应增加病毒感染的免疫原性。
术语“插入ORF1/3中”意指在疫苗毒株EHV-1 RacH的减毒程序期间通过传代意外缺失，包含90％ORF1及整个ORF2的1283bp片段丢失的位置将DNA片段插入病毒基因组中。选择此插入位点，此乃因自此位置的转基因的表达可能干扰病毒复制的可能性预计将非常低。
疫苗定义
“免疫原性或免疫组合物”是指包含至少一种抗原或其免疫原性部分的物质的组合物，其引发宿主中细胞或抗体介导的对组合物的免疫反应的免疫反应。
本文使用的术语“抗原”在业内是众所周知的，且包括具有免疫原性的物质(即免疫原)，以及诱导免疫不反应性或无反应性(即身体的防御机制对外来物质无反应)的物质。如本文所用术语“抗原”欲指含有或包含表位的全长蛋白质以及其肽片段。
术语“产食性动物”意指用于人类消费的动物，例如猪、牛、家禽、鱼及诸如此类，优选地产食性动物意指猪及牛，最优选地猪。
如本文所用的“免疫原性组合物”可以指多肽或蛋白质，例如引发如本文所述的免疫反应的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指蛋白质或多肽的片段或截短和/或取代形式，其包括一或多个表位且由此引发本文所述的免疫反应。一般而言，这些截短和/或取代的形式或片段将包含来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。这些片段可使用任一数目的业内熟知的表位定位技术来鉴别。参见(例如)Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编辑，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。举例而言，线性表位可通过在固体载体上同时合成大量肽(这些肽对应于蛋白质分子的部分)、及使肽与抗体反应同时肽仍附接至载体来测定。这些技术是业内已知及经阐述的，参见例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，例如通过例如x射线结晶学及二维核磁共振，通过测定氨基酸的空间构形来容易地鉴别构象表位。参见Epitope Mapping Protocols，上文文献。该定义内亦包括合成抗原，例如多表位、侧翼表位及其他重组或合成衍生的抗原。参见(例如)Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；及Gardner等人，(1998)12thWorld AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日至7月3日。(其教示及内容全部以引用方式并入本文中。)
如本文所用术语“疫苗”是指包含至少一种在动物中诱导免疫反应的免疫活性组分且可能但不一定包含一或多种增强活性组分的免疫活性的额外组分的医药组合物。疫苗可另外包含医药组合物典型的其他组分。通过区别，疫苗的免疫活性组分可包含呈其初始形式的完整病毒颗粒或所谓经修饰活疫苗(MLV)中的减毒颗粒或通过适当方法在所谓杀死的疫苗(KV)中灭活的颗粒。在另一形式中，疫苗的免疫活性组分可包含生物体的适当组件(亚单位疫苗)，其中这些组件是通过以下方式生成：通过破坏整个颗粒或含有这些颗粒的生长培养物及任选地随后的纯化步骤从而产生期望结构，或通过合成方法，包括利用基于例如细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的适宜是统的适当操纵加上任选随后的分离及纯化程序，或通过使用适宜医药组合物直接纳入遗传物质来诱导需要疫苗的动物中的合成过程(多核苷酸疫苗接种)。疫苗可包含上述组件中的一种或同时一种以上。如在本发明的具体方面中所用，“疫苗”是指活疫苗或活病毒，亦称为重组疫苗。在本发明的另一具体方面中，“疫苗”是指包括病毒样颗粒(VLP)在内的灭活或杀死的病毒。因此，疫苗可为亚单位疫苗或杀死(KV)或灭活的疫苗。
术语“感染复数(M.O.I.)”阐述多少感染单位，例如，每个细胞使用病毒制剂的TCID50以感染培养的细胞。举例而言，0.01的M.O.I.意指对于培养容器中的每100个细胞，接种一个感染单位。
术语“DNA疫苗接种”或“多核苷酸疫苗接种”意指使用适宜医药组合物直接接种遗传物质。
灭活的各种物理及化学方法为业内已知。术语“灭活”是指先前有毒力或无毒力的病毒或细菌经辐照(紫外线(UV)、X射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理以灭活或杀死该病毒或细菌，同时保留其免疫原性。适宜灭活剂包括β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-次乙亚胺、戊二醛、臭氧及福尔马林(formalin)(甲醛)。
对于由福尔马林或甲醛灭活，通常将甲醛与水及甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇可防止灭活过程中的降解或交叉反应。一个实施例使用约0.1％至1％的37％甲醛溶液来灭活病毒或细菌。至关重要的是，调节福尔马林的量以确保材料灭活，但不会多至发生高剂量的副作用。
更特定而言，术语“灭活”在病毒的上下文中意指该病毒不能在活体内或活体外复制，且分别，术语“灭活”在细菌的上下文中意指细菌不能在活体内或活体外复制。举例而言，术语“灭活”可以指已经在活体外繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活以使其不再能够复制的病毒。在另一实例中，术语“灭活”可以指已经繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活的细菌，从而产生细菌、细菌的片段或组分的悬浮液，例如产生可用作疫苗的组份的菌苗。
如本文所用术语“灭活”、“杀死”或“KV”可互换使用。
术语“活疫苗”是指包含活生物体或可复制的病毒或病毒载体的疫苗。
“医药组合物”基本上由一或多种能够改变其所施用的生物体或生物体中或上面存活的生物体的生理(例如免疫)功能的成分组成。该术语包括(但不限于)抗生素或抗寄生虫剂、以及通常用于实现某些其他目的(例如但不限于加工性状、无菌性、稳定性、经肠或非经肠途径(例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、皮内或其他适宜途径)施用组合物的可行性、施用后耐受性或控制释放性质)的其他成分。该医药组合物的一个非限制性实例仅仅是用于展现目的给出，可如下制备：将感染的细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(BSA))混合且随后将混合物通过其他方法进行冻干或去水。在疫苗接种之前，随后将混合物在水溶液(例如，盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS))或非水溶液(例如，油乳液、基于铝的佐剂)中再水化。
如本文所用的“医药上或兽医上可接受的载剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、涂布剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及诸如此类。在一些优选实施例且尤其包括冻干的免疫原性组合物的那些中，用于本发明的稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂素，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。特定而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特定而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，特定而言异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子表面活性剂，特定而言以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如，无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其任选地经乙氧基化)，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application ofAdjuvants(Stewart-Tull编辑,D.E.S.),JohnWiley and Sons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。实例性佐剂是由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press,1995的第147页上阐述的SPT乳液、及同一本书第183页上阐述的乳液MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物以术语卡波姆(carbomer)为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述了与具有至少3个，优选不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的这些丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团替代。优选基团是含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯是不饱和基团。不饱和基团本身可含有其他取代基，例如甲基。以名称(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品特别适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。其中，可以提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选使用971P。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，尤其是共聚物EMA(Monsanto)，其是马来酸酐与乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生酸溶液，其将被中和，优选至生理pH，以产生将引入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
其他适宜佐剂包括(但不限于)尤其RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽、或其天然或重组细胞介素或其类似物或内源细胞介素释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量，优选以每剂量约100μg至约10mg的量，更优选以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量、且最优选以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，仍更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
“稀释剂”可包括水、生理盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“分离”意指自其天然状态“由人手”改变，即若其在自然界中存在，则其已经改变或自其初始环境中移出，或两者兼而有的。举例而言，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”，但自其天然状态的共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文中使用的术语。
“减毒”意指降低病原体的毒力。在本发明中，“减毒”与“无毒力”同义。在本发明中，减毒病毒是毒力已降低，从而不会引起感染的临床体征，但能够在目标哺乳动物中诱导免疫反应者，但亦可意指与感染非减毒病毒或病原体且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比，已降低该感染减毒病毒，尤指所主张的EHV-1 RacH病毒载体的动物中临床体征的发生率或严重程度。在此上下文中，术语“降低(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比，降低至少10％，优选25％、甚至更优选50％、仍更优选60％、甚至更优选70％、仍更优选80％、甚至更优选90％且最优选100％。因此，减毒的无毒力病原体(例如所主张的减毒的病毒载体，尤指所主张的EHV-1(优选指RacH)病毒载体)适于产生经修饰的活疫苗(MLV)或经修饰的活的免疫原性组合物。
在本文中，“有效剂量”意指(但不限于)在接受施用抗原的动物中引起或能够引发免疫反应，以减少临床症状时的量。
如本文所用术语“有效量”在组合物的上下文中意指能够在动物中诱发免疫反应，以减少感染的发生率或降低感染严重性或疾病的发生率时的免疫原性组合物的量。特定而言，有效量是指每剂量的菌落形成单位(CFU)。或者，在疗法的上下文中，术语“有效量”是指足以减轻或改善疾病或病症或其一或多种症状的严重程度或持续时间、防止疾病或病症演进、引起疾病或病症消退、防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作或演进、或增强或改良另一疗法的预防或治疗的疗法时的量。
“免疫反应”(“immune response”或“immunological response”)意指(但不限于)对所关注的(免疫原性)组合物或疫苗发生细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，免疫(immune或immunological)反应包括(但不限于)以下效应中的一或多者：产生或活化特异性针对所关注组合物中所包括的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主将展示治疗性或保护性免疫(记忆)反应，使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低。该保护将通过症状数量的减少、症状严重程度的降低、或无与病原体感染相关的一或多种症状、病毒血症发作的延迟、病毒持久性降低、整体病毒负荷的降低和/或病毒排泄的降低来展现。
“保护抵抗疾病”、“保护免疫性”、“功能免疫性”、“临床症状的减少”、“中和抗体的诱导/产生和/或血清转化”及类似片语意指通过施用本发明的一或多种治疗性组合物或其组合而产生的针对疾病或病况的部分或完全反应，其导致比已暴露于疾病或感染的未经免疫个体所预计较不有害的效应。亦即，在经疫苗接种的个体中，感染的有害效应的严重程度减轻。在经疫苗接种的个体中，感染可经减轻、减缓或可能完全预防。在本文中，若意指完全预防感染，则对其进行具体说明。若未说明完全预防，则该术语包括部分预防。
在本文中，“临床体征的发生率和/或严重程度的降低”或“临床症状的减少”意指(但不限于)与野生型感染相比，减少组中感染个体的数量、减少或消除展现感染的临床体征的个体的数量、或降低一或多个个体中存在的任何临床体征的严重程度。举例而言，其应该指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或疟疾的症状的任何临床体征减少。优选地，与未接受组合物且被感染的个体相比，接受本发明的治疗性组合物的一或多个个体的这些临床体征减少至少10％。更优选地，接受本发明组合物的个体的临床体征减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％且甚至更优选至少50％。
术语“增加的保护”在本文中意指(但不限于)相对于未经疫苗接种的个体对照组，经疫苗接种的个体组的一或多种与由传染原感染相关的临床症状在统计学上显著减轻。术语“临床症状的统计学显著减轻”意指(但不限于)经疫苗接种的个体组的至少一种临床症状的发病频率比在攻击传染原后未经疫苗接种的对照组中低至少10％，优选20％，更优选30％、甚至更优选50％且甚至更优选70％。
“持久保护”将指持续至少3周、但更优选至少3个月、仍更优选至少6个月的“改良的效能”。在牲畜的情形下，最优选地，持久保护应持续直至动物出售用于肉类的平均年龄。
术语由病毒诱导的“病毒血症的减轻”意指(但不限于)进入动物血流的病毒减少，其中与未接受本发明组合物且可被感染的动物相比，接受该组合物的动物的血清中的病毒血症程度、即每毫升血清的病毒DNA或RNA拷贝数或每分升血清的噬菌斑形成菌落数减少至少50％。更优选地，接受本发明组合物的动物的病毒血症程度降低至少90％，优选至少99.9％，更优选至少99.99％、且甚至更优选至少99.999％。
如本文所用术语“病毒血症”特定而言应理解为病毒颗粒在动物、特定而言哺乳动物、鸟或昆虫的血流中复制和/或循环的病况。
“安全性”是指在疫苗接种后，在经疫苗接种的动物中不存在不良后果，包括但不限于：基于病毒的疫苗潜在地逆转成有毒力、临床上显著的副作用，例如持久性、全身性疾病或在疫苗施用位点不可接受的发炎。
如本文所用术语“疫苗接种”(“vaccination”或“vaccinating”)或其变化形式意指(但不限于)包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，在施用至动物时，其引发或能够引发(直接或间接)该动物的免疫反应。
在本发明上下文中，“死亡率”是指由感染引起的死亡，且包括感染如此严重以致于将动物安乐死以防止痛苦并为其生命提供人道结局的情况。
调配物
施用组合物的个体优选是动物，包括(但不限于)牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠及大鼠，最优选哺乳动物是猪。
本发明的调配物包含有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。疫苗包含有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。调配物应适合于施用方式。
免疫原性组合物(若需要)亦可含有极少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或粉末。经口调配物可包括标准载剂，例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
治疗方法
优选施用途径包括(但不限于)鼻内、经口、皮内及肌内。期望在饮用水中、最优选以单一剂量施用。熟习此项技术者将认识到，本发明组合物亦可以一个、两个或更多个剂量通过其他施用途径来施用。举例而言，这些其他途径包括皮下、腹膜内、皮内，且根据治疗的期望持续时间及有效性，本发明组合物可以例如每日计一次或若干次、亦间歇地以不同剂量(例如约103至108TCID50(参见上述病毒效价))施用若干天、若干周或若干月。在本发明的具体方面中，剂量是约103至108TCID50，尤其对于活病毒/活疫苗。
若期望，组合物可提供于可包含含有活性成分的一或多种单位剂型的包装或分配器装置中。包装可(例如)包含金属或塑料箔，例如泡罩包。包装或分配器装置可伴随有施用说明书，优选施用至哺乳动物(尤其猪)的说明书。该(等)容器可附带有监管医药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告显示政府机构已批准用于人类施用的制造、使用或销售。
序列概述：
以下序列详细阐述并揭示于本发明中：
启动子：
SEQ ID NO:1 EHV-4 600bp脱氧核糖核酸序列4pgG600
SEQ ID NO:2 EHV-4 600bp脱氧核糖核酸序列4pMCP600
SEQ ID NO:3 EHV-4 430bp脱氧核糖核酸序列pG430
SEQ ID NO:4 EHV-4 449bp脱氧核糖核酸序列p455
SEQ ID NO:5 对orf72具有特异性的引物编号1130
SEQ ID NO:6 对orf72具有特异性的引物编号1131
SEQ ID NO:7 对mCherry具有特异性的引物编号1079
SEQ ID NO:8 对mCherry具有特异性的引物编号1080
插入位点：
SEQ ID NO:9 orf70插入区的人工序列核酸PCR引物1017
SEQ ID NO:10 orf70插入区的人工序列核酸PCR引物1018
SEQ ID NO:11 orf1/3插入区的人工序列核酸PCR引物1007
SEQ ID NO:12 orf1/3插入区的人工序列核酸PCR引物1008
SEQ ID NO:13左(Up70)侧翼区(417bp)
SEQ ID NO:14右(Up71)侧翼区(431bp)
SEQ ID NO:15野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中位于核苷酸127264-127680的左侧翼区(上orf70)
SEQ ID NO:16野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中位于核苷酸128484-128913的右侧翼区(上orf71)
SEQ ID NO:17 RED系统中的截短的侧翼区：左(Up70)侧翼区(283bp)＝与417bp“经典”侧翼区的3’283bp相同
SEQ ID NO:18 RED系统中的截短的侧翼区：右(Up71)侧翼区(144bp)＝与431bp“经典”侧翼区的5’144bp相同
SEQ ID NO:19野生型ab4(Genbank登录号AY665713.1)基因组序列中的缺失部分，nt 127681-128482
SEQ ID NO:20 RacH基因组序列中的缺失部分(不可获得nt编号，此乃因完全基因组序列未知)
质粒/载体序列：
SEQ ID NO:21转移质粒pU-mC70-BGH的核苷酸序列
SEQ ID NO.:22转移载体pU70-p455-71K71的核苷酸序列
SEQ ID NO.:23转移质粒pU70-p455-H3-71K71的核苷酸序列
SEQ ID NO.:24转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH的核苷酸序列
SEQ ID NO.:25转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH的核苷酸序列
血凝素序列
SEQ ID NO:26血凝素[流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/116114/2010(H1N2))]
Genbank：ADR01746.1H1pdm
SEQ ID NO:27血凝素[流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))]
Genbank：ABS50302.2H3:
SEQ ID NO:28血凝素[流行性感冒A病毒(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))]
Genbank：AFR76623.1H1av：
SEQ ID NO:29血凝素[流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/4675/2003(H1N2))]
Genbank：ADK98476.1*H1hu
*请注意，氨基酸531(X终止密码子由本发明者变为I)：
SBV构建体序列
SEQ ID NO:30 GS接头序列
SEQ ID NO:31包括用于亚克隆的限制位点的合成DNA序列
SEQ ID NO:32用于RED重组以生成pRacH-SE-70-455-SBVGc的DNA片段
SEQ ID NO:33 up70 F引物
SEQ ID NO:34 up71 R引物
SEQ ID NO:35 seq455-F1引物
SEQ ID NO:36 SBV Gc F1引物
SEQ ID NO:37 SBV Gc R1引物
附图简述
下图形成本说明书的一部分并包括用以进一步展现本发明的某些方面。通过参照这些图中的一或多者结合本文提供的具体实施例的详细说明可更好地理解本发明。
图1.比较野生型(wt)EHV-1毒株ab4及减毒疫苗毒株EHV-1 RacH的orf1/3区的示意图。
图2.orf70插入位点的示意图
UL＝长的独特区段
US＝短的独特区段IR＝内部反向重复序列
TR＝末端反向重复序列
gG＝糖蛋白G
gpII＝糖蛋白II
orf＝开放阅读框
bp＝碱基对
图3.转移质粒pU-mC70-BGH的质粒图谱及核苷酸序列
图4.转移载体pU70-p455-71K71的质粒图谱及核苷酸序列
图5.用于将表达盒p455-H3-71插入EHV-1 RacH的orf70中的转移质粒的质粒图谱及核苷酸序列。
H3＝编码流行性感冒A病毒血凝素H3的开放阅读框
71pA＝如发明EM P2016-022中所述的新多A序列
I-SceI＝限制内核酸酶I-SceI的裂解位点
启动子aph＝原核卡那霉素(Kanamycin)抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
3’端ORF70＝插入位点下游的重组区
ORI＝质粒的复制起点
APr＝质粒的氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因上游orf70＝插入位点上游的重组区
p455＝新颖启动子p455
bp＝碱基对
图6.orf70插入区放大的rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的基因组的示意图。orf69：orf70中插入位点上游的开放阅读框编号69；p455：本文中所述的新颖启动子，参见(例如)实例1；H3：转基因流行性感冒病毒血凝素；71pA：新多聚腺苷酸化序列；Δorf70：含有orf71的启动子的orf70的其余部分，其编码结构病毒糖蛋白II(gpII)。
图7.间接免疫荧光分析：经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染的VERO-细胞的间接免疫荧光分析
24h p.i.细胞用乙醇固定并风干。使用针对H3的市售单克隆抗体作为第一抗体及FITC偶联的兔抗小鼠IgG作为二次抗体，通过荧光显微镜术在经重组EHV-1 RacHSE-70-p455-H3感染的细胞中显示H3。
图8.蛋白印迹法：经不同代的rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3或对照rEHV-1 RacH-SE感染或模拟感染的细胞的蛋白印迹法。将左侧的印迹与针对EHV-1的gpII的单克隆抗体Ai2G7一起培育。将右侧的重复印迹与针对流行性感冒A血凝素H3的市售兔超免疫血清(PA5-34930)一起培育。
图9.病毒效价：显示攻击后经疫苗接种或未经疫苗接种的猪的肺试样的病毒负荷的图
灭活＝市售灭活的疫苗
EHV＝rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3
图10.转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH的质粒图谱及核苷酸序列
图11.用于将表达盒p430-H1av-BGH插入EHV-1 RacH的orf1/3中的转移质粒的质粒图谱及核苷酸序列。
H1av＝编码流行性感冒A病毒血凝素H1的开放阅读框
BGHpA＝牛生长激素多A序列
启动子aph＝原核卡那霉素抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
侧翼B＝插入位点下游的重组区
侧翼A＝插入位点上游的重组区
p430＝新颖启动子p430bp＝碱基对
图12.orf1/3插入区放大的rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av的基因组的示意图。
Δorf1：插入位点上游的开放阅读框1的其余部分；p430：本文中阐述新颖启动子，参见(例如)实例1；H1av：转基因流行性感冒病毒血凝素；BGHpA：牛生长激素多聚腺苷酸化序列；orf3：插入位点下游的开放阅读框3。
图13.经显示转基因的表达的rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染的细胞的蛋白印迹及免疫荧光。H1av＝rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av
SE＝rEHV-RacH-SE(对照)
模拟＝未经感染细胞(对照)
图14.两个插入区放大的rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(rEHV-1-RacH-SE B)的基因组的示意图。
Δorf1：插入位点上游的开放阅读框1的其余部分；p430：新颖启动子；H1av：转基因流行性感冒病毒血凝素；BGHpA：牛生长激素多聚腺苷酸化序列；orf3：插入位点下游的开放阅读框3。
orf69：orf70中插入位点上游的开放阅读框69；p455：新颖启动子；H3：转基因流行性感冒病毒血凝素；71pA：新多聚腺苷酸化序列；Δorf70：含有orf71的启动子的orf70的其余部分，其编码结构病毒糖蛋白II(gpII)。
图15.蛋白印迹法：经rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(B)、空的载体rEHV-1 RacH-SE(SE)感染或模拟感染(对照)的细胞的蛋白印迹法。将重复印迹与针对H3(H3)的市售兔超免疫血清、针对H1(H1)的市售兔超免疫血清(PA 34929)、或针对EHV-1gpII(gpII)的单克隆抗体Ai2G7一起培育。
图16.攻击之前及之后1、2及3天的组的平均体温。误差杠，标准偏差。每个研究日自左至右：阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、经RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种(1×EHV-1)、经RacH-SE-70-p455-H3进行两次疫苗接种(2×EHV-1)、或经灭活的猪IAV疫苗进行两次疫苗接种(2×杀死)的动物。
图17.攻击后1天及3天的组的平均肺评分。误差杠，标准偏差。阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、经RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种(1×EHV-1)、经RacH-SE-70-p455-H3进行两次疫苗接种(2×EHV-1)、或经灭活的猪IAV疫苗进行两次疫苗接种(2×杀死)的动物。
图18.在攻击当天收集的针对猪IAV H3攻击毒株R452-14的动物血清的血清中和(SN)效价的倒数。20，检测限值。阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、经RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种(1×EHV-1)、经RacH-SE-70-p455-H3进行两次疫苗接种(2×EHV-1)、或经灭活的猪IAV疫苗进行两次疫苗接种(2×杀死)的动物。
图19.来自猪IAV攻击施加后1天或2天获取的BALF的IL-1β的结果。每个点代表每一个动物测定的值。阴性对照组(Neg.Ctr.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、经RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种(1×EHV-1)、经RacH-SE-70-p455-H3进行两次疫苗接种(2×EHV-1)、或经灭活的猪IAV疫苗进行两次疫苗接种(2×杀死)的动物。
图20.在第二次疫苗接种后7天再刺激的PBMC的IFNγ-ELISpot的结果。(A)未经疫苗接种的对照组；(B)经灭活的猪IAV疫苗进行两次疫苗接种；(C)经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种；(D)经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3进行两次疫苗接种。对于仅经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种的动物，再刺激对应于第一次疫苗接种后7天。每个点代表给定时间点及用特定刺激再刺激后每一个动物测定的值。对于再刺激而言，使用对应于rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中的H3疫苗抗原的重组表达的猪IAV HA(HA_V)、对应于攻击毒株R452-14的H3的重组表达的猪IAV HA(HA_CH)、用以稀释HA_V及HA_CH的培养基(RPMI)、空EHV-1载体RacH-SE(空的EHV-1)、疫苗RacH-SE-70-p455-H3(EHV-1-H3)、猪IAV H3N2攻击毒株R452-14(H3N2)、用于生长R452-14(MDCK)的未经感染细胞的细胞上清液、或重组表达的猪IAV核蛋白(NP)。
图21：转移质粒pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH的示意性图谱
图22：转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71的示意性图谱
图23：orf1/3及orf70插入区放大的rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm(rEHV-1 RacH-SE_D)的线性双链DNA基因组
图24：经rEHV-1 RacH-SE_B、RacH-SE_D、RacH-SE感染或未经感染(对照)的细胞的蛋白印迹法。将重复印迹与针对H3的多克隆兔超免疫血清(PA5-34930)、针对H1的多克隆兔超免疫血清(PA5-34929)、或针对EHV-1糖蛋白II(gpII)的单克隆抗体(Ai2G7)一起培育。所有抗体皆产生预计型式，确认期望抗原H3及H1的表达以及不同病毒的可比复制效率，如所有感染的细胞试样中EHV-1gpII的非常相似的染色所判断。
图25：小鼠血清的流行性感冒A病毒中和测试的结果。*误差杠指示标准偏差。
图26：转移质粒pU70-455-SBVGc_71K71的图谱
图27：A)用于检测SBV的病毒基因组的未经疫苗接种的对照牛(上图)及经rEHV-SBV-Gc进行两次疫苗接种的动物(下图)的量化RT-PCR的结果。针对未经疫苗接种及经疫苗接种的动物的每一组分别通过不同类型的线及符号鉴别个别动物。动物1绘示为具有黑色填充圆圈的黑线(对应于图27B中的黑色杠)。动物2绘示为具有灰色填充三角形的灰色折线(对应于图27B中的浅灰色杠)。动物3绘示为具有未填充正方形的黑色折线(对应于图27B中的白色杠)。动物4绘示为具有灰色填充菱形的灰色折线(对应于图27B中的深灰色杠)。B)未经疫苗接种的对照牛(上图)及经rEHV-SBV-Gc进行两次疫苗接种的动物(下图)的血清中和测试的结果。针对未经疫苗接种及经疫苗接种的动物的每一组分别通过不同杠颜色/填充(自黑色经浅灰色及深灰色至白色)鉴别个别动物。动物1绘示为黑色杠(对应于图27A中具有黑色填充圆圈的黑线)。动物2绘示为浅灰色杠(对应于图27A中具有灰色填充三角形的灰色折线)。动物3绘示为白色杠(对应于图27A中未填充正方形的黑色折线)。动物4绘示为深灰色杠(对应于图27A中具有灰色填充菱形的灰色折线)。
图28：EHV中和测试。自各别组中的相同动物的试样获得的所有结果皆以相同灰色色调显示：一个动物是由黑色填充杠表示，另一动物是由浅灰色填充杠表示，第三个动物是由白色杠表示，且第四个动物是由深灰色杠表示。
图29：针对攻击后一天杀死的动物的猪IAV肺效价，测定为TCID50/g肺组织。neg.ctrl.，阴性对照组；chall.ctrl.，攻击对照组；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种及其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。数据点指示针对个别动物获得的平均值。中间水平线分别指示组平均值。用于成对统计比较各组的p值是于下文给出且分别是通过使用Mann-Whitney测试及Windows软件7.02用GraphPad (GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA 92037,USA)的t测试使用标准软件设置来计算。
图30：针对攻击后三天杀死的动物的猪IAV肺效价，测定为TCID50/g肺组织。neg.ctrl.，阴性对照组；chall.ctrl.，攻击对照组；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种及其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。数据点指示针对个别动物获得的平均值。中间水平线分别指示组平均值。用于成对统计比较各组的p值是于下文给出且分别是通过使用Mann-Whitney测试及Windows软件7.02用GraphPad (GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA 92037,USA)的t测试使用标准软件设置来计算。
图31：针对攻击后五天杀死的动物的猪IAV肺效价，测定为TCID50/g肺组织。neg.ctrl.，阴性对照组；chall.ctrl.，攻击对照组；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种及其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。数据点指示针对个别动物获得的平均值。中间水平线分别指示组平均值。用于成对统计比较各组的p值是于下文给出且分别是通过使用Mann-Whitney测试及Windows软件7.02用GraphPad (GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA 92037,USA)的t测试使用标准软件设置来计算。
图32：针对与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV血凝素H3抗原的猪免疫球蛋白G(IgG)特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果。对于测试，将每一孔用100ng重组表达的H3涂布。分别地，成对量测试样，试样平均值是自成对量测计算，且组值是自试样平均值计算。chall.ctrl.，攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种且其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。误差杠指示标准偏差。在图右侧的图例中指示研究天(SD)。
图33：针对与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV血凝素H3抗原的猪免疫球蛋白G(IgG)特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果。对于测试，将每一孔用100ng重组表达的H3涂布。分别地，成对量测试样，试样平均值是自成对量测计算，且组值是自试样平均值计算。chall.ctrl.，攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种且其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。误差杠指示标准偏差。在图右侧的图例中指示研究天(SD)。
图34：干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)的结果。在研究第28天(SD28)，自取自研究动物的血液纯化外周血单核细胞(PBMC)。然后将PBMC用H3N2猪IAV攻击毒株R452-14以1的感染复数(H3N2MOI 1)再刺激，或用与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原以1μg/ml(rH3 1μg/ml)的浓度再刺激。使用再刺激的PBMC，实施干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，并将获得的值正规化为10^6个细胞并分别计算为每组平均值。chall.ctrl.，攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种且其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。误差杠指示标准偏差。
图35：干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)的结果。在研究第28天(SD28)，自取自研究动物的血液纯化外周血单核细胞(PBMC)。然后将PBMC用H3N2猪IAV攻击毒株R452-14以1的感染复数(H3N2MOI 1)再刺激，或用与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原以1μg/ml的浓度(rH3 1μg/ml)再刺激。使用再刺激的PBMC，实施干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，并将获得的值正规化为10^6个细胞并分别计算为每组平均值。chall.ctrl.，攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM，进行两次肌内疫苗接种的组；IN+IM，首次鼻内疫苗接种且其次肌内疫苗接种的组；2×IN，进行两次鼻内疫苗接种的组。误差杠指示标准偏差。
实施例
本发明包括以下实例以展现本发明的优选实施例。那些熟习此项技术者应了解，下列实例中揭示的技术代表本发明者发现在实践本发明中运行良好的技术，且因此可认为构成其实践的优选方式。然而，那些熟习此项技术者借助于本揭示内容应了解，可对所揭示具体实施例作出多种改变且仍获得相同或类似结果，此并不背离本发明的精神及范畴。
实施例1：
新插入位点ORF70的确立
为了增强EHV-1载体的能力，本发明者试图发现自一个载体主链表现表达两种不同转基因而不需要在一个启动子控制下通过RNA病毒衍生的功能偶联的方式。本发明者假设疱疹病毒基因组可耐受平行使用两个独立的转基因插入位点。为了确定EHV-1ORF70是否是适宜转基因插入位点，通过经典同源重组用编码自身荧光性mCherry蛋白的表达盒替代orf70(1236bp)的5'端的801个碱基对(Shaner等人，2004)(图2)。质粒pU-mC70-BGH的图谱在图3(SEQUENCE ID NO.21)中。用XbaI自pU-mC70-BGH切除用于同源重组的DNA片段。将凝胶纯化的片段与EHV-1 RacH的病毒基因组DNA共转染至RK13细胞中。通过活荧光及病毒滴定(未显示)显示重组载体病毒的有效复活及培养细胞中的有效复制。缺失三分的二orf70具有额外益处，即消除由orf70编码的糖蛋白G的表达。显示EHV-1的糖蛋白G是抵抗宿主的免疫反应的非结构、分泌的趋化介素结合蛋白(Drummer等人，1998；Bryant等人，2003)。由于载体疫苗旨在刺激接种者的免疫反应，故去除病毒载体的此特定免疫抑制功能可能另外改良病毒载体平台EHV-1 RacH-SE的性能。
实施例2：
在重组EHV-1载体疫苗中新颖ORF70插入位点与p455启动子的使用及重组病毒的构建
p455启动子：
对于第一动物实验，使用来自猪源流行性感冒A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)，Genbank登录号：ABS50302.2)的流行性感冒血凝素亚型H3。合成其编码序列并将其次克隆于转移载体pU70-p455-71K71(图4，SEQ ID NO.22)中，从而生成转移质粒pU70-p455-H3-71K71，将H3置于新颖p455启动子及新颖71pA多聚腺苷酸化信号控制下并使该盒与用于插入orf70中的重组区(图5，SEQ ID NO.23)同框。
通过使用RED重组系统的进行中诱变(Tischer等人，2006)，将表达盒p455-H3-71插入pRacH-SE的orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3(图6)。
用pRacH-SE70-p455-H3转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3复活并进行斑块纯化两次。通过对插入区的高保真度PCR产物的测序验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA，图7)分析转基因在感染细胞中的表达。
使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未显示)及蛋白印迹法(图8)确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复。通过使用鸡红细胞(未显示)的血细胞吸附测试分析感染细胞的质膜上的H3的三聚体的外观。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒rEHV-1 RacH-SE的效价在相同范围内，指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未显示)。此是通过使rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL细胞中传代直至复活后第20代(P20)来确认。于P5、P10、P15及P20，通过滴定、测序及蛋白印迹法(图8)表征病毒，于P10及P20，另外通过IFA表征病毒，且确认HA编码插入物以及启动子及多A序列的HA表达及遗传稳定性。
图8中所示的两个印迹是与具体而言检测EHV-1糖蛋白II(gpII)的单克隆抗体Ai2G7(左)或与抵抗流行性感冒血凝素亚型H3的兔(PA5-34930)的商业多克隆抗体(右)一起培育的复制物。如所预计，在经重组EHV-1感染的所有细胞培养物中皆检测到gpII。如所预计，在所有感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的不同传代的细胞中皆检测到全长H3。H3-抗血清的特异性示于相同蛋白印迹中，参见泳道gG430mC。如所预计，此处仅gpII细胞产生反应，而抗H3抗体在各别复制泳道中不结合。
通过使用单克隆抗H3抗体及马抗EHV抗血清的经P20感染的细胞中的病毒斑块的双重免疫荧光分析(dIFA)，确认实际上所有EHV-1诱导的斑块亦表达H3(未显示)。所有测试皆确认重组EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的稳定性。
实施例3：
使用新颖ORF70插入位点的概念验证动物研究(POC I)及血清学反应的评估：
测试动物：纳入准则及实验设计：
将10只天生流行性感冒A的仔猪(首次实验的母猪)的五组包括于POC-I研究中，如表2中所概述。
表2
将1×107TCID50的感染剂量的rEHV-1 RacH-70-p455-H3(EHV-1)在5周龄施加一次或在2周龄及5周龄施加两次。为了比较，将市售灭活的疫苗在2周龄及5周龄施加两次。为了不消除灭活的疫苗(灭活)的效应，所有仔猪皆不含母体来源的抗体。两组未经疫苗接种，但接受生理氯化钠溶液(NaCl)的注射，分别用作攻击对照或严格阴性对照。第二次疫苗接种后21天，除了严格阴性对照组的外的所有组皆经1×10 7TCID50的异源流行性感冒A(IVA)毒株(来自猪R452-14的H3N2流行性感冒A病毒，由BI拥有的攻击分离物)攻击。尽管在未经疫苗接种的攻击对照组(Chall ctrl)中，所有猪在攻击感染后1天及3天皆在其肺中具有高流行性感冒病毒效价，但严格阴性对照组(neg ctrl)及经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3进行两次疫苗接种(EHV 2×)的组中的所有猪在此两天中皆对IVA呈阴性。在经灭活的对照疫苗(Inact 2×)进行两次疫苗接种的组中，五只动物中的一只在攻击后第3天具有低的IVA效价。在攻击之前21天经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3进行一次疫苗接种(EHV 1×)的组中，五只动物中的两只在攻击感染后1天且五只中的一只在攻击后3天在其肺中具有低的IVA效价。(图9).
经1×107TCID50的rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的两次疫苗接种完全保护猪免于异源IVA、亚型H3N2的攻击感染。展现EHV-1载体RacH-SE适于猪的疫苗接种，且新颖启动子p455在驱动疫苗接种的猪中的IVA血凝素的免疫原性表达中起作用。
实施例4：
重组EHV-1载体疫苗中新颖p430启动子的使用及重组病毒的构建
p430启动子：
使用新近鉴别的p430启动子以驱动来自H1N1病毒((A/猪/Gent/132/2005(H1N1)，Genbank登录号：AFR76623.1)的另一流行性感冒血凝素的表达。由于此病毒分离株中的血凝素源自禽类IAV，故其将称为H1av。合成H1av并将其次克隆至转移载体中用于orf1/3插入区(图10，SEQ ID NO.24)中，以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH(图11，SEQ ID NO.25)。将H1av的表达置于p430启动子及牛生长激素(BGH)多A信号控制下。
通过使用RED重组系统的进行中诱变(Tischer等人，2006)，将表达盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE的orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av(图12)。
用pRacH-SE1/3-p430-H1av转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av复活并进行斑块纯化两次。通过对插入区的高保真度PCR产物的测序验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA)及蛋白印迹法使用市售单克隆及多克隆抗体分析转基因在感染细胞中的表现表达(图13)。
使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA及蛋白印迹法确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复(未显示)。通过使用鸡红细胞(未显示)的血细胞吸附测试分析H1av的正确处理及转运及感染细胞的质膜中的定位。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒RacH-SE的效价在相同范围内，指示该转基因表现表达对病毒复制没有有害效应(未显示)。
通过抗体PA-34929在75kDa迁移的宽带的特异性检测与自其序列预测的重组HA糖蛋白的预计外观相同。经单克隆抗体C102的细胞膜表观染色符合如所预计的亚细胞定位(图13)。
为了测试表达的重组血凝素是否如预计经处理及转运，将VERO细胞用rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE(亲代)以0.01的m.o.i.感染，或未经感染。24h p.i.活的经感染及未经感染的细胞与鸡红细胞于PBS中的悬浮液一起培育，用PBS洗涤并用荧光Hoechst 33342核染色剂染色。由于禽类红细胞含有细胞核，故可经Hoechst33342染色且通过荧光显微镜术显示为微小蓝斑，与不表达血凝素的rEHV-1 RacH-SE感染的细胞相比，在rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染的细胞上，鸡红细胞的吸附显著增加(未显示)。由此可推断出，将血凝素以如同其是通过真正的流行性感冒病毒感染所产生一样的方式翻译、处理并转运至载体病毒感染细胞的质膜上。
感染细胞的血细胞吸附的清晰表型支持蛋白印迹法及免疫荧光分析的发现，显示转基因蛋白的有效表达并表明在EHV-1载体感染细胞的细胞表面上形成功能性HA三聚体。
实施例5：
重组EHV-1载体疫苗中新颖ORF70插入位点及ORF1/3插入位点的平行使用
为了显示两种新颖启动子可平行使用，生成表达两种不同流行性感冒A病毒亚型的两种不同血凝素的重组EHV-1 RacH。
通过经单次插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染的感染细胞的蛋白印迹验证多克隆商业抗体对H3(PA5-34930)及H1(PA5-34929)的特异性及无交叉反应性(未显示)。
合成编码流行性感冒A病毒(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))的血凝素的开放阅读框并将其克隆至转移载体pU1-3-p430-BGHKBGH(图10)中，从而产生pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(图11)。以重组BAC pRacH-SE-70-p455-H3开始，通过两步RED重组将组装于pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH(图11，SEQ ID NO.25)中的表达盒p430-H1av-BGH插入orf1/3插入位点中以生成pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3转染PK/WRL细胞，并使重组病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3复活并进行斑块纯化两次(图12)。
此重组病毒的简称为rEHV-1 RacH-SE_B。通过对插入区的高保真PCR产物与侧翼序列一起测序来验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA，未显示)及蛋白印迹法使用市售单克隆及多克隆抗体(图13)分析转基因在感染细胞中的表达。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未显示)及蛋白印迹法(图13)确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复。
如图13中所示，两种转基因H3及H1av在经双重插入重组rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(B)感染的细胞培养物中平行表达。转基因表达是稳定的且不损害在PK/WRL细胞中直到第11代测试的病毒效价(未显示)。
显示两种新颖启动子p430及p455在细胞培养物中rEHV1-RacH复制的上下文中具有功能。病毒复制循环期间的活性程度似乎与自活体外启动子动力学实验所推断非常相似。这些性质容许基于以类似效率平行表达两种不同抗原的EHV-1 RacH或其他载体平台来产生重组载体疫苗。若疫苗靶由两种不同病原体组成，则与两个多聚腺苷酸化序列组合的两个插入位点中的两个新颖启动子的应用可显著降低商品的成本且较仅表达一种抗原性组分的载体具有明显优势。
实施例6：
用于猪的单价EHV-1载体流行性感冒A病毒疫苗(H3疫苗)的生成、活体外表征及活体内测试
选择血清型H3的猪IAV流行性感冒病毒血凝素(SEQ ID NO 27)(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)，Genbank登录号：ABS50302.2)作为欲测试的抗原用于猪中的疫苗接种研究。此针对猪IAV的新颖疫苗提供DIVA特征，例如通过在由猪IAV野生毒株感染的动物中、而非仅经本文所述疫苗接种的动物中检测到针对猪IAV蛋白NP或NA的抗体，此乃因其仅表达一种猪IAV HA蛋白。合成并亚克隆其编码序列，从而生成转移载体pU70-p455-H3-71K71，将H3置于新颖p455启动子及新颖71pA多聚腺苷酸化信号控制下并使该盒与用于插入orf70中的重组区同框(图2)。
通过使用RED重组系统的进行中诱变，将表达盒p455-H3-71插入pRacH-SE的orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3(图6)。
用pRacH-SE70-p455-H3转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3复活并进行斑块纯化两次。
通过对插入区的高保真度PCR产物的测序验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA，图7)及蛋白印迹法(图8)使用市售单克隆及多克隆抗体分析转基因在感染细胞中的表达。
使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未显示)及蛋白印迹法(图8)确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复。通过使用鸡红细胞(未显示)的血细胞吸附测试分析感染的质膜上的H3的三聚体的外观。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒RacH-SE的效价在相同范围内，指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未显示)。此是通过使rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL细胞中传代直至复活后第20代(P20)来确认。于P5、P10、P15及P20，通过滴定、测序及蛋白印迹法(图8)表征病毒，于P10及P20，另外通过IFA表征病毒，且确认HA编码插入物以及启动子及多A序列的HA表达及遗传稳定性。
图9中所示的两个印迹是与具体而言检测EHV-1糖蛋白II(gpII)的单克隆抗体Ai2G7(左)或与抵抗流行性感冒血凝素亚型H3的兔(PA5-34930)的商业多克隆抗体(右)一起培育的复制物。如所预计，在经重组EHV-1感染的所有细胞培养物中皆检测到gpII。如所预计，在所有感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的不同传代的细胞中均检测到全长H3。亦通过经表达H1亚型病毒的流行性感冒血凝素的其他重组EHV-1 RacH-SE感染的细胞的蛋白印迹显示H3-抗血清的特异性，参见下文图15。
通过使用单克隆抗H3抗体及马抗EHV抗血清的经P20感染的细胞中的病毒斑块的双重免疫荧光分析(dIFA)，确认实际上所有EHV-1诱导的斑块亦表达H3(未显示)。所有测试皆确认重组EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的稳定性。
为了研究rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3在年轻仔猪中作为载体疫苗的性质，在疫苗接种-攻击研究中对其进行测试。详细地，在2及5周龄时(双注射疫苗接种，2×EHV-1)或仅在5周龄时(单注射疫苗接种，1×EHV-1)用含有1×10^7TCID50的剂量的RacH-SE-70-p455-H3的细胞培养上清液对针对猪IAV无母体来源的免疫性(非母源性抗体)的仔猪进行两次肌内疫苗接种。未经疫苗接种的组用作阴性对照且在2及5周龄时根据制造商的说明书(除了疫苗接种的时间点)经市售灭活的猪IAV疫苗接种的一组动物用作阳性对照(杀死)。在8周龄时，通过1×10^7TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击毒株(欧洲野生病毒分离株R452-14，其的H3与RacH-SE-70-p455-H3中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未经疫苗接种且未经攻击的动物用作阴性对照，而未经疫苗接种但经攻击的动物用作攻击对照。在疫苗接种时及之后及在攻击之前及之后，量测体温并在不同时间点获取血样。在攻击后一天，每组的一半动物被杀死且针对是猪IAV感染典型的病灶对肺进行评分，每只动物分别获取每个左肺及右肺的三个肺试样，以测定肺匀浆物中的感染性猪IAV效价，且对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行取样。在攻击后3天，对每组的其余一半动物实施相同程序。
在研究猪IAV攻击病毒施加后的体温升高时，未经疫苗接种的动物显示在攻击后1天约1℃的体温升高。对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行两次疫苗接种的组，防止攻击后1天的此体温增加(图16)。
来自猪IAV攻击病毒施加后1或3天杀死的动物的肺评分的评估揭示，阴性对照不显示是猪IAV感染典型的肺病灶，攻击对照显示在6-7％的平均范围内的肺病灶，且关于组平均值，对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行两次疫苗接种的组，肺病灶评分强烈降低至1％至小于4％(图17)。
来自猪IAV攻击病毒施加后1或3天杀死的动物的平均猪IAV肺效价显示阴性对照在肺试样中不显示猪IAV，而攻击对照显示每g肺组织的病毒效价在超过5log(第3天)至超过7log(第1天)范围内。形成鲜明对比的是，对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行一次疫苗接种的组，组平均值强烈降低至约2log或更少，并且对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行两次疫苗接种的组降低至不可检测的含量(图9)。
在测试疫苗接种后猪IAV中和抗体的诱导时，在首次疫苗接种后3周，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行一次疫苗接种的动物的血清显示在约160范围内的中和效价的倒数，且在第2次疫苗接种后3周，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行两次疫苗接种的动物的血清显示约2560的中和效价，而未经疫苗接种的组的血清具有不可检测的猪IAV中和抗体含量(图18)。
在猪IAV攻击后1或3天测定来自动物的BALF中促发炎细胞介素IL-1β的量时，在第1天测试的四只动物的三只中可检测到超过100pg/ml至高达900pg/ml的IL-1β含量，而对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行一次疫苗接种的动物的BALF，该含量降低至100-300pg/mlIL-1β，且对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行两次疫苗接种的所有动物，甚至进一步降低至0pg/ml至小于100pg/ml IL-1β的含量(图19)。此显示猪IAV感染后，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行疫苗接种有效防止促发炎细胞介素IL-1β的诱导。
在测试在研究第28天取样并使用不同刺激的外周血单核细胞(PBMC)的再刺激时，未经疫苗接种的动物的PBMC的刺激在IFNγ-ELISpot中显示小于75/1×10^6计数，而与所用刺激无关(图20A)。已接受两次灭活的疫苗(杀死)的动物的PBMC在经重组猪IAV核蛋白NP再刺激时显示约150/1×10^6计数，且在经猪IAV H3N2攻击毒株R452-14再刺激时在IFNγ-ELISpot中显示约3000/1×10^6计数，但在使用重组猪IAV HA或EHV-1病毒时不显示PBMC的再刺激(含量为75/1×10^6计数或更低)(图20B)。相比的下，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行一次或两次疫苗接种的动物在经猪IAV H3N2攻击毒株R452-14再刺激时亦在IFNγ-ELISpot中显示约200(1×EHV-1)至300(2×EHV-1)/1×10^6计数，但在使用重组猪IAV NP时不显示PBMC的再刺激(含量为75/1×10^6计数或更低)(图20C及D)。分别地，在使用EHV-1病毒进行再刺激时，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行一次或两次疫苗接种的动物在经空的EHV-1疫苗RacH-SE再刺激时在IFNγ-ELISpot中显示约300/1×10^6计数，且在使用表达猪IAV H3的RacH-SE-70-p455-H3疫苗时，此值进一步增加至超过400/1×10^6计数(图20C及D)。因此，在使用重组猪IAV HA进行再刺激时，仅经RacH-SE-70-p455-H3疫苗进行一次或两次疫苗接种的动物在IFNγ-ELISpot中显示约100-150(1×EHV-1)至150-200(2×EHV-1)/1×10^6计数(图20C及D)。
实施例7
用于猪的四价EHV-1载体流行性感冒A病毒疫苗的生成、活体外表征及活体内测试
如下文所述，在所述发明中，源自H1N2、H3N2、H1N1禽类及H1N1大流行猪IAV亚型/血清型的四种上述猪IAV血凝素(HA)抗原由两种重组EHV-1载体病毒表达。此针对猪IAV的新颖四价疫苗提供DIVA特征，例如通过在由猪IAV野生毒株感染的动物中、而非仅经本文所述疫苗接种的动物中检测到针对猪IAV蛋白NP或NA的抗体，此乃因其仅表达猪IAV HA蛋白。
在活体外表征新颖四价猪IAV疫苗且在活体内测试其针对猪IAV的效能。
使用新近鉴别的p430启动子以驱动猪IAV H1N1((A/猪/Gent/132/2005(H1N1)，Genbank登录号：AFR76623.1)的表达。由于此病毒分离株中的血凝素源自禽类IAV，故其将称为H1av。合成H1av并将其亚克隆至转移载体中用于orf1/3插入区以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH。将H1av的表达置于p430启动子及牛生长激素(BGH)多A信号控制下并与用于插入orf1/3中的重组区(图11，SEQ ID NO.25)同框。
通过使用RED重组系统的进行中诱变，将表达盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE的orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av(图12)。用pRacH-SE1/3-p430-H1av转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av复活并进行斑块纯化两次。通过对插入区的高保真度PCR产物的测序验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA)及蛋白印迹法使用市售单克隆及多克隆抗体分析转基因在感染细胞中的表达(图13)。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA及蛋白印迹法确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复(未显示)。通过使用鸡红细胞(未显示)的血细胞吸附测试分析H1av的正确处理及转运及感染细胞的质膜中的定位。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒RacH-SE的效价在相同范围内，指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未显示)。
通过抗体PA-34929在75kDa迁移的宽带的特异性检测与自其序列预测的重组HA糖蛋白的预计外观相同。经单克隆抗体C102的细胞膜表观染色符合如所预计的亚细胞定位。
为了测试表达的重组血凝素是否如预计经处理及转运，将VERO细胞用rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE(亲代)以0.01的m.o.i.感染，或未经感染。24h p.i.活的经感染及未经感染的细胞与鸡红细胞于PBS中的悬浮液一起培育，用PBS洗涤并用荧光Hoechst 33342核染色剂染色。由于禽类红细胞含有细胞核，故可经Hoechst33342染色且通过荧光显微镜术显示为微小蓝斑，与不表达血凝素的rEHV-1 RacH-SE感染的细胞相比，在rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染的细胞上，鸡红细胞的吸附显著增加(未显示)。由此可推断出，将血凝素以如同其是通过真正的流行性感冒病毒复制所产生一样的方式翻译、处理并转运至载体病毒感染细胞的质膜上。感染细胞的血细胞吸附的表型支持蛋白印迹法及免疫荧光分析(对于H1av，图13)的发现，显示转基因蛋白的有效表达并表明在EHV-1载体感染细胞的细胞表面上形成功能性HA三聚体。
通过经单次插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染的感染细胞的蛋白印迹验证多克隆商业抗体对H3(PA5-34930)及H1(PA5-34929)的特异性及无交叉反应性(未显示)。
接下来，生成表达两种不同流行性感冒A病毒亚型/血清型的两种不同血凝素的重组EHV-1 RacH-SE。
以重组BAC pRacH-SE-70-p455-H3开始，通过两步RED重组将组装于转移载体pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH(图12)中的表达盒p430-H1av-BGH插入orf1/3插入位点中以生成pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3转染PK/WRL细胞，并使重组病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3复活并进行斑块纯化两次。此重组病毒的简称为rEHV-1 RacH-SE_B(图14)。通过对插入区的高保真PCR产物与侧翼序列一起测序来验证表达盒的正确插入。
通过间接免疫荧光分析(IFA，未显示)及蛋白印迹法使用市售单克隆及多克隆抗体(图15)分析转基因在感染细胞中的表达。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未显示)及蛋白印迹法(图15)确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复。
两种转基因H3及H1av在经双重插入重组rEHV-1 RacH-SE_B感染的细胞培养物中平行表达。转基因表达是稳定的且不损害在PK/WRL细胞中直到第11代测试的病毒效价。
显示具有两个插入位点及两个新颖启动子的增强的EHV-1载体平行表达两种流行性感冒病毒血凝素。如通过IFA测定的亚细胞定位及如通过蛋白印迹法测定的SDS-PAGE中的迁移率对应于自文献已知的流行性感冒A病毒感染细胞中表达的真正的血凝素。
接下来，生成表达血凝素H1hu(SEQ ID NO:29，A/猪/Italy/4675/2003(H1N2)；Genbank登录号ADK98476.1))及H1pdm(SEQ ID NO:26，A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)；Genbank登录号ADR01746.1)的第二双重插入rEHV-1 RacH。
合成H1hu的编码序列并次克隆至转移载体中用于orf1/3插入区以生成pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH。将H1hu的表达置于p430启动子及牛生长激素(BGH)多A信号控制下并与用于插入orf1/3中的重组区同框(图21)。
合成并次克隆H1pdm的编码序列，从而生成转移载体pU70-p455-H1pdm-71K71，将H1pdm置于新颖p455启动子及新颖71pA多聚腺苷酸化信号控制下并使该盒与用于插入orf70中的重组区同框(图22)。
随后，通过使用RED重组是统的进行中诱变将表达盒p430-H1av-BGH及p455-H1pdm-71插入pRacH-SE中，从而首先生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu。使用此经修饰的BAC作为靶标，通过使用RED重组是统的进行中诱变插入p455-H1pdm-71，从而生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm。在PK/WRL细胞中转染pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm并使rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm复活并进行斑块纯化三次。新颖重组载体病毒的简称为rEHV-1 RacH-SE_D(图23)。
通过间接免疫荧光分析(IFA，未显示)及蛋白印迹法使用市售单克隆及多克隆抗体(图24)分析转基因在感染细胞中的表达。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未显示)及蛋白印迹法(图24)确认编码EHV-1 gpII的orf71的恢复。
通过在细胞培养物中传代、每5代测定病毒效价来显示重组rEHV-1的遗传及表型稳定性。每10代确认插入区的序列，以及通过蛋白印迹法(未显示)确认转基因表达。通过在覆盖下斑块的双重IFA、对经抗EHV-抗体及转基因特异性抗体染色的斑块进行计数来评估表达保真度(未显示)。
为研究由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗在年轻仔猪中作为载体疫苗的性质，在疫苗接种-攻击研究中对其进行测试。详细地，在1及4周龄时(双注射疫苗接种，2×EHV-1)或在仅4周龄时(单注射疫苗接种，1×EHV-1)用每个疫苗毒株1×10^7TCID50的剂量的rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D对针对猪IAV具有母体来源的免疫性(对母源性抗体呈阳性)的仔猪进行两次肌内疫苗接种。未经疫苗接种的组用作阴性对照。在11周龄时，通过1×10^6TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击毒株(欧洲野生病毒分离株R452-14，其的H3与rEHV-1 RacH-SE_B中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未经疫苗接种且未经攻击的动物用作阴性对照，而未经疫苗接种但经攻击的动物用作攻击对照。在疫苗接种时及之后及在攻击之前及之后，量测体温并在不同时间点获取血样。在攻击后一天，每组的一半动物被杀死且针对是猪IAV感染典型的病灶对肺进行评分，每只动物分别获取每个左肺及右肺的三个肺试样，以测定肺匀浆物中的感染性猪IAV效价，且对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行取样。在攻击后3天，对每组的其余一半动物实施相同程序。分析试样物质及收集的数据以尤其测定攻击后的体温变化、猪IAV感染后的临床体征、肺评分、猪IAV肺效价、肺组织的组织学变化、猪IAV血清中和效价、BALF中的细胞介素含量、如通过IFNγ-ELISpot量测的PBMCS的再刺激以及B细胞活化。
实施例8
经二价rEHV-1 RacH载体疫苗进行疫苗接种的小鼠中针对两种抗原的中和抗体反应的诱导
使用rEHV-1 RacH SE B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-7-p455-H3，参见图14)来免疫Balb/c小鼠，以展现表达的转基因在除猪外的另一物种中具有免疫原性且通过鼻内施加针对两种抗原中的一种诱导中和抗体。
详细地，在研究第0及21天向三组3-5周龄的Balb/c小鼠(每组5只)分别鼻内接种40μl rEHV-1 RacH SE B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3，组1)、或40μl空的载体(rEHV-1 RacH-SE，组2，载体对照)、或40μl组织培养基(组3，阴性对照)。对于组1及组2，感染性重组EHV-1剂量分别为1×10^5TCID50/40μl。在研究第0天(在首次接种之前)、第7、14、21天(在第2次接种之前)、第28天及第35天将小鼠放血。自血样制备血清并于-80℃下冷冻储存。
用于检测针对载体病毒的抗体的免疫荧光分析
将AI-ST细胞以0.001的感染复数(MOI)用rEHV-1 RacH-SE1212(一种自空的载体BAC pRacH-SE1.2复活的病毒)感染。观察24小时p.i.独立斑块，且对细胞进行处理用于间接免疫荧光分析(IFA)。测试在PBS中1:50稀释的所有三组最终出血(第二次疫苗接种14天后获得)的血清。作为阳性对照，EHV-1疫苗接种的马的血清是以1:500的稀释度使用。二级抗体对于小鼠血清是市售FITC偶联的兔抗小鼠IgG且对于马血清是Cy5偶联的山羊-抗马IgG且是以1:200稀释度使用。通过荧光显微镜术评估抗体结合。所有经疫苗接种的小鼠皆在IFA中利用rEHV-1 RacH-SE感染的细胞发生抗体反应性。未经感染的细胞不由任何测试血清结合。来自小鼠的阴性对照组的血清不显示与感染细胞或未经感染的细胞的任何特异性结合。数据概述于下表中。
表3.抗EHV-1抗体的IFA的荧光显微镜术结果
由此可推断出，将rEHV-1接种至小鼠的鼻孔中导致感染及病毒复制，从而刺激小鼠免疫系统以产生抗EHV-1抗体。
病毒中和测试(VNT)
为了显示针对源自流行性感冒A病毒(IAV)(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))或(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))的表达的转基因的保护性免疫性的诱导，测试小鼠血清针对各别病毒的中和活性(Allwinn等人2010；Trombetta等人2014)。用于中和测试的IAV是来自2014年德国的猪的分离株，具体而言是A/猪/Germany/AR452/2014(H3N2)及A/猪/Germany/AR1181/2014(H1N1)。由于该分离株与疫苗靶源自的毒株异源，故该病毒由小鼠血清的任何中和将指示通过rEHV-1疫苗接种广泛且有效地诱导保护性免疫。作为阴性对照血清，使用已显示对流行性感冒病毒抗体呈阴性的猪的血清。
流行性感冒A病毒中和测试：
在使用前，将用于病毒中和以及反滴定的MDCK细胞在96孔板中于37℃/5％CO2下培育2天。将各别IAV原液H3N2及H1avN1在冰上解冻并稀释于含有庆大霉素(Gentamycin)及双倍浓度的胰蛋白酶(MEM/Genta/2x胰蛋白酶)的MEM中。
测试的血清是来自组1(rEHV-1 RacH SE B)、组2(空的载体)、阳性对照(经灭活的多价IAV疫苗接种的猪的血清)及阴性对照的最终出血。
将血清热灭活，且分别在两个及三个独立试验中1:2连续稀释，以1:16开始直至1:4096。将IAV稀释至约100TCID50/中和反应。将中和反应物于37℃、5％CO2下培育2小时。所用病毒的反滴定是一式四份进行的。移除生长培养基，且然后用含有庆大霉素及胰蛋白酶的培养基洗涤MDCK细胞，之后添加中和反应物或反滴定的病毒稀释物。在分别向MDCK-细胞添加中和反应物或病毒稀释物后，将VNT及滴定板于37℃/5％CO2下培育1h。其后，移出接种物并用含有庆大霉素及胰蛋白酶的新鲜培养基覆盖细胞。监测5天p.i.CPE并记载。测试中实际使用的病毒效价根据Reed及Münch计算为TCID50/ml，且报导测试血清防止流行性感冒病毒-典型CPE的诱导的稀释度参见下表。
表4：流行性感冒H1avN1 VNT的结果
表5：流行性感冒H3N2 VNT的结果
为了比较独立测试的结果，通过使血清稀释度的倒数与通过其中和的各别效价相乘来计算中和能力。然后将三个测试的平均值除以100，以反映100TCID50的中和(表3、4及5)。数据概述且以图解方式示于图25中。
所有经rEHV-1 RacH SE B疫苗接种的小鼠皆针对各别IAV(即亚型H3N2及H1avN1的异源毒株)产生中和抗体。因此，在p455启动子(H3)控制下自orf70插入位点及在p430启动子(H1av)控制下自orf1/3插入位点平行表达IAV的血凝素的rEHV-1 RacH-SE的两倍鼻内施加成功地刺激BALB/c小鼠中的保护性免疫反应。
可推断出，载体rEHV-1 RacH-SE可用于两种不同转基因的平行表达，以刺激鼻内疫苗接种后的免疫反应。
实施例9
牛的EHV-1载体施马伦贝格(SBV)病毒疫苗的生成、活体外表征及活体内测试
新出现的布尼亚病毒(bunyavirus)之一是施马伦贝格病毒(SBV)，首个欧洲西姆布血清群病毒(Simbu serogroup virus)(正布尼亚病毒属)，在怀孕动物在妊娠的关键阶段被感染时，其可引起流产、死产及严重胎儿畸形，且其到如今愈来愈多地用作研究正布尼亚病毒的模型病毒(Bilk等人，2012)。由于西姆布病毒是由昆虫载体传播且治疗选择不可用，故疫苗接种是疾病控制的主要组成部分。针对SBV及其他西姆布病毒(例如赤羽根病毒(Akabane virus，AKAV)或爱野病毒(Aino virus))灭活的全病毒疫苗可用，且已研发针对SBV的减毒活疫苗(Anonymous,2013,2015；Kraatz等人，2015；Wernike等人，2013b)，然而，该疫苗皆不容许野外感染与疫苗接种的动物之间的分化(DIVA原理)。仅在最近，在致死的小动物攻击模型及牛中测试基于SBV糖蛋白Gc的氨基末端的234个氨基酸(aa)的DIVA兼容性亚单位疫苗(Wernike等人，2017)。当作为表达质粒递送或在哺乳动物细胞培养系统中表达时，Gc结构域在高达66％的动物中赋予保护，而用与相关AKAV的相应结构域连接的SBV的Gc结构域免疫的所有动物被完全保护(Wernike等人，2017)。为了研究rEHV-1 RacH-SE作为载体疫苗在牛中的应用，将SBV-Gc的234个氨基末端aa插入orf70(US4)插入位点中并在新颖p455启动子及71pA多A信号控制下表达并在牛的疫苗接种攻击试验中进行测试。
表达源自施马伦贝格病毒(SBV)糖蛋白c(Gc)的抗原的重组EHV-1的生成
施马伦贝格病毒(SBV)糖蛋白c(Gc)的编码区的234个氨基酸部分经密码子使用优化用于在EHV-1中表达并另外经修饰以实现有效转运至感染细胞的质膜并插入其中。为此，源自流行性感冒A病毒(IAV)血凝素(HA)亚型H1N2(A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)，Genbank登录号ADR01746.1)的信号肽编码序列以及来自该HA的跨膜锚(TM)及细胞质C末端分别连接至5'及3'端。另外，在Gc部分与HA-TM-结构域之间插入GS接头HMGGSGGGGSGGGGSGGGT(SEQ ID NO:30)。合成DNA(SEQ ID NO:31)并将其次克隆于pU70-455-71K71的NotI/KpnI位点中，pU70-455-71K71是用于通过RED介导的BAC pRacH-SE的重组将转基因表达盒插入EHV-1的orf70(US4)中的转移载体。用XbaI切割所得质粒pU70-455-SBVGc_71K71(图26)以释放3056bp DNA片段(SEQ ID NO:32)，将其转化至携带pRacH-SE的大肠杆菌K12GS 1783中。
SEQ ID NO:31：包括用于次克隆的限制位点的合成DNA序列
GCGGCCGCATGAAGGCGATCCTGGTTGTGCTGCTGTACACCTTTGCCACCGCCAACGCCGATACGCTGATCAACTGCAAGAACATCCAGAGCACCCAGCTGACAATCGAGCACCTGAGCAAGTGCATGGCCTTCTACCAGAACAAGACCAGCAGCCCCGTCGTGATCAACGAGATCATCTCCGACGCCAGCGTGGACGAACAGGAACTGATTAAGTCTCTGAACCTGAACTGCAACGTGATCGACCGGTTCATCAGCGAGTCCAGCGTGATCGAGACACAGGTGTACTACGAGTATATCAAGAGCCAGCTGTGTCCACTGCAAGTGCACGATATCTTCACCATCAACAGCGCCAGCAACATCCAGTGGAAGGCCCTGGCCCGCAGCTTTACCCTGGGCGTGTGCAACACCAACCCCCACAAGCACATCTGCCGGTGCCTGGAATCCATGCAGATGTGTACCAGCACCAAGACCGACCACGCCAGAGAGATGAGCATCTACTACGACGGCCACCCCGACAGATTCGAGCACGACATGAAGATTATCCTGAATATCATGCGGTACATCGTGCCCGGCCTGGGCAGAGTGCTGCTGGACCAGATCAAGCAGACCAAGGACTACCAGGCCCTGAGACACATCCAGGGCAAGCTGAGCCCCAAGTCCCAGAGCAACCTGCAGCTGAAGGGCTTCCTGGAATTCGTGGACTTCATCCTGGGCGCCAACGTGACCATTGAGAAAACCCCCCAGACCCTGACCACCCTGAGCCTGATTCATATGGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGCACCATACTGGCCATTTACAGCACAGTTGCGAGCAGCCTGGTCCTGATCGTGAGCCTGGGTGCTATATCATTCTGGATGTGCAGCAACGGCTCTCTCCAGTGCCGCATCTGTATCTGAGGTACC
SEQ ID NO:32：用于RED重组以生成pRacH-SE-70-455-SBVGc的DNA片段
限制酶裂解位置由星号(*)指示
T*CTAGACTCGAGCGCAAGCCCTACACGCGCTACCCCTGCTTTCAACGCGTCAACCTGCACATTGACGGGGAGTTTCTGGTTCACAAGATGCTAGCGTTCAATGCCGCGATGCGCCCATCGGCCGAGGAGCTGCTGTCATACCCAATGTTTGCTCAACTTTAGGATGACTAACCTGTTTCTGGGAGGAGACAGCGTGGGCGACGGTGTATAAAGTTGGTCTGCTTTCAAGCCCTGCCACTGCGCTACAGTGCCACCAACTGTAAAGCGGTAGTAAGCTGCAGTGGTCGACTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATAGGATCCGATCCATGGGCGGCCGCATGAAGGCGATCCTGGTTGTGCTGCTGTACACCTTTGCCACCGCCAACGCCGATACGCTGATCAACTGCAAGAACATCCAGAGCACCCAGCTGACAATCGAGCACCTGAGCAAGTGCATGGCCTTCTACCAGAACAAGACCAGCAGCCCCGTCGTGATCAACGAGATCATCTCCGACGCCAGCGTGGACGAACAGGAACTGATTAAGTCTCTGAACCTGAACTGCAACGTGATCGACCGGTTCATCAGCGAGTCCAGCGTGATCGAGACACAGGTGTACTACGAGTATATCAAGAGCCAGCTGTGTCCACTGCAAGTGCACGATATCTTCACCATCAACAGCGCCAGCAACATCCAGTGGAAGGCCCTGGCCCGCAGCTTTACCCTGGGCGTGTGCAACACCAACCCCCACAAGCACATCTGCCGGTGCCTGGAATCCATGCAGATGTGTACCAGCACCAAGACCGACCACGCCAGAGAGATGAGCATCTACTACGACGGCCACCCCGACAGATTCGAGCACGACATGAAGATTATCCTGAATATCATGCGGTACATCGTGCCCGGCCTGGGCAGAGTGCTGCTGGACCAGATCAAGCAGACCAAGGACTACCAGGCCCTGAGACACATCCAGGGCAAGCTGAGCCCCAAGTCCCAGAGCAACCTGCAGCTGAAGGGCTTCCTGGAATTCGTGGACTTCATCCTGGGCGCCAACGTGACCATTGAGAAAACCCCCCAGACCCTGACCACCCTGAGCCTGATTCATATGGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGCACCATACTGGCCATTTACAGCACAGTTGCGAGCAGCCTGGTCCTGATCGTGAGCCTGGGTGCTATATCATTCTGGATGTGCAGCAACGGCTCTCTCCAGTGCCGCATCTGTATCTGAGGTACCAATAAACGCGGTATGTCTACCTTCAAGCCTATGATGAACGGATGTTTGGTGTTTGCGGCTATTATAACGCTCTTGAGTTTTATGCTATCTCTGGGAACATGCGAAAATTACAGGCGTGTGGTTCGGGATCCTAGGGATAACAGGGTAATCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAAATAAACGCGGTATGTCTACCTTCAAGCCTATGATGAACGGATGTTTGGTGTTTGCGGCTATTATAACGCTCTTGAGTTTTATGCTATCTCTGGGAACATGCGAAAATTACAGGCGTGTGGTTCGGGATCCGACCCTGTTGGTGGGTGCGGTTGGACTCAGAATCTTGGCGCAGGCATGGAAGTTTGTCGGTGACGAAACATACGACACCATCCGCGCAGAAGCAAAGAATTTAGAGACCCACGTACCCTCAAGTGCTGCAGAGTCGT*CTAGA
制备重组pRacH-SE-70-455-SBVGc DNA并通过使用HerculaseTM的高保真度PCR及PCR产物的Sanger测序确认表达盒的正确插入及序列相同性。所用引物参见表6，SEQ IDNO:33至SEQ ID NO:37。
表6：用于PCR及测序的引物
编号 名称 序列 用途
SEQ ID NO:33 up70_F 5‘-CGTGCGCGGATACATCG-3‘ PCR及测序
SEQ ID NO:34 up71_R 5‘-CGCTTCGCAGGTGGGC-3‘ PCR及测序
SEQ ID NO:35 seq455-F1 5‘-GACTGGTGGTAGCATATAC-3‘ 测序
SEQ ID NO:36 SBV Gc F1 5‘-GATCAACGAGATCATCTCC-3‘ 测序
SEQ ID NO:37 SBV Gc R1 5‘-CTGGAGAGAGCCGTTGC-3‘ 测序
重组EHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc的复活及表征
自四种不同的pRacH-SE-70-455-SBVGc纯系制备BAC DNA。将AI-ST细胞(Boehringer-Ingelheim专有猪睪丸细胞系)以105个细胞/孔的密度接种于含有10％FBS(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Munich,Germany,SAFC,Cat 12003C-1000ml)的MEM(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Munich,Germany,SAFC62892-1000M3056)中的6孔板(CorningIncorporated-Life Sciences,One Becton Circle,Durham,NC 27712,USA；REF 353046)中。在细胞60-70％融合时，通常第二天，根据供货商的说明书，使用MirusTM mRNA转染试剂盒(Mirus Bio LLC,545Science Drive,Madison,WI 53711USA)用2μg BAC DNA转染细胞。简言的，将200μl OptimemTM(Thermo Fisher Scientific)培养基添加至5ml聚苯乙烯管中。添加并混合DNA。接下来，添加3μl加强试剂并通过涡漩混合，之后添加相同体积的转染试剂并再次通过涡漩混合。将混合物于室温下培育3分钟且随后直接逐滴添加至细胞培养物中。将细胞于37℃/5％CO2下培育5天。将细胞冲洗至培养基中并收集储存于-80℃下。在MEM中制备复活病毒的连续1:10稀释物并将其平铺于6孔板中的融合AI-ST细胞单层上。于37℃/5％CO2下吸附1h后，移出接种物，并用含有0.5％Methocel(甲基纤维素Ph.Eur.,Fluka64632-500G)及5％FBS的半固体培养基(MEM-Methocel)覆盖。于37℃/5％CO2下培育2至5天(第1代)后，吸出10μl的体积的尽可能位于远离相邻斑块的个别斑块并接种于6孔板中的新AI-ST细胞培养物中。将感染细胞培育2至3天，直至观察到大量CPE(第2代)为止。将细胞冲洗至培养基中并收集储存于-80℃下。将此斑块纯化程序重复两次。对经斑块纯化病毒感染三次的AI-ST细胞进行处理以分别用于间接免疫荧光分析(IFA)或蛋白印迹法。
自感染细胞制备的病毒DNA用作使用HerculaseTM的高保真度PCR的模板。通过Sanger测序分析获得的PCR产物并确认具有理论序列及BAC的相应PCR产物的序列的插入区的相同性。
间接免疫荧光分析
将24孔板(Corning Incorporated-Life Sciences,One Becton Circle,Durham,NC 27712,USA；REF 353047)中的AI-ST细胞用连续稀释于MEM中的斑块纯化的病毒感染三次。自细胞中吸出生长培养基并用250μL稀释的病毒(稀释度10-2至10-7)覆盖细胞。将细胞于37℃/5％CO2下培育1h以吸附病毒，然后移出接种物，并用1000μL MEM-Methocel/孔覆盖细胞并在37℃/5％CO2下培育2天。在显微镜下观察到斑块形成时，处理细胞用于IFA。吸出培养基并用1ml PBS(Gibco Life Technologies,Paisley PA49RF,UK,DPBS(1×)REF14190-136)/孔洗涤细胞一次。移出PBS并通过添加1ml/孔的-20℃冷乙醇(Carl RothGmbH,Schoemperlenstr.3-5,D-76185Karlsruhe,Art.Nr.5054.1)固定细胞并在RT下培育30min。吸出乙醇并将细胞风干。于RT下将细胞用1ml/孔的PBS再水合10min后，添加稀释于PBS中的一级抗体(150μl/孔)并于RT下培育1h。移出一级抗体并将细胞用1ml PBS/孔洗涤三次并保持2min，之后添加二次抗体稀释物(150μl/孔)。于RT下避光培育1h后，移出二级抗体稀释物并将细胞用1ml PBS/孔洗涤三次并保持2min且最后用500μl PBS/孔覆盖用于通过荧光显微镜术进行检查。所用抗体列示于表7中。
表7
蛋白印迹法
1.感染：通过向生长培养基中分别直接添加50μl及10μ解冻的病毒原液将6孔板中的AI-ST细胞的每一融合单层的三个孔以约1的M.O.I.用rEHV-1 RacH-SE-455-SBVGc的两种不同斑块分离株(编号121.131P6及编号121.232P6)及rEHV-1 RacH-SE1212P9的斑块分离株(自亲代空的BAC pRacH-SE1.2复活)感染。三个孔未经感染。将感染及未经感染的细胞培育2天且然后经处理用于蛋白印迹法。
2.溶解物的制备：如下制备补充有蛋白酶抑制剂混合剂(RIPA+PI)的RIPA缓冲液：将0.7ml 10×RIPA溶解缓冲液(Millipore目录号20-188)添加至6.3ml H2O(FisherScientific目录号BP2470-1)中，并将1个锭剂CompleteTM Mini蛋白酶抑制剂混合剂(Roche目录号11 836 153 001)溶解于7ml 1×RIPA缓冲液中。将未经感染的对照刮到培养基中，并将来自三个重复孔的悬浮液汇集于15ml离心管中并置于冰上。在培养基中冲洗掉感染的细胞，并将来自三个重复孔的悬浮液汇集于15ml离心管中并置于冰上。通过以1000xg 4℃离心5min使细胞沉降。小心地吸出上清液，并将细胞团粒重新悬浮于RIPA+PI中(300μl未经感染的细胞，150μl经感染的细胞)。将悬浮液在冰上培育30min并每10min涡旋。将悬浮液转移至1.5ml微量离心管中并在微量离心机中以15000rpm、4℃离心10min以使未溶解的物质沉降。将澄清的上清液转移至新的1.5ml微量离心管并储存于-80℃下直至使用。
3.SDS-PAGE及耐纶膜上的转移：材料：BioRad Criterion TGX Stain FreePrecast Gels，4-20％，26孔目录号_567-8095；Bio Rad Precision加上双重颜色标记物，目录号161-0374；Bio Rad Precision加上全蓝色标记物，目录号161-0373；Bio Rad TransBlot Turbo转移试剂盒，Midi模式目录号170-4159；Bio Rad 4x Laemmli试样缓冲液(目录号161-0747)(Bio Rad Laboratories GmbH,Heidemannstrasse 164,D-80939München)；TGS运行缓冲液(Sambrook等人)，阻断溶液1：PBST中的5％FBS(Sambrook等人)；PBST。制备试样而不添加还原剂。将试样在冰上解冻并与1体积的4×缓冲液混合，于96℃下煮沸6min，并保持于RT下直至凝胶加载。将凝胶于230mA下运行30min，且然后使用BioRadTrans Blot Turbo是统装配进行电转移。将转移设定为2,5A 25V 10min。将膜在无菌蒸馏水H2O冲洗并于4℃下与PBST中的25mL阻断溶液5％FBS一起培育30min。
抗体培育及检测
材料：Immun-Star WesternC Chemiluminecent试剂盒(Bio Rad LaboratoriesGmbH,Heidemannstrasse 164,D-80939München)目录号170-5070一级抗体：
A：SBV-Gc蛋白特异性单克隆抗体(Wernike等人，2015a)1:20B：针对EHV-1 gpII的小鼠单克隆抗体Ai2G7(Boehringer Ingelheim专有)二级抗体：过氧化酶偶联的山羊抗小鼠，(Jackson Immune Research编号115-035-146)1:5000
所有培育皆是在恒定搅拌下以足够体积进行。将抗体稀释于5％FBS/TBST中。将一级抗体于4℃下培育过夜。移出抗体溶液并将印迹用TBST洗涤三次并保持5-10mi。于RT下将稀释的二级抗体与印迹一起培育1h，移出并将印迹用TBST洗涤三次并保持5-10min。将印迹置于透明塑料片保护器上。将过氧化物及鲁米诺(Lumino)/增强子溶液以1ml+1ml混合(对于每个印迹总共2ml)，移液至印迹上并3min至5min。其后，将膜置于ChemiDocXRS成像是统(Bio Rad Laboratories GmbH,Heidemannstrasse 164,D-80939München)中并使用ImageLab软件记录信号。
病毒滴定
在感染前一天，将AI-ST细胞以2×104个细胞/孔接种于补充有10％FBS的MEM中的96孔板(Corning Incorporated-Life Sciences,One Becton Circle,Durham,NC 27712,USA；REF 353072)中。将病毒原液快速解冻并置于冰上。在MEM中制备10个连续1:10稀释物，每个稀释物体积为1.2ml。向细胞中添加100μl/孔的病毒稀释物，每个稀释物8个呈垂直一列的孔。每一板的垂直列11及12通过添加100μl/孔MEM用作培养基对照。一式三份进行滴定，并将细胞于37℃/5％CO2下培育5天。在显微镜下检查细胞培养物，并记录观察到EHV-1RacH典型CPE的孔。根据Reed及Muench(1938)的方法将效价计算为TCID50/ml。
用于疫苗接种的重组EHV-1的表征
通过蛋白印迹法及双重免疫荧光分析(DIFA)针对rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc121.232的斑块分离株显示经修饰的SBV Gc234在感染细胞中的表达。利用多克隆马-抗EHV-抗血清及单克隆抗SBV抗体的DIFA确认转基因在似乎100％rEHV-1感染细胞中表达。在实施经rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232感染的细胞的DIFA时，经马抗EHV抗血清(紫色)染色的EHV-1抗原阳性细胞亦结合针对SBV Gc的单克隆抗体。在非还原条件运行的蛋白印迹法确认经修饰的SBVGc234在经重组EHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc感染的细胞中表达。实施利用针对SBV Gc的单克隆抗体或针对EHV-1 gpII的单克隆抗体探测的经感染或未经感染细胞的溶解物的蛋白印迹法。尽管EHV-1 gpII在所有感染细胞中皆表达，但SBVGc仅在经rEHV-1RacH-SE-70-455-SBVGc感染的细胞中表达，在经空的载体rEHV-1 RacH-SE1212感染的那些细胞中不表达。在模拟感染细胞的溶解物中皆未检测到病毒蛋白。平行印迹与针对EHV-1的gpII的单克隆抗体一起培育确认在转染后重组病毒复活期间通过自我切除程序的orf71(US5)的恢复。自三次斑块纯化的分离株rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232产生的P7病毒原液在AI-ST细胞中复制至1.85×109TCID50/ml的极高效价，指示转基因的表达在此细胞系中不会损坏EHV-复制。rEHV-1RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232的六次滴定的平均值(以TCID50/ml表示)产生1.85×109TCID50/ml且标准偏差为1.28×109TCID50/ml。
动物及实验设计
将德国国内品种的4头牛用108TCID50rEHV-SBV-Gc进行两次疫苗接种，间隔3周；将额外4头牛保持为未经疫苗接种的对照。第二次免疫后3周，向所有动物皮下接种2×0.5ml仅在牛中传代的SBV野生毒株(Wernike等人，2012)。在整个研究期间中，每日测量直肠体温并由兽医师检查动物的临床体征。以每周间隔获取血清，并通过市售基于N的ELISA(ID Schmallenberg virus Competition,ID vet,France)及通过如前所述(Wernike等人，2013a)针对SBV分离株BH80/11的微中和测试进行分析。通过评估3天后的细胞病变效应进行评估；所有试样一式四份测试并根据Behrens及Kaerber将抗体效价计算为ND50。通过针对EHV毒株RacH(组rEHV-SBV-Gc及未经疫苗接种的对照动物)的微中和测试另外分析分别在免疫、攻击感染当天及在研究结束时获取的血清。
在攻击感染后前10天期间，另外每日收集血样。使用King Fisher 96Flex(ThermoScientific,Braunschweig,Germany)与MagAttract Virus Mini M48 Kit(Qiagen,Hilden,Germany)的组合根据制造商的说明书自该试样萃取病毒RNA，且通过基于S-区段的实时RT-PCR进行测试(Bilk等人，2012)。
实验方案已经由负责的国家道德委员会审查并经主管机关(State Office forAgriculture,Food Safety and Fisheries of Mecklenburg-Vorpommern,Rostock,Germany，参照LALLF M-VTSD/7221.3-1.1-004/12)批准。
临床观察及病毒RNA检测
在整个研究期间，所有动物皆不显示出任何相关SBV特异性临床体征，且在经直肠量测时，所有动物的体温皆保持在正常范围内。
自攻击感染后第1天或第2天开始，在每一未经疫苗接种的对照动物的血清试样中可检测病毒RNA达连续四天。在整个取样时段中，通过量化RT-PCR(图27A)，rEHV-SBV-Gc组的所有疫苗接种的动物皆显示降低的病毒RNA浓度。在整个取样时段中，通过量化RT-PCR(图27A)，rEHV-SBV-Gc组的两只动物经测试呈完全阴性。在经rEHV-SBV-Gc免疫的两只动物中，分别检测到降低含量的SBV基因组达3天或5天。
抗体反应
在未经疫苗接种的对照动物中，在攻击感染之前通过血清中和测试未检测到SBV特异性抗体。自感染后向前1或2周，所有未经疫苗接种的动物中皆检测到高效价的中和抗体(图27B)。
与未经疫苗接种的对照组相比，在攻击感染当天，在经rEHV-SBV-Gc免疫的四头牛中的两头中可检测到SBV特异性中和抗体。在此组的其余两只动物中，在攻击感染之前未检测到SBV特异性中和抗体，但在感染后2周，存在中和抗体(图27B)。所有四只疫苗接种的动物中SBV特异性中和抗体的效价皆低于攻击对照，指示攻击病毒的病毒复制效率较低，且因此支持量化RT-PCR数据。
EHV中和测试
在MEM中以1:5开始制备血清的两倍稀释物。将50μl含有100TCID50SBV的MEM及50μl稀释血清在96孔细胞培养板中培育2小时。此后，添加100μl新鲜制备的BHK-细胞的悬浮液(于含有10％胎牛血清的MEM中)并将培养板于37℃/5％CO2下培育3-4天。通过光学显微术评估细胞病变效应。一式两份地测试所有血清，且根据如由Behrens(个人通讯)修改的Kaerber(1931)将抗体效价计算为ND50。如图28中所示的结果指示，用rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc对牛进行疫苗接种引起载体病毒的复制效率足以诱导特异性免疫反应。在四个动物EHV-1之一中，在初次疫苗接种后3周可检测到极低效价的中和抗体(1:4)。在两次疫苗接种后，第二次施加后3周，所有四头牛皆产生1:128的效价的中和抗体。自此结果可推断出，EHV-1 RacH可能亦在牛中作为疫苗载体起作用。
实施例10
仔猪中针对猪IAV H3N2攻击的由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗的效能
为了研究由rEHV-1 RacH-SE_B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3，参见图14)及rEHV-1 RacH-SE_D(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm，参见图23)组成的四价猪IAV疫苗在年轻仔猪中作为载体疫苗的性质，在第二疫苗接种-攻击研究中对其进行测试。
在此第二研究中，将来自未经疫苗接种的母猪及在首次疫苗接种时通过使用H3特异性ELISA(图32)及通过病毒中和测试(数据未显示)经血清学测试对于猪IAV特异性抗体呈阴性的仔猪用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价疫苗进行两次疫苗接种。在动物的生命的第一周(研究第0天，SD0)进行首次疫苗接种且在其生命的第4周(研究第21天，SD21)进行第二次疫苗接种，分别是肌内接种及然后肌内接种(2×IM)、或首次鼻内接种及然后肌内接种(IN+IM)、或两次鼻内接种(2×IN)，每个疫苗毒株、每只动物及每次疫苗接种分别以2ml剂量接种1×10^7TCID50剂量。未经疫苗接种的组用作阴性对照且另一未经疫苗接种的组用作攻击对照，在生命的第7周(研究第69或70天，SD42/43)，通过2×10^7TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击毒株(欧洲野生病毒分离株R452-14，其的H3与rEHV-1 RacH-SE_B中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未经疫苗接种且未经攻击的动物用作阴性对照(neg.ctrl.)，而未经疫苗接种但经攻击的动物用作攻击对照(chall.ctrl.)。在疫苗接种时及之后及攻击之前，在不同时间点获取血样。
攻击后1天，每组的一半动物被杀死，且每只动物分别取每个左肺及每个右肺的三个肺试样。随后，以每只动物左肺及右肺的平均值测定每只动物每克肺匀浆物的感染性猪IAV效价，该左肺及右肺效价各自是自每个左肺或右肺的汇集的三个试样的匀浆物获得且分别针对左肺或右肺的该三个试样的总重量正规化。在攻击后3天，对每组的其余一半动物实施相同程序。对于所有疫苗接种的组，与攻击对照组相比，对于在攻击后第1天(CH+1)获取的试样，自组中的个别动物获得的感染性猪IAV的效价的中值在统计上显著降低，而来自阴性对照组的所有动物在其肺匀浆物中皆不显示感染性猪IAV病毒效价(图29)。此外，对于所有疫苗接种的组，与攻击对照组相比，对于在攻击后第3天(CH+3)获取的试样，自组中的个别动物获得的感染性猪IAV的效价的中值在统计上显著降低，而来自阴性对照组的所有动物在其肺匀浆物中皆不显示感染性猪IAV病毒效价(图30)。因此，分别在仔猪中经异源猪IAV H3N2毒株攻击后1天及3天，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗进行疫苗接种在统计上显著降低猪IAV肺负荷。因此，本文所述的疫苗针对猪中的猪IAV有效。
此外，通过针对与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原的猪免疫球蛋白G(IgG)特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)分析在研究第0天(SD0，在首次疫苗接种之前)、在研究第21天(SD21，在第二次疫苗接种之前)、及在研究第42或43天(SD42/43，在施加攻击材料之前)自研究动物获取的血清。尽管来自阴性对照组的血清的平均OD值于所有量测的时间点仅给出极低的值，但在两次肌内施加(2×IM；SD21及SD42/43)后、首次鼻内施加及随后肌内施加(IN+IM；SD42/43)后，及两次鼻内施加(2×IN；SD42/43)后，来自疫苗接种的组的血清展现OD值强烈增加；图32。因此，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗进行疫苗接种分别引发仔猪中针对由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3的血清学免疫反应。
另外，自研究第28天(SD28)自研究动物获取的血液纯化外周血单核细胞(PBMC)。然后将PBMC用H3N2猪IAV攻击毒株R452-14以1的感染复数(H3N2 MOI 1)再刺激，或用与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原以1μg/ml(rH3 1μg/ml)的浓度再刺激。。使用再刺激的PBMC，实施干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，且将获得的值分别正规化至10^6个细胞并计算为每组的平均值(图34)。尽管来自攻击对照组的再刺激的PBMC(用作此测试的阴性对照，动物未经疫苗接种)显示在任一再刺激后，每组的平均斑点低于45，但在任一再刺激后，分别地，两次肌内施加后来自疫苗接种的动物的再刺激的PBMC显示每组的平均斑点高于85，首次鼻内施加及随后肌内施加(IN+IM)后超过100个斑点，且两次鼻内施加(2×IN)后超过150个斑点(图34)。。因此，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗进行疫苗接种在仔猪中分别针对由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3及针对用于异源攻击病毒感染的猪IAV H3N2R452-14引发细胞免疫反应。
因此，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗对仔猪进行疫苗接种在仔猪中诱导可检测的血清学及细胞免疫反应，且通过在统计上显著降低在异源猪IAV攻击后1天及3天的肺匀浆物中的猪IAV负荷展现疫苗效能。
实施例11
具有母体来源的抗体的仔猪中针对猪IAV H3N2攻击的由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗的效能
为研究由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗在年轻仔猪中作为载体疫苗的性质，在第三疫苗接种-攻击研究中对其进行测试。
在此第三研究中，使用由母猪生产并由母猪初乳及乳液喂养的仔猪，其在怀孕期间用针对猪IAV的市售灭活的疫苗进行两次疫苗接种。在首次疫苗接种时，通过使用H3特异性ELISA(图33)及通过使用市售猪IAV特异性抗体ELISA(IDEXX Influenza A(VirusAntibody Test)IDEXX,Westbrook,Maine 04092,USA)遵循制造商的测试建议(数据未显示)，仔猪经血清学测试对于猪IAV特异性抗体呈阴性，将其用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价疫苗进行两次疫苗接种。在动物的生命的第一周(研究第0天，SD0)进行首次疫苗接种且在其生命的第4周(研究第21天，SD21)进行第二次疫苗接种，分别是肌内接种及然后肌内接种(2×IM)、或首次鼻内接种及然后肌内接种(IN+IM)、或两次鼻内接种(2×IN)，每个疫苗毒株、每只动物及每次疫苗接种分别以2ml剂量接种1×10^7TCID50剂量。未经疫苗接种的组用作阴性对照且另一经疫苗接种的组用作攻击对照。在生命的第11周(研究第69或70天，SD69/70)，通过2×10^7TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击毒株(欧洲野生病毒分离株R452-14，其的H3与rEHV-1 RacH-SE_B中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未经疫苗接种且未经攻击的动物用作阴性对照(neg.ctrl.)，而未经疫苗接种但经攻击的动物用作攻击对照(chall.ctrl.)。在疫苗接种时及之后及攻击之前，在不同时间点获取血样。
攻击后5天，杀死动物，且每只动物分别取每个左肺及每个右肺的三个肺试样。随后，以每只动物左肺及右肺的平均值测定每只动物每克肺匀浆物的感染性猪IAV效价，该左肺及右肺效价各自是自每个左肺或右肺的汇集的三个试样的匀浆物获得且分别针对左肺或右肺的该三个试样的总重量正规化。对于所有疫苗接种的组，与攻击对照组相比，对于在攻击后第5天(CH+5)获取的试样，自组中的个别动物获得的感染性猪IAV的效价的中值在统计上显著降低，而来自阴性对照组的所有动物在其肺匀浆物中皆不显示感染性猪IAV病毒效价(图31)。因此，分别在仔猪中经异源猪IAV H3N2毒株攻击后5天，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗进行疫苗接种在统计上显著降低猪IAV肺负荷。因此，本文所述的疫苗针对猪中的猪IAV有效。
此外，通过针对与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原的猪免疫球蛋白G(IgG)特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)分析在研究第0天(SD0，在首次疫苗接种之前)、在研究第21天(SD21，在第二次疫苗接种之前)、及在研究第35天(SD35，在第二次疫苗接种后2周)自研究动物获取的血清。尽管来自阴性对照组的血清的平均OD值对于SD21及SD35仅给出极低的值，但在两次肌内施加(2×IM；SD35)后、首次鼻内施加及随后肌内施加(IN+IM；SD35)后，及两次鼻内施加(2×IN；SD35)后，来自疫苗接种的组的血清展现OD值强烈增加；图33。因此，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗进行疫苗接种分别引发仔猪中针对由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3的血清学免疫反应。
另外，自研究第28天(SD28)自研究动物获取的血液纯化外周血单核细胞(PBMC)。然后将PBMC用H3N2猪IAV攻击毒株R452-14以1的感染复数(H3N2 MOI 1)再刺激，或用与由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原以1μg/ml(rH3 1μg/ml)的浓度再刺激。。使用再刺激的PBMC，实施干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，且将获得的值分别正规化至10^6个细胞并计算为每组的平均值(图35)。尽管来自攻击对照组的再刺激的PBMC(用作此测试的阴性对照，动物未经疫苗接种)显示在任一再刺激后，每组的平均斑点低于15，但在任一再刺激后，分别地，两次肌内施加后来自疫苗接种的动物的再刺激的PBMC显示每组的平均斑点高于30，首次鼻内施加及随后肌内施加(IN+IM)后超过55个斑点，且两次鼻内施加(2×IN)后超过65个斑点(图35)。。因此，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗进行疫苗接种在仔猪中分别针对由疫苗毒株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3及针对用于异源攻击病毒感染的猪IAV H3N2R452-14引发细胞免疫反应。
因此，用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗对仔猪进行疫苗接种在仔猪中诱导可检测的血清学及细胞免疫反应，且通过在统计上显著降低在异源猪IAV攻击后5天的肺匀浆物中的猪IAV负荷展现疫苗效能。
根据本发明，本文中所揭示及所主张的所有组合物及方法皆可在无需过度实验的情形下进行及执行。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施例予以阐述，但熟习此项技术者应明了，可改变该组合物及方法及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，此并不背离本发明的概念、精神及范畴。更具体而言，应明了，某些在化学及生理上均相关的试剂可替代本文所述试剂且同时可达成相同或类似结果。熟习此项技术者显而易见的所有该类似替代物及修改皆被视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明精神、范畴及概念内。
参考文献
以下参考文献在其提供对本文所阐述的那些补充的实例性程序或其他详情的程度上以引用方式具体并入本文中。
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序列表
<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司
<120> 新的EHV插入位点ORF70
<130> P01-3201 pct
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 1
gcagactttg gagcagcaca atttccggtt gtggacccca tggaccttgg tttggctggt 60
accgtggaaa ctaacgctcc ggaagttttg gccagagcaa aatacaattc gaaggtagac 120
atatggagcg ccggaatagt tctgtttgaa atgctcgcat atccatcaac tctatttgag 180
gacccgccga gtaccccaca agagtatgta aaaagctgtc attctcaact actgagaata 240
atatcaaagc taaagataaa ccctgaggag tttccacggg aaccagagtc taggctcgtg 300
cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta tccttgcttc 360
cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct agcgttcaat 420
gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat gaatctgtag 480
gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag ttgtactact 540
taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata agctgcagtt 600
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 2
agctggggga gtttgtacta tagtgtatta catgcggctt gcaataactg cctggtttat 60
gtttcgcaac attcaagcag acatgctacc gctaaacact ttgcaacaat tttttattgg 120
gtgtttggcc tttggtagaa ctgtcgcgtt tttggtggta gcatatacta ccttatttat 180
acgctccgag ctgtttttca gcatgctagc acccaacgcc gagcgagagt atataactcc 240
catcattgcc cacaagctta tgccacttat tagcgtccgc tctgccgttt gcttagtcat 300
aatatctacc gccgtttacg cagcagacgc tatctgcgac acaattggat ttgcgatacc 360
gcgcatgtgg atgtgtattt taatgagatc aacctccatg aagcgtaact agggggcctc 420
ccactgaggc actaccggct tagcagctga ctaacacagt ataaaacgtg agaagaaatc 480
agtctcatgc gccattagcg ctaggctagt tagcgtggag gaccggagcg ctaccgccag 540
cagtttcatc cgcctggtta cgggtttgtt aacacctacc ggtgttttac cgctaccata 600
<210> 3
<211> 430
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 3
tctatttgag gacccgccga gtaccccaca agagtatgta aaaagctgtc attctcaact 60
actgagaata atatcaaagc taaagataaa ccctgaggag tttccacggg aaccagagtc 120
taggctcgtg cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta 180
tccttgcttc cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct 240
agcgttcaat gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat 300
gaatctgtag gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag 360
ttgtactact taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata 420
agctgcagtt 430
<210> 4
<211> 449
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 4
ttggtggtag catatactac cttatttata cgctccgagc tgtttttcag catgctagca 60
cccaacgccg agcgagagta tataactccc atcattgccc acaagcttat gccacttatt 120
agcgtccgct ctgccgtttg cttagtcata atatctaccg ccgtttacgc agcagacgct 180
atctgcgaca caattggatt tgcgataccg cgcatgtgga tgtgtatttt aatgagatca 240
acctccatga agcgtaacta gggggcctcc cactgaggca ctaccggctt agcagctgac 300
taacacagta taaaacgtga gaagaaatca gtctcatgcg ccattagcgc taggctagtt 360
agcgtggagg accggagcgc taccgccagc agtttcatcc gcctggttac gggtttgtta 420
acacctaccg gtgttttacc gctaccata 449
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no 1130 specific for orf72
<400> 5
tgtctacctt caagcttatg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no 1131 specific for orf72
<400> 6
ctagcgcagt cgcgttg 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no. 1079 specific for mCherry
<400> 7
gcgaggagga taacatgg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no. 1080 specific for mCherry
<400> 8
acccttggtc accttcag 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1017 for the orf70
insertion region
<400> 9
aggctcgtgc gcggatacat cg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1018 for the orf70
insertion region
<400> 10
ttcggggctg ttagactcct cc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1007 for the orf1/3
insertion region
<400> 11
ccaactcgcc gccatgagac cc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1008 for the orf1/3
insertion region
<400> 12
agcgcgcccc gtacccagtg gg 22
<210> 13
<211> 417
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 13
ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60
caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120
gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180
gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240
cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgctcaa ctttaggatg 300
actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360
aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417
<210> 14
<211> 431
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 14
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180
agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240
cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat gcctgcttgg ctctaattgg 300
actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt tgtgtattaa ggtcaaaact 360
gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat agaaattacc agcgacttga 420
gtacgttgct t 431
<210> 15
<211> 417
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 15
ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60
caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120
gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180
gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240
cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgcacaa ctttaggatg 300
actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360
aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417
<210> 16
<211> 431
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 16
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180
agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240
cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat gcctgcttgg ctctaattgg 300
actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt tgtgtattaa ggtcaaaact 360
gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat agaaattacc agcgacttga 420
gtacgttgct t 431
<210> 17
<211> 283
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 17
tctagactcg agcgcaagcc ctacacgcgc tacccctgct ttcaacgcgt caacctgcac 60
attgacgggg agtttctggt tcacaagatg ctagcgttca atgccgcgat gcgcccatcg 120
gccgaggagc tgctgtcata cccaatgttt gctcaacttt aggatgacta acctgtttct 180
gggaggagac agcgtgggcg acggtgtata aagttggtct gctttcaagc cctgccactg 240
cgctacagtg ccaccaactg taaagcggta gtaagctgca gtg 283
<210> 18
<211> 144
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 18
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc taga 144
<210> 19
<211> 801
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 19
atgttgactg tcttagcagc cctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc c 801
<210> 20
<211> 801
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 20
atgttgactg tcttagcagc tctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc c 801
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<212> DNA
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tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
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<213> Artificial Sequence
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<223> Nucleotide sequence of transfer vector pU70-p455-71K71
<400> 22
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<223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH
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gttctatcac aagtgtgaca acgagtgcat ggagagcgtc aagaacggca cttacaacta 6480
cccgcgctac tctgaggaga gtaagctcaa ccgcgaagag attgacggcg tgaaactgga 6540
aagcgttggt gtccatcaga tcctggccat ctacagcacc gtggctagct ctctggttct 6600
gttggtgagc ctgggcgcta taagcttttg gatgtgttct aatgggagcc tgcagtgccg 6660
catctgcatc tgaggtac 6678
<210> 26
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 26
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Lys Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ile
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 27
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 27
Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Gly
1 5 10 15
Gln Asp Leu Pro Gly Lys Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Phe Ser Met
50 55 60
Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu Asp Gly Ala Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ser Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln
85 90 95
Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Glu Tyr Thr Ser Leu Arg Ser Leu Ile
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Asn Glu Asn Phe Asn Trp Thr
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Ser Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asn
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Lys Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Asn Thr
165 170 175
Tyr Pro Met Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Ser Asp Asp Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Arg Glu Gln Ile
195 200 205
Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Lys Ile Ile Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg
225 230 235 240
Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Met Gln Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Asp Thr Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Lys Tyr Ile Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Ile Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asn Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val
385 390 395 400
Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
405 410 415
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Arg Tyr Val Glu Asp Thr
420 425 430
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
450 455 460
Glu Lys Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ser Cys Met Glu Ser
485 490 495
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Glu Tyr Arg Asp Glu Ala Val
500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Ser Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Ala Val Trp Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
545 550 555 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 28
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 28
Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Ile Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Asn Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Asn Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Ile Glu Thr Ser Asn Ser Lys Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Glu Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Ala Thr Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Thr Thr Lys Gly Thr Thr Val Ser Cys Ser His Ser Gly Ala Asn Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Ile Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Ile Trp Gly Val His His Pro Pro Thr Asp Ser Asp Gln Gln Thr Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Asn His Thr Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr
210 215 220
Gln Arg Phe Thr Pro Glu Ile Val Ala Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln
225 230 235 240
Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Asp Gln Gly Asp Thr
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp His Ala Phe
260 265 270
Ala Leu Asn Lys Gly Ser Asn Ser Gly Ile Met Met Ser Asp Ala His
275 280 285
Val His Asn Cys Thr Thr Lys Cys Gln Thr Pro His Gly Ala Leu Lys
290 295 300
Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Ile Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Gln Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Ile Ala Ile Asp Gly Ile Ser Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ser Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Phe Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Lys Ser Gln Leu Arg Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Val Gly Val His
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 29
<211> 564
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 29
Met Lys Ala Lys Leu Leu Ile Leu Trp Cys Ala Leu Ser Ala Thr Asp
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Asn His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Ala Glu Thr Pro Asn Ala Glu Asn Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Lys His Ser
130 135 140
Ile Gly Ala Thr Ala Ser Cys Ser Lys Gln Gly Arg Ser Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro Asn Leu
165 170 175
Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asp Lys Glu Arg Glu Val Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Glu Asp Gln Arg Ala Ile Tyr Arg
195 200 205
Lys Glu Thr Ala Tyr Val Ser Val Met Ser Ser Leu Tyr Asn Arg Arg
210 215 220
Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Ile Arg Asn Gln Glu Gly
225 230 235 240
Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Lys Asp Thr Ile Ile
245 250 255
Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu
260 265 270
Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Val Ser Asn Ala Ser Met Asp
275 280 285
Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Lys Met Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile
325 330 335
Pro Ser Ile Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
355 360 365
Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln
370 375 380
Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp Lys
385 390 395 400
Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu
405 410 415
Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp
420 425 430
Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg
435 440 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Ser Leu Tyr Glu Lys Val
450 455 460
Lys Gly Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe
465 470 475 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Asp Ser Val Lys Asn
485 490 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg
500 505 510
Glu Lys Ile Asp Gly Val Glu Leu Lys Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile
515 520 525
Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser
530 535 540
Leu Gly Ala Thr Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545 550 555 560
Arg Ile Cys Ile
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GS linker
<400> 30
His Met Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Thr
<210> 31
<211> 947
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized DNA sequence of truncated glycoprotein c (Gc)
including restriction sites for subcloning
<400> 31
gcggccgcat gaaggcgatc ctggttgtgc tgctgtacac ctttgccacc gccaacgccg 60
atacgctgat caactgcaag aacatccaga gcacccagct gacaatcgag cacctgagca 120
agtgcatggc cttctaccag aacaagacca gcagccccgt cgtgatcaac gagatcatct 180
ccgacgccag cgtggacgaa caggaactga ttaagtctct gaacctgaac tgcaacgtga 240
tcgaccggtt catcagcgag tccagcgtga tcgagacaca ggtgtactac gagtatatca 300
agagccagct gtgtccactg caagtgcacg atatcttcac catcaacagc gccagcaaca 360
tccagtggaa ggccctggcc cgcagcttta ccctgggcgt gtgcaacacc aacccccaca 420
agcacatctg ccggtgcctg gaatccatgc agatgtgtac cagcaccaag accgaccacg 480
ccagagagat gagcatctac tacgacggcc accccgacag attcgagcac gacatgaaga 540
ttatcctgaa tatcatgcgg tacatcgtgc ccggcctggg cagagtgctg ctggaccaga 600
tcaagcagac caaggactac caggccctga gacacatcca gggcaagctg agccccaagt 660
cccagagcaa cctgcagctg aagggcttcc tggaattcgt ggacttcatc ctgggcgcca 720
acgtgaccat tgagaaaacc ccccagaccc tgaccaccct gagcctgatt catatgggag 780
gttccggagg tggaggttcc ggaggtggag gttccggagg tggcaccata ctggccattt 840
acagcacagt tgcgagcagc ctggtcctga tcgtgagcct gggtgctata tcattctgga 900
tgtgcagcaa cggctctctc cagtgccgca tctgtatctg aggtacc 947
<210> 32
<211> 3060
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment used for RED recombination to generate
pRacH-SE-70-455-SBVGc,
<400> 32
tctagactcg agcgcaagcc ctacacgcgc tacccctgct ttcaacgcgt caacctgcac 60
attgacgggg agtttctggt tcacaagatg ctagcgttca atgccgcgat gcgcccatcg 120
gccgaggagc tgctgtcata cccaatgttt gctcaacttt aggatgacta acctgtttct 180
gggaggagac agcgtgggcg acggtgtata aagttggtct gctttcaagc cctgccactg 240
cgctacagtg ccaccaactg taaagcggta gtaagctgca gtggtcgact ggtggtagca 300
tatactacct tatttatacg ctccgagctg tttttcagca tgctagcacc caacgccgag 360
cgagagtata taactcccat cattgcccac aagcttatgc cacttattag cgtccgctct 420
gccgtttgct tagtcataat atctaccgcc gtttacgcag cagacgctat ctgcgacaca 480
attggatttg cgataccgcg catgtggatg tgtattttaa tgagatcaac ctccatgaag 540
cgtaactagg gggcctccca ctgaggcact accggcttag cagctgacta acacagtata 600
aaacgtgaga agaaatcagt ctcatgcgcc attagcgcta ggctagttag cgtggaggac 660
cggagcgcta ccgccagcag tttcatccgc ctggttacgg gtttgttaac acctaccggt 720
gttttaccgc taccatagga tccgatccat gggcggccgc atgaaggcga tcctggttgt 780
gctgctgtac acctttgcca ccgccaacgc cgatacgctg atcaactgca agaacatcca 840
gagcacccag ctgacaatcg agcacctgag caagtgcatg gccttctacc agaacaagac 900
cagcagcccc gtcgtgatca acgagatcat ctccgacgcc agcgtggacg aacaggaact 960
gattaagtct ctgaacctga actgcaacgt gatcgaccgg ttcatcagcg agtccagcgt 1020
gatcgagaca caggtgtact acgagtatat caagagccag ctgtgtccac tgcaagtgca 1080
cgatatcttc accatcaaca gcgccagcaa catccagtgg aaggccctgg cccgcagctt 1140
taccctgggc gtgtgcaaca ccaaccccca caagcacatc tgccggtgcc tggaatccat 1200
gcagatgtgt accagcacca agaccgacca cgccagagag atgagcatct actacgacgg 1260
ccaccccgac agattcgagc acgacatgaa gattatcctg aatatcatgc ggtacatcgt 1320
gcccggcctg ggcagagtgc tgctggacca gatcaagcag accaaggact accaggccct 1380
gagacacatc cagggcaagc tgagccccaa gtcccagagc aacctgcagc tgaagggctt 1440
cctggaattc gtggacttca tcctgggcgc caacgtgacc attgagaaaa ccccccagac 1500
cctgaccacc ctgagcctga ttcatatggg aggttccgga ggtggaggtt ccggaggtgg 1560
aggttccgga ggtggcacca tactggccat ttacagcaca gttgcgagca gcctggtcct 1620
gatcgtgagc ctgggtgcta tatcattctg gatgtgcagc aacggctctc tccagtgccg 1680
catctgtatc tgaggtacca ataaacgcgg tatgtctacc ttcaagccta tgatgaacgg 1740
atgtttggtg tttgcggcta ttataacgct cttgagtttt atgctatctc tgggaacatg 1800
cgaaaattac aggcgtgtgg ttcgggatcc tagggataac agggtaatcg atttattcaa 1860
caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca 1920
tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat 1980
attcaacggg aaacgtcttg ctcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 2040
tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 2100
tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 2160
gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 2220
atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg 2280
aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 2340
ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 2400
gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 2460
agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 2520
aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 2580
cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 2640
gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 2700
cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 2760
catttgatgc tcgatgagtt tttctaaaat aaacgcggta tgtctacctt caagcctatg 2820
atgaacggat gtttggtgtt tgcggctatt ataacgctct tgagttttat gctatctctg 2880
ggaacatgcg aaaattacag gcgtgtggtt cgggatccga ccctgttggt gggtgcggtt 2940
ggactcagaa tcttggcgca ggcatggaag tttgtcggtg acgaaacata cgacaccatc 3000
cgcgcagaag caaagaattt agagacccac gtaccctcaa gtgctgcaga gtcgtctaga 3060
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
cgtgcgcgga tacatcg 17
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
cgcttcgcag gtgggc 16
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
gactggtggt agcatatac 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
gatcaacgag atcatctcc 19
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
ctggagagag ccgttgc 17

Claims (26)

1.一种表达盒，其包含
(i)至少一个所关注的外源核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列，其中该所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列可操作连接至启动子序列，和
(ii)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQID NO.:15及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、和SEQ ID NO.:17及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列，和
(iii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:14及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQ ID NO.:16及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、和SEQ ID NO.:18及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
2.一种马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，优选毒株RacH，其包含如权利要求1的表达盒。
3.一种马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，优选毒株RacH，其包含
(i)至少一个所关注的外源核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列，其中该所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列可操作连接至启动子序列，和
(ii)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQID NO.:15及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、和SEQ ID NO.:17及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列，和
(iii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:14及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、SEQ ID NO.:16及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列、和SEQ ID NO.:18及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
4.一种马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，优选毒株RacH，其包含插入ORF70中的所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列。
5.一种马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，优选毒株RacH，其包含插入ORF70中的所关注的第一核苷酸序列或基因，优选抗原编码序列，和插入第二插入位点，优选ORF1/3中的所关注的第二核苷酸序列或基因，优选另一抗原编码序列。
6.如权利要求2至5的EHV-1载体，其中该至ORF70中的插入特征在于ORF70中的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类，其中ORF71保持功能。
7.如权利要求2至6的EHV-1载体，其中该至ORF70中的插入特征在于RacH的ORF70内缺失约801bp部分(SEQ ID NO.:20)或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
8.如权利要求2至7的EHV-1载体，其中该EHV-1载体包含至少一个选自由以下组成的群的侧翼区：SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:17、和SEQ ID NO.:18及这些序列中的任一者的70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
9.如权利要求2至8的EHV-1载体，其中该EHV-1载体包含(i)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:15及SEQ ID NO.:17，和(ii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16及SEQ ID NO.:18。
10.如权利要求2至9的EHV-1载体或权利要求1的表达盒，其中该所关注的核苷酸序列，优选所关注的基因，更优选抗原编码序列是非天然存在和/或是重组的。
11.如权利要求2至10的EHV-1载体或权利要求1或10的表达盒，其中该所关注的核苷酸序列是重组的和/或异源的和/或外源的。
12.如权利要求2至11的EHV-1载体或权利要求1或10-11的表达盒，其中该抗原编码序列涉及感染产食性动物的病原体，所述产食性动物例如是猪或牛。
13.如权利要求2至12的EHV-1载体或权利要求1或10-11的表达盒，其进一步包含额外调节序列，例如终止信号或多聚腺苷酸化序列。
14.如权利要求2至13的EHV-1载体，其另外包含至少另一个所关注的核苷酸序列，优选另一个所关注的基因，更优选抗原编码序列，其任选地插入另一插入位点，例如ORF1/3中。
15.如权利要求4-14的EHV-1载体，其中该所关注的基因可操作连接至调节序列优选启动子序列，或如权利要求5至14的EHV-1载体，其中该至少两个所关注的基因可操作连接至调节序列，优选启动子序列。
16.如权利要求2-15的EHV-1载体或权利要求1或10至11或13的表达盒，其中可操作连接至该一个或两个或更多个所关注的序列或基因的启动子序列选自由以下组成的群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子、4pgG600(SEQ ID No.1)的功能片段(优选地该功能片段是p430(SEQ ID NO.:3))、4pgG600(SEQ ID No.1)的互补核苷酸序列的功能片段、4pMCP600(SEQ ID No.2)的功能片段(优选地该功能片段是p455(SEQ ID NO.:4))、4pMCP600(SEQ ID No.2)的互补核苷酸序列的功能片段。
17.如权利要求5-16的EHV-1载体，其中可操作连接至该至少两个所关注的基因的启动子序列是不同的。
18.如权利要求2-17的EHV-1载体，其中可操作连接至至少一个所关注的基因的启动子序列是p455(SEQ ID NO.4)或其功能片段或其互补核苷酸序列，且其中可操作连接至所关注的另一基因的启动子序列是p430(SEQ ID NO.3)或其功能片段或其互补核苷酸序列。
19.一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于其包含如权利要求2-18的载体。
20.一种如权利要求2-18的载体或如权利要求19的哺乳动物宿主细胞用于制造免疫原性组合物或疫苗的用途。
21.一种免疫原性组合物，其包含
a.如权利要求2至18的载体，和/或
b.由如权利要求2至18的载体表达的多肽，例如病毒、经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)等，和
c.任选的医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地该载剂适于经口、皮内、肌内或鼻内施加，
优选地该免疫原性组合物包含病毒，例如感染性病毒。
22.一种疫苗或药物组合物，其包含
a.如权利要求2至18的载体，和/或
b.由如权利要求2至18的载体表达的多肽，例如经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)等，和
c.医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地该载剂适于经口、皮内、肌内或鼻内施加，
d.任选地该疫苗进一步包含佐剂。
23.一种制备用于降低一或多种与感染相关或由感染引起的临床体征的发病率或严重程度的免疫原性组合物或疫苗的方法，该方法包含以下步骤：
a.用如权利要求2至18的载体感染如权利要求19的哺乳动物宿主细胞，
b.在适宜条件下培养所述经感染细胞，
c.收集感染的细胞培养物，
d.任选地纯化步骤c)所收集的感染的细胞培养物，
e.任选地混合所收集的感染的细胞培养物与医药上可接受的载剂。
24.如权利要求21的免疫原性组合物或如权利要求22的疫苗，其用于减轻或预防动物中由病原体感染引起的临床体征或疾病的方法中，或用于治疗或预防动物病原体感染的方法中，该动物优选是产食性动物，例如猪。
25.一种对动物进行免疫以抵抗该动物中由病原体引起的临床疾病的方法，其中所述方法包括给所述动物施用如权利要求21的免疫原性组合物或如权利要求22的疫苗，其中所述免疫原性组合物或疫苗不会引起感染的临床体征，但能诱发免疫反应，使动物针对该病原体的病原体形式产生免疫，所述动物例如产食性动物，包括猪。
26.一种用于给动物接种疫苗以对抗动物中与病原体相关的疾病和/或降低一或多种与病原体相关或由病原体引起的临床体征的发病率或严重程度的试剂盒，所述动物优选产食性动物，例如猪或牛，所述试剂盒包含：
a)能够向该动物施用疫苗的分配器；及
b)如权利要求21的免疫原性组合物或如权利要求22的疫苗，和
c)任选的插页说明书。
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