JP2021176307A - 新規なｅｈｖ挿入部位ｏｒｆ７０ - Google Patents

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Abstract

【課題】EHV-1ベクターの能力を増大させるために、本発明は、トランスジーンを挿入しこれをEHV-1ベクターバックボーンから発現する新たな代替方法を提供する。【解決手段】本発明は、（ベクター）ワクチンの分野、特に新規なEHV挿入部位ORF70に関する。本発明はさらに、関連する発現カセットおよびベクターに関し、それらは、対象とする遺伝子、特に抗原コード配列の発現に適切である。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの生産に有用である。【選択図】なし

Description

（配列表）本出願は、37 C.F.R. 1.821−1.825にしたがい配列表を含む。本出願添付の配列表は参照によってその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本発明は、（ベクター）ワクチンの分野、特に新規なEHV挿入部位ORF70に関する。本発明はさらに、関連する発現カセットおよびベクターに関し、それらは、対象とする遺伝子、特に抗原コード配列の発現に適切である。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの生産に有用である。
ウマの病原体ウマアルファヘルペスウイルス1（ウマ流産ウイルス、EHV-1）は、ヘルぺスウイルス目（Herpesvirales）のヘルペスウイルス科（Herpesviridae）のアルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のバリセロウイルス属（Varicellovirus）に属する。このウイルスは、大きくエンベロープをもつウイルスで約150,000塩基対の二本鎖DNAゲノムを有する。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトアルファヘルペスウイルス3（水痘帯状疱疹ウイルス）、ブタアルファヘルペスウイルス1（仮性狂犬病ウイルス）、ウシアルファヘルペスウイルス1（伝染性気管支炎ウイルス）、およびウマアルファヘルペスウイルス4（ウマ鼻肺炎ウイルス、EHV-4）である（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)）。EHV-1およびEHV-4は地域性流行病であり、世界中のウマが罹患する。EHV-4はほとんどの場合軽度の上気道感染を引き起こすが、一方、EHV-1は、株および宿主の免疫学的状況に応じて、呼吸器症状から流産および致死性脊髄脳症に及ぶ範囲の疾患をもたらす全身性感染を引き起こすことができる。EHV-1に対しては2つの認可された改変生ワクチン（MLV）が従来米国およびヨーロッパでそれぞれ利用可能である（RhinomuneTM（Boehringer Ingelheim）およびPrevaccinolTM（MSD））。両ワクチンは、慣行的に弱毒化されたEHV-1 RacH株を含む（弱毒化のためにブタ上皮細胞に256回継代された（Ma et al., 2013））。弱毒化のメカニズムは分子レベルで研究された。Osterriederら（1996）は、RacHはorf67の2つのゲノムコピーを欠くこと、および1つのコピーの復元が病毒性の回復に十分であることを示した。加えて、RacHは、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするorf1のコード配列の90％を超えるものを除去する1283bpの欠失を有する。他の変異もまた弱毒化に影響を与える可能性があるが、これまでのところ詳細には研究されてはいない。これらはいずれもRacHを非常に安全なワクチン株にする。なぜならば、ワクチン免疫動物での継代による病毒性への復帰はたとえそうなるとしても蓋然性は非常に低いからである。
ウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ワクチン株RacH:pRacHおよびpRacH-SEの完全なゲノムを含む大腸菌（E. coli）細菌人工染色体(BAC)の2つの変種が、ベクターワクチン開発のためのプラットフォームとして知られている。BAC pRacH-SEはpRacHに基づいて作製された（Klaus Osterriederの研究室（FU Berlin）で最初にクローン化されたBAC）。pRacHは、糖タンパク質II（gpII；Wellington et al., 1996）をコードするorf71の欠失を有する。その場所に、BACベクター配列およびGFP発現カセットが導入された。非改変EHV-1 RacHをpRacHからレスキューするためには、完全なorf71＋フランキング領域を含むプラスミドとともにpRacHを共トランスフェクトする必要があった。そのようにしてウイルス複製過程でBACベクター配列部分およびGFP発現カセットが相同組換えによりorf71によって置き換えられ、最初のRacHゲノムが復元されよう。本発明では、pRacHを改変して、BACベクター配列/GFP発現カセットが細胞培養にトランスフェクトされたときに自己切り出し可能（SE）となるようにさせた（Tischer et al., 2007）。この改善BACはpRacH-SEと称された。pRacHおよびpRacH-SEは両者ともベクターワクチン開発のためのプラットフォームとして機能することができる。両者のただ1つの相違は、pRacH-SEはorf71修復ウイルスのレスキューを顕著に促進するということである。
EHV-1 RacHベースのベクターワクチンは、いくつかの哺乳動物種（ブタ、畜牛、およびイヌを含む）で免疫を惹起することができる（Rosas et al., 2007；Rosas et al., 2008；Trapp et al., 2005；Said et al., 2013）。病原体の抗原性タンパク質をコードする遺伝子は、組換えEHV-1 RacHによって発現させることができる。EHV-1-RacHゲノムは大腸菌中のそのBAC形で操作され、通常はトランスジーン発現カセットを挿入することによって追加のタンパク質の発現のために調整される（Tischer et al., 2010）。培養パーミッシブ細胞へpRacH-SE DNAをトランスフェクトすると、EHV-1複製は細胞の転写因子によって開始される。ウイルスDNAポリメラーゼの活性は、全てのBACベクター関連配列の欠失およびEHV-1 RacHゲノムのその本来の状態への復元をもたらす。RacHとは区別できない感染性ウイルスが生成される。
pRacH-SEがトランスジーン発現カセットの挿入によって大腸菌で操作されるとき、パーミッシブ細胞へのトランスフェクション後に再構成されるウイルスは改変されており、追加の遺伝子を発現するであろう。組換えEHV-1 RacHをベクターワクチンとして用いることができる。
野生型EHV-1株は、それらのゲノムの長い固有のセグメント（配列座標1298−3614；図1）の一方の末端にorf1、orf2およびorf3と呼ばれる3つのオープンリーディングフレーム（orf）有する。Orf1およびorf3はDNAの一方の鎖に連続して並び、一方、orf2は相補鎖によってコードされる。ワクチン株RacHは、orf1およびorf2に影響を与えるその領域内に1283bpの欠失を有し、これらの遺伝子がウイルス複製に必須ではないことを示している。この理由のために、当該部位はトランスジーン挿入部位として役立つ。この挿入部位はORF1/3と呼ばれる。
しかしながら、ORF1/3挿入部位に挿入できるトランスジーンのサイズおよび数には通常限界がある。したがって、EHV-1ベクターの能力を増大させるために、トランスジーンを挿入しこれをEHV-1ベクター、特に組換えEHV-1 RacHベクターから発現する新たな代替方法が希求される。
EHV-1ベクターの能力を増大させるために、本発明は、トランスジーンを挿入しこれをEHV-1ベクターバックボーンから発現する新たな代替方法を提供する。
本発明は新たな代替トランスジーン挿入部位ORF70に関し、前記を用いてトランスジェニック配列を挿入し、トランスジェニックタンパク質をEHV-1ベクター、特に組換えEHV-1 RacHから発現することができる。
EHV-1ベクターの新規な“ORF70挿入部位”は、ORFに関して部分的欠失、切詰め、置換、改変などを特徴とする。完全なORF70の欠失はウイルス複製のために不利であり、したがってワクチン製造および有効性にとって不利であると予想されよう。なぜならば、ORF70の完全な欠失はgpIIをコードするORF71のプロモーターに影響を与えるからである。新規なORF70挿入部位および/またはORF70への（発現カセットの）挿入は、ORF71が機能的であるかまたは無傷のままであるように機能的に規定される。
具体的な特徴では、ORH70挿入部位は、RacHのORF70内に約801bpの部分（配列番号:20）またはその70％、80％、85％、90％、95％、99％相同な配列の欠失を包含する。RacHゲノム配列の欠失部分は配列番号:20として示されている（完全なRacHゲノム配列は不明であるのでヌクレオチド番号は利用できな）。別の具体的な特徴では、ORF70挿入部位は、野生型EHV-1 ab4株（Genbankアクセッション番号AY665713.1）のORF70内に理論的801bp欠失を包含する。欠失部分は、野生型ab4（Genbankアクセッション番号AY665713.1）ゲノム配列でヌクレオチド127681および128482の間（配列番号:19）に位置する。
本発明では、“フランキング領域”は、対象とする配列または遺伝子（好ましくは抗原コード配列）を含む発現カセットのEHV-1ゲノムへの組換えを指令する。これらのフランキング領域はEHV-1に天然に存在する。Up70フランキング領域（417bp、配列番号:13）およびUp71フランキング領域（431bp、配列番号:14）が、orf70部位のために用いられる全てのトランスファーベクター/プラスミドのための古典的相同組換えに選択される。野生型EHV-1 ab4株（Genbankアクセッション番号AY665713.1）では、対応する配列は、ヌクレオチド127264−127680（フランキング領域up orf70、配列番号:15）および128483−128913（フランキング領域up orf71、配列番号:16）に位置する。RED組換えのためには、フランキング領域はXbaI制限消化のために切詰められる。これらの切詰めフランキング領域は、417bpの“古典的”フランキング領域（Up70フランキング領域、配列番号:13）の3’283bpおよび431bpの“古典的”フランキング領域（Up71フランキング領域、配列番号:14）の5’144bpと同一である（それらは上記に記載されている）。これらの切詰めフランキング領域は、Up70フランキング領域（283bp）（配列番号:17として含まれる）、および、Up71フランキング領域（144bp）（配列番号:18として含まれる）と呼ばれる。これらの多様なフランキング領域は同じORF70挿入部位を示す。フランキング領域は、常に1つの“左”フランキング領域（例えば配列番号:13、15、17）および1つの“右”フランキング領域（例えば配列番号:14、16、18）のペアで用いられる。
トランスファープラスミドpU-mC70-BGH（配列番号:21）の図3、トランスファーベクターpU70-p455-71K71（配列番号:22）の図4、およびトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71（配列番号:23）の図5のプラスミド/ベクターマップは、新規なORF70挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。トランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGH（配列番号:24）の図10、およびトランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH（配列番号:25）の図11のプラスミド/ベクターマップは、ORF1/3挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。
本発明はさらに、1つのベクターバックボーンから2つの異なるトランスジーンを、2つのトランスジーンを結合することなく、1つのプロモーターの制御下でRNAウイルス由来機能（2aペプチド、IRES部位）によって発現するEHV-1ベクターに関する。
本発明はさらに、ウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、好ましくはRacHまたはRacH-SEに関し、これらのベクターは、新規なORF70挿入部位に挿入された第一の対象とする配列または遺伝子および確立された挿入部位（例えばORF1/3）に挿入された第二の対象とする配列または遺伝子を含む。加えて、本発明はさらに、他のヘルペスウイルスに基づくベクターに関し、前記ヘルペスウイルスは、特にアルファヘルペスウイルス、特にバリセロウイルスであり、前記バリセロウイルスにはウマアルファヘルペスウイルス3（EHV-3）、ウマアルファヘルペスウイルス4（EHV-4）、ウマアルファヘルペスウイルス8（EHV-8）、ウマアルファヘルペスウイルス9（EHV-9）、ウシアルファヘルペスウイルス1（BHV-1）、ウシアルファヘルペスウイルス5（BHV-5）、イヌアルファヘルペスウイルス1、およびネコアルファヘルペスウイルス1が含まれる。
本発明はさらに、そのようなベクターを含む哺乳動物宿主細胞およびそのような細胞を用いてベクターワクチンを作製する方法、並びに本発明のウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクターを含む免疫原性組成物およびワクチンに関する。
したがって、上記に記載した技術的問題の解決は特許請求の範囲の特徴を有する記述および実施態様によって達成され、種々の特徴を有する本発明は本特許請求の範囲にしたがって実行される。
これらの特性は、新規記載のORF70挿入部位から少なくとも1つの抗原を発現する、または新規記載のORF70挿入部位および別の挿入部位（例えばORF1/3）から少なくとも2つの異なる抗原を同様な有効性で並行して発現する、EHV-1 RacHに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチンの標的が2つの異なる病原体から成る場合は、確立された挿入部位（例えばORF1/3）と並行する新規なORF70挿入部位の利用は、製品のコストを顕著に削減し、1つの抗原成分のみを発現するベクターよりも明瞭な利点を提示することができる。
下記図面は本明細書の一部を構成し、本発明のある特徴をさらに明示するために含まれている。本発明は、これらの図面の1つ以上を本明細書に提示する具体的な実施態様の詳細な説明と一緒に参照することによっていっそうの理解を得ることができる。
野生型（wt）EHV-1 ab4株および弱毒化ワクチン株EHV-1 RacHのorf1/3領域を比較する模式図。 orf70挿入部位の模式図。UL＝長い固有セグメント、US＝短い固有セグメント、IR＝内部倒置リピート、TR＝末端倒置リピート、gG＝糖タンパク質G、gpII＝糖タンパク質II、orf＝オープンリーディングフレーム、bp＝塩基対。 トランスファープラスミドpU-mC70-BGHのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列。 トランスファーベクターpU70-p455-71K71のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列。 発現カセットp455-H3-71をEHV-1 RacHのorf70に挿入するためのトランスファープラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列。H3＝インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンH3をコードするオープンリーディングフレーム。71pA＝本発明の開示で述べる新規なポリA配列EM P2016-022。I-SceI＝制限エンドヌクレアーゼI-SceIのための切断部位。プロモーターaph＝原核細胞カナマイシン耐性遺伝子プロモーター。Kana＝カナマイシン耐性遺伝子。3’末端ORF70＝挿入部位の下流組換え領域。ORI＝プラスミドの複製起点。APr＝プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子。上流orf70＝挿入部位の上流組換え領域。p455＝新規なプロモーターp455。bp＝塩基対 拡大されたorf70挿入領域を有するrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3のゲノムの模式図。orf69：orf70挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム69番、p455：本明細書に記載の新規たなプロモーター（例えば実施例1参照）、H3：インフルエンザウイルスヘマグルチニントランスジーン、71pA：新規なポリアデニル化配列、Δorf70：orf71（構造的なウイルス糖タンパク質II（gpII）をコードする）のためのプロモーターを含むorf70の残余部分。 間接免疫蛍光アッセイ。rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3を感染させたVERO細胞の間接免疫蛍光アッセイ。感染後24時間の細胞をエタノールで固定し風乾した。一次抗体として市販の抗H3モノクローナル抗体および二次抗体としてFITC結合ウサギ抗マウスIgGを用い、蛍光顕微鏡法により組換えEHV-1 RacHSE-70-p455-H3感染細胞でH3が示され。 ウェスタンブロット。種々の継代のrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3またはコントロールrEHV-1 RacH-SEを感染させた細胞または模擬感染細胞のウェスタンブロット。左のブロットは、EHV-1のgpIIに対するモノクローナル抗体Ai2G7とともにインキュベートされた。右のレプリカブロットは、インフルエンザAヘマグルチニンH3（PA5-34930）に対する市販のウサギ高免疫血清とともにインキュベートされた。 ウイルス力価。チャレンジ後のワクチン接種ブタまたは非ワクチン接種ブタの肺サンプルのウイルス量を示すグラフ。Inact＝市場で利用できる不活化ワクチン。EHV＝rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3。 ウイルス力価。チャレンジ後のワクチン接種ブタまたは非ワクチン接種ブタの肺サンプルのウイルス量を示すグラフ。Inact＝市場で利用できる不活化ワクチン。EHV＝rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3。 トランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGHのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列。 発現カセットp430-H1av-BGHのEHV-1 RacHのorf1/3への挿入のためのトランスファープラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列。H1av＝インフルエンザAウイルスヘマグルチニンH1をコードするオープンリーディングフレーム、プロモーターaph＝原核細胞カナマイシン耐性遺伝子プロモーター。Kana＝カナマイシン耐性遺伝子。FlankB＝挿入部位の下流の組換え領域、FlankA＝挿入部位の上流の組換え領域、p430＝新規なプロモーターp430。bp＝塩基対 拡大されたorf1/3挿入領域を有するrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1avのゲノムの模式図。Δorf1：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム1の残余部分、p430：本明細書に記載する新規なプロモーター（例えば実施例1参照）、H1av：インフルエンザウイルスヘマグルチニントランスジーン、BGHpA：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、orf3：挿入部位の下流のオープンリーディングフレーム3。 トランスジーンの発現を示す、rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1avを感染させた細胞のウェスタンブロットおよび免疫蛍光。H1av＝rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av、SE＝rEHV-RacH-SE（コントロール）。Mock＝模擬感染細胞（コントロール） 拡大された2つの挿入領域を有するrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3（rEHV-1-RacH-SE B）のゲノムの模式図。Δorf1：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム1の残余部分、p430：新規なプロモーター、H1av：インフルエンザウイルスヘマグルチニントランスジーン、BGHpA：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、orf3：挿入部位の下流のオープンリーディングフレーム3、orf69：orf70の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム69、p455：新規なプロモーター、H3：インフルエンザウイルスヘマグルチニントランスジーン、71pA：新規なポリアデニル化配列、Δorf70：orf71（構造的ウイルス糖タンパク質II（gpII）をコードする）のプロモーターを含むorf70の残余部分。 ウェスタンブロット。rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3（B）、空ベクターrEHV-1 RacH-SE（SE）を感染させた細胞、または模擬感染細胞（ctrl）のウェスタンブロット。レプリカブロットは、H3に対する市販のウサギ高免疫血清（H3）、H1に対する市販のウサギ高免疫血清（PA5-34930）（H1）、またはEHV-1のgpIIに対するモノクローナル抗体Ai2G7（gpII）のいずれかとともにインキュベートされた。 チャレンジ前、並びにチャレンジ後1、2および3日の平均体温。誤差バーは標準偏差。各試験日の左から右に：陰性コントロールグループ（neg. ctrl）、チャレンジコントロールグループ（chall.ctrl.）、RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種（1ｘEHV-1）、RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種（2ｘEHV-1）、または不活化ブタIAVワクチンを2回接種（2ｘ殺滅）した動物。 チャレンジ後1日および3日のグループの平均肺スコア。誤差バーは標準偏差。陰性コントロールグループ（neg. ctrl）、チャレンジコントロールグループ（chall.ctrl.）、RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種（1ｘEHV-1）、RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種（2ｘEHV-1）、または不活化ブタIAVワクチンを2回接種（2ｘ殺滅）した動物。 チャレンジの日に収集したブタIAV H3チャレンジ株R452-14に対する動物血清の逆数血清中和（SN）力価。20は検出限界。陰性コントロールグループ（neg. ctrl）、チャレンジコントロールグループ（chall.ctrl.）、RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種（1ｘEHV-1）、RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種（2ｘEHV-1）、または不活化ブタIAVワクチンを2回接種（2ｘ殺滅）した動物。 ブタIAVチャレンジ適用後1日または2日で採取されたBALFのIL-1βの結果。各ドットは動物ごとに決定された値を表す。陰性コントロールグループ（neg. ctrl）、チャレンジコントロールグループ（chall.ctrl.）、RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種（1ｘEHV-1）、RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種（2ｘEHV-1）または不活化ブタIAVワクチンを2回接種（2ｘ殺滅）した動物。 2回目のワクチン接種から7日後に再刺激したPBMCのIFNγ-ELISpotの結果。（A）、非ワクチン接種コントロールグループ;（B）、不活化ブタIAVワクチンで2回ワクチン接種；（C）、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種；（D）rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種。rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回だけワクチン接種した動物については、再刺激は1回目のワクチン接種から7日後に一致する。各ドットは、与えられた時点でおよび指定の刺激による再刺激後に動物ごとに決定された値を表す。再刺激のために、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中のH3ワクチン抗原に対応する組換え発現ブタIAV HA（HA_V）、チャレンジ株R452-14のH3に対応する組換え発現IAV HA（HA_CH）、HA_VおよびHA_CH希釈のための媒体（RPMI）、空EHV-1ベクターRacH-SE（EHV-1 empty）、ワクチンRacH-SE-70-p455-H3（EHV-1-H3）、ブタIAV H3N2チャレンジ株R452-14（H3N2）、R452-14の増殖に用いた非感染細胞の細胞上清（MDCK）、または組換え発現ブタIAVヌクレオキャプシド（NP）が用いられた。 2回目のワクチン接種から7日後に再刺激したPBMCのIFNγ-ELISpotの結果。（A）、非ワクチン接種コントロールグループ;（B）、不活化ブタIAVワクチンで2回ワクチン接種；（C）、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種；（D）rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種。rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回だけワクチン接種した動物については、再刺激は1回目のワクチン接種から7日後に一致する。各ドットは、与えられた時点でおよび指定の刺激による再刺激後に動物ごとに決定された値を表す。再刺激のために、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中のH3ワクチン抗原に対応する組換え発現ブタIAV HA（HA_V）、チャレンジ株R452-14のH3に対応する組換え発現IAV HA（HA_CH）、HA_VおよびHA_CH希釈のための媒体（RPMI）、空EHV-1ベクターRacH-SE（EHV-1 empty）、ワクチンRacH-SE-70-p455-H3（EHV-1-H3）、ブタIAV H3N2チャレンジ株R452-14（H3N2）、R452-14の増殖に用いた非感染細胞の細胞上清（MDCK）、または組換え発現ブタIAVヌクレオキャプシド（NP）が用いられた。 2回目のワクチン接種から7日後に再刺激したPBMCのIFNγ-ELISpotの結果。（A）、非ワクチン接種コントロールグループ;（B）、不活化ブタIAVワクチンで2回ワクチン接種；（C）、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種；（D）rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種。rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回だけワクチン接種した動物については、再刺激は1回目のワクチン接種から7日後に一致する。各ドットは、与えられた時点でおよび指定の刺激による再刺激後に動物ごとに決定された値を表す。再刺激のために、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中のH3ワクチン抗原に対応する組換え発現ブタIAV HA（HA_V）、チャレンジ株R452-14のH3に対応する組換え発現IAV HA（HA_CH）、HA_VおよびHA_CH希釈のための媒体（RPMI）、空EHV-1ベクターRacH-SE（EHV-1 empty）、ワクチンRacH-SE-70-p455-H3（EHV-1-H3）、ブタIAV H3N2チャレンジ株R452-14（H3N2）、R452-14の増殖に用いた非感染細胞の細胞上清（MDCK）、または組換え発現ブタIAVヌクレオキャプシド（NP）が用いられた。 2回目のワクチン接種から7日後に再刺激したPBMCのIFNγ-ELISpotの結果。（A）、非ワクチン接種コントロールグループ;（B）、不活化ブタIAVワクチンで2回ワクチン接種；（C）、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回ワクチン接種；（D）rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種。rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で1回だけワクチン接種した動物については、再刺激は1回目のワクチン接種から7日後に一致する。各ドットは、与えられた時点でおよび指定の刺激による再刺激後に動物ごとに決定された値を表す。再刺激のために、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中のH3ワクチン抗原に対応する組換え発現ブタIAV HA（HA_V）、チャレンジ株R452-14のH3に対応する組換え発現IAV HA（HA_CH）、HA_VおよびHA_CH希釈のための媒体（RPMI）、空EHV-1ベクターRacH-SE（EHV-1 empty）、ワクチンRacH-SE-70-p455-H3（EHV-1-H3）、ブタIAV H3N2チャレンジ株R452-14（H3N2）、R452-14の増殖に用いた非感染細胞の細胞上清（MDCK）、または組換え発現ブタIAVヌクレオキャプシド（NP）が用いられた。 トランスファープラスミドpU1/3-p430-H1hu-BGHKBGHの模式的マップ。 トランスファープラスミドpU70-p455-H1pdm-71K71の模式的マップ。 拡張されたorf1/3およびorf70挿入領域を有するrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm（rEHV-1 RacH-SE_D）の線状二本鎖DNAゲノム。 rEHV-1 RacH-SE_B、RacH-SE_D、RacH-SEを感染させた細胞または非感染細胞（ctrl）のウェスタンブロット。レプリカブロットは、H3（PA5-34930）に対するポリクローナルウサギ高免疫血清、H1（PA5-34929）に対するポリクローナルウサギ高免疫血清、またはEHV-1糖タンパク質II（gpII）に対するモノクローナル抗体（Ai2G7）のいずれかとともにインキュベートされた。全ての抗体は予想したパターンを生じ、全ての感染サンプルにおける非常によく似たEHV-1 gpIIの染色から判定されるように、所望の抗原H3およびH1、並びに種々のウイルスの匹敵し得る複製有効性が確認された。 マウス血清のインフルエンザAウイルス中和試験の結果。*誤差バーは標準偏差を示す。 トランスファープラスミドpU70-455-SBVGc_71K71のマップ。 A）非ワクチン接種コントロール畜牛（上段パネル）およびｒEHV-SBV-Gcで2回ワクチン接種した動物（下段パネル）のSBVのウイルスゲノムの検出のための定量RT-PCRの結果。非ワクチン接種およびワクチン接種動物の各グループについて種々のタイプの線及び記号によって、個々の動物をそれぞれ識別した。動物1は黒丸を有する黒線として表される（図27Bの黒棒線に対応する）。動物2は灰色三角を有する破線として表される（図27Bの明るい灰色棒線に対応する）。動物3は白四角を有する黒い破線として表される（図27Bの白棒線に対応する）。動物4は灰色ダイヤモンドを有する灰色破線として表される（図27Bの暗い灰色棒線に対応する）。 B）非ワクチン接種コントロール畜牛（上段パネル）およびｒEHV-SBV-Gcで2回ワクチン接種した動物（下段パネル）の血清中和試験の結果。非ワクチン接種およびワクチン接種動物の各グループについて種々の棒線の色/塗りつぶし（黒から明るい灰色および暗い灰色を過ぎて白色へ）によって、個々の動物をそれぞれ識別した。動物1は黒棒線として表される（図27Aの黒丸を有する黒線に対応する）。動物2は明るい灰色棒線として表される（図27Aの灰色三角を有する灰色破線に対応する）。動物3は白棒線として表される（図27Aの白四角を有する黒破線に対応する）。動物4は暗い灰色棒線として表される（図27Aの灰色ダイヤモンドを有する灰色破線に対応する）。 EHV中和試験。対応するグループの同一動物のサンプルから得られた結果は全て同じ明暗で示される：ある動物は黒い棒線によって表され、別の動物は明るい灰色の棒線によって表され、第三の動物は白い棒線によって表され、第四の動物は暗い灰色の棒線によって表される。 チャレンジ後1日で殺した動物の肺組織1g当たりのTCID50として決定されたブタIAV肺力価。Neg. ctrl.：陰性コントロールグループ、chall.ctrl.：チャレンジコントロールグループ、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。データの点は個々の動物について得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれグループの平均を示す。上方および下方の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。グループのペアワイズ統計比較のためのp値は下に提供され、ｔ検定によって計算された。ｔ検定では、マン-ウィットニー検定及びウィンドウズソフト7.02用GraphPad Prism(商標)（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA 92037, USA）（それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用）が用いられた。 チャレンジ後3日で殺した動物の肺組織1g当たりのTCID50として決定されたブタIAV肺力価。Neg. ctrl.：陰性コントロールグループ、chall.ctrl.：チャレンジコントロールグループ、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。データの点は個々の動物について得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれグループの平均を示す。上方および下方の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。グループのペアワイズ統計比較のためのp値は下に提供され、ｔ検定によって計算された。ｔ検定では、マン-ウィットニー検定及びウィンドウズソフト7.02用GraphPad Prism(商標)（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA 92037, USA）（それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用）が用いられた。 チャレンジ後5日で殺した動物の肺組織1g当たりのTCID50として決定されたブタIAV肺力価。Neg. ctrl.：陰性コントロールグループ、chall.ctrl.：チャレンジコントロール、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。データの点は個々の動物について得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれグループの平均を示す。上方および下方の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。グループのペアワイズ統計比較のためのp値は下に提供され、ｔ検定によって計算された。ｔ検定では、マン-ウィットニー検定及びウィンドウズソフト7.02用GraphPad Prism(商標)（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA 92037, USA）（それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用）が用いられた。 組換え発現ブタIAVヘマグルチニンH3（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）に対するブタ免疫グロブリンG（IgG）に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)の結果。この試験のために、各ウェルを100ngの組換え発現H3で被覆した。サンプルをペアワイズで測定した。サンプル平均をペアワイズ測定から計算し、グループ値をサンプル平均からそれぞれ計算した。chall.ctrl.：チャレンジコントロールグループ（陰性コントロールとして機能する）、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。誤差バーは標準偏差を示す。試験日（SD）はグラフの右側の凡例に示される。 組換え発現ブタIAVヘマグルチニンH3（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）に対するブタ免疫グロブリンG（IgG）に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)の結果。この試験のために、各ウェルを100ngの組換え発現H3で被覆した。サンプルをペアワイズで測定した。サンプル平均をペアワイズ測定から計算し、グループ値をサンプル平均からそれぞれ計算した。chall.ctrl.：チャレンジコントロールグループ（陰性コントロールとして機能する）、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。誤差バーは標準偏差を示す。試験日（SD）はグラフの右側の凡例に示される。 インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（IFNγELISpot）の結果。試験28日目（SD28）に試験動物から採取した血液から末梢血単核球（PBMC）を精製した。続いてPBMCを以下のいずれかで再刺激した：感染多重度（MOI）1でH3N2ブタIAVチャレンジ株R452-14（H3N2 MOI 1）または濃度1μg/mLで組換え発現ブタIAV H3抗原（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）（rH3 1μg/mL）。再刺激PBMCを用いて、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（IFNγELISpot）を実施し、得られた値を106細胞に正規化し、それぞれグループあたりの平均として計算した。chall.ctrl.：チャレンジコントロールグループ（陰性コントロールとして機能する）、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。誤差バーは標準偏差を示す。 インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（IFNγELISpot）の結果。試験28日目（SD28）に試験動物から採取した血液から末梢血単核球（PBMC）を精製した。続いてPBMCを以下のいずれかで再刺激した：感染多重度（MOI）1でH3N2ブタIAVチャレンジ株R452-14（H3N2 MOI 1）または濃度1μg/mLで組換え発現ブタIAV H3抗原（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）（rH3 1μg/mL）。再刺激PBMCを用いて、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（IFNγELISpot）を実施し、得られた値を106細胞に正規化し、それぞれグループあたりの平均として計算した。chall.ctrl.：チャレンジコントロールグループ（陰性コントロールとして機能する）、2x IM：筋肉内に2回ワクチン接種されたグループ、IN+IM：最初に鼻内に2回目に筋肉内にワクチン接種されたグループ、2X IN：鼻内に2回ワクチン接種されたグループ。誤差バーは標準偏差を示す。
本発明は従来技術における固有の問題を解決し、最新技術における明確な進歩を提供する。
一般的には、本発明は以下を含む発現カセットを提供する：
（i）対象とする少なくとも1つの外因性ヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、前記対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が作動できるようにプロモーター配列に連結されているもの、および
（ii）配列番号:13およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:15およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:17およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの左ORF70フランキング領域、および
（iii）配列番号:14およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:16およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:18およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの右ORF70フランキング領域。
本発明はさらに、ウマヘルペスウイルス（EHV）、特にウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、より具体的にはRacH株を提供し、これらのベクターは本発明の発現カセットを含む。
本発明はウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、好ましくはRacH株を提供し、これらのベクターは本発明の発現カセットを含む。
本発明はさらに、ウマヘルペスウイルス（EHV）、特にウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、より具体的にはRacH株に関し、これらのベクターは以下を含む：
（i）対象とする少なくとも1つの外因性ヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、前記対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が作動できるようにプロモーター配列に連結されているもの、および
（ii）配列番号:13およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:15およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:17およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの左ORF70フランキング領域、および
（iii）配列番号:14およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:16およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:18およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの右ORF70フランキング領域。
本発明はさらに、ウマヘルペスウイルス（EHV）、特にウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、もっとも具体的にはRacH株に関し、これらのベクターは、ORF70に挿入された、対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む。
本発明はさらに、ウマヘルペスウイルス（EHV）、特にウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、もっとも具体的にはRacH株に関し、これらのベクターは、ORF70に挿入された、対象とする第一のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列、および第二の挿入部位（好ましくはORF1/3）に挿入された対象とする第二のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列を含む。本発明の前記EHV-1ベクターの具体的な特徴では、対象とする少なくとも2つの遺伝子は調節配列、好ましくはプロモーター配列に作動できるように連結されている。
本発明のベクターの具体的な特徴では、ORF70への挿入は、ORF70における部分的欠失、切詰め、置換、改変などを特徴とし、ORF71は機能的なままである。
本発明のベクターの別の具体的な特徴では、ORF70への挿入は、RacHのORF70内の約801bp部分（配列番号:20）またはその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列の欠失を特徴とする。
本発明のベクターの別の具体的な特徴では、ORF70への挿入は、RacHのORF70内の約801bp部分（配列番号:20）の欠失、またはその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列の任意の他の株における欠失を特徴とする。
本発明のベクターのさらに別の具体的な特徴では、ORF70への挿入は、野生型EHV-1の株ab4（Genbankアクセッション番号AY66573.1）のORF70内の約801bp部分の欠失を特徴とし、野生型ab4ゲノム配列の欠失部分は、ヌクレオチド127681および128482の間に位置するか（配列番号:19）、またはその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列である。
本発明のベクターのさらに別の具体的な特徴では、ORF70への挿入は、野生型EHV-1の株ab4（Genbankアクセッション番号AY66573.1）のORF70内の約801bp部分の欠失を特徴とし、野生型ab4ゲノム配列の欠失部分は、ヌクレオチド127681および128482の間に位置するか（配列番号:19）、またはその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列の任意の他の株における欠失である。
本発明のベクターのさらに別の具体的な特徴では、EHVベクター、特にEHV-1ベクターは、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、および配列番号:18、並びにこれらの配列のいずれか1つの70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つのフランキング領域を含む。
本発明のベクターの別の具体的な特徴では、EHVベクター、特にEHV-1ベクターは、（i）配列番号:13、配列番号:15および配列番号:17から成る群から選択される少なくとも1つの左ORF70フランキング領域、および（ii）配列番号:14、配列番号:16、および配列番号:18から成る群から選択される少なくとも1つの右ORF70フランキング領域を含む。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらに別の具体的な特徴では、対象とする前記ヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは、抗原コード配列は、天然には存在しないかおよび/または組換え体である。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の具体的な特徴では、対象とする前記ヌクレオチド配列は組換え体および/または異種および/または外因性である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらに別の具体的な特徴では、前記抗原コード配列は、食料生産動物、例えばブタおよび/または畜牛に感染する病原体と関係する。
本発明のベクターまたは発現カセットの具体的な特徴では、前記抗原コード配列はブタに感染する病原体と関係する。さらに別の具体的な特徴では、前記病原体はブタインフルエンザAウイルス（IAV）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原はヘマグルチニン（HA）抗原であり、特に前記ヘマグルチニン抗原はインフルエンザAウイルスに由来する。例えば、当該インフルエンザAウイルスは、インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)）、インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)）、インフルエンザAウイルス（A/swine/Gent/132/2005(H1N1)）、および/またはインフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/4675/2003(H1N2)）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:26、27、28および29から成る群から選択される配列番号によってコードされる配列を含むかまたはそれらから成る。別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28および配列番号:29に示すアミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそれらから成る。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の具体的な特徴では、前記抗原コード配列は畜牛に感染する病原体と関係する。さらに別の具体的な特徴では、前記病原体はシュマーレンベルクウイルス（SBV）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原はSBVのGcタンパク質（SBV-Gc）である。より具体的な特徴では、前記抗原は、SBV-Gcの切詰め型、例えばSBV-Gcのコード領域の234アミノ酸部分である。具体的な特徴では、SBV-GCのコード領域の234アミノ酸部分はSBV糖タンパク質Gcのアミノ末端に由来する。さらに別の具体的な特徴では、そのようなSBV-GCのコード領域の234アミノ酸部分は改変されて、感染細胞の形質膜への効率的輸送および挿入を達成するか（例えば、SBV-Gcの配列へのシグナルペプチドの挿入によって、および/またはSBV-Gcの配列へのトランスメンブレンアンカーペプチドの挿入によって）、および/または前記234アミノ酸部分はEHV-1での発現のためにコドン使用頻度が最適化されるか、および/またはGSリンカー（例えば配列番号:30）がGc部分およびシグナルペプチド/トランスメンブレンアンカーとの間に挿入される。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:31に示される核酸配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％同一性を有する配列によってコードされる。別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:31によってコードされる配列を含むかまたは前記配列から成る。
本発明のベクターの具体的な特徴では、対象とする遺伝子は調節配列、好ましくはプロモーター配列に作動できるように連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらに別の具体的な特徴では、前記ベクターまたは発現カセットはさらにまた、少なくとも1つのさらに別の追加の調節配列、例えば終了シグナルまたはポリアデニル化配列を含む。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の具体的な特徴では、前記ベクターまたは発現カセットはさらにまた、追加の調節配列、例えば終了シグナルおよび/またはポリアデニル化配列を含む。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらに別の具体的な特徴では、前記ベクターまたは発現カセットはさらにまた、対象とする少なくとも1つのさらに別のヌクレオチド配列、好ましくは対象とする別の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む。ある特徴では、対象とする少なくとも1つのさらに別のヌクレオチド配列、好ましくは対象とする別の遺伝子、より好ましくは、抗原コード配列は同じ挿入部位ORF70に例えばIRES/2aペプチドを介して挿入される。別の特徴では、前記ベクターまたは発現カセットは、対象とする少なくとも1つのさらに別のヌクレオチド配列、好ましくは対象とする別の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含み、これらの配列は別の挿入部位、好ましくはORF1/3に挿入される。
本発明のベクターまたは発現カセットの具体的な特徴では、対象とする少なくとも2つの遺伝子は、調節配列、好ましくはプロモーター配列に作動できるように連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらに別の特徴では、対象とする1つまたは2つまたは3つ以上の配列または遺伝子に作動できるように連結されているプロモーター配列は以下から成る群から選択される：SV40ラージT、HCMVおよびMCMV前初期遺伝子1、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、4pgG600（配列番号:1）の機能性フラグメント（好ましくは、前記機能性フラグメントはp430（配列番号:3））、4pgG600（配列番号:1）の相補性ヌクレオチド配列の機能性フラグメント、4pMCP600（配列番号:2）の機能性フラグメント（好ましくは前記機能性フラグメントはp455（配列番号:4））、4pMCP600（配列番号:2）の相補性ヌクレオチド配列の機能性フラグメント。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらに別の具体的な特徴では、対象とする少なくとも2つの遺伝子に作動できるように連結されているプロモーター配列は異なる。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の具体的な特徴では、対象とする少なくとも1つの遺伝子に作動できるように連結されているプロモーター配列は、p455（配列番号:4）またはその機能性フラグメント若しくは誘導体またはその相補性ヌクレオチド配列であり、対象とする別の遺伝子に作動できるように連結されているプロモーター配列は、p430（配列番号:3）またはその機能性フラグメント若しくは誘導体またはその相補性ヌクレオチド配列である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域を含むプラスミドに関し、好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf1/3部位であり、例えばトランスファープラスミドpU-mC70-BGH（配列番号:21）、および/またはトランスファーベクターpU70-p455-71K71（配列番号:22）、および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71（配列番号:23）、および/またはトランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGH（配列番号:24）、および/またはトランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH（配列番号:25）である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域を含むプラスミドに関し、当該標的部位は、好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf70部位である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位（好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf1/3部位である）への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域および調節核酸（好ましくはプロモーター、好ましくはp430）を含むプラスミドに関し、前記プラスミドは、例えばトランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGH（配列番号:24）、および/またはトランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH（配列番号:25）である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位（好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf70部位である）への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域および調節核酸（好ましくはプロモーター、好ましくはp455）を含むプラスミドに関し、前記プラスミドは、例えばトランスファーベクターpU70-p455-71K71（配列番号:22）、および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71（配列番号:23）である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位（好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf1/3部位である）への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域および調節核酸（好ましくはプロモーター、好ましくはp430）を含むプラスミドに関し、前記プラスミドは、例えばトランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGH（配列番号:24）、および/またはトランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH（配列番号:25）である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位（好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf1/3部位）への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域および調節核酸配列（好ましくはプロモーター、好ましくはp430）、並びに第二の調節核酸（好ましくはポリアデニル化配列、好ましくはBGHポリアデニル化配列）を含むプラスミドに関し、前記プラスミドは、例えばトランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGH（配列番号:24）、および/またはトランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH（配列番号:25）である。
本発明はさらにまた、ウイルスベクターゲノムの特異的標的部位（好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターのorf70部位）への相同性組換えまたはRED媒介組換え（ともに上記参照）のためのフランキング領域および調節核酸配列（好ましくはプロモーター、好ましくはp455）、並びに第二の調節核酸（好ましくはポリアデニル化配列、好ましくは71pAポリアデニル化配列）を含むプラスミドに関し、前記プラスミドは、例えばトランスファーベクターpU70-p455-71K71（配列番号:22）、および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71（配列番号:23）である。
本発明はさらにまた、以下の工程を含む、本発明のベクターを生産する方法に関する：
a．対象とする第一のヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、例えば抗原コード配列をORF70に挿入する工程、
b．場合によって、前記対象とする第一の遺伝子を調節核酸配列/プロモーター配列、好ましくはp455またはp430と作動できるように連結する工程、
c．場合によって、前記対象とする第一の遺伝子を（さらに別の）調節核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは71pAまたはBGHpAと作動できるように連結する工程。
具体的な特徴では、本方法はさらに以下の工程を含む：
d．対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする第二の遺伝子を第二の挿入部位、好ましくはORF1/3に挿入する工程、
e．場合によって、前記対象とする第二の遺伝子を調節核酸配列/プロモーター配列、好ましくはp455またはp430と作動できるように連結する工程、
f．場合によって、前記対象とする第一の遺伝子を調節核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは71pAまたはBGHpAと作動できるように連結する工程。
本発明はさらにまた、本発明のベクター、場合によってトランスフェクション試薬および指示冊子から成るキットに関する。
本発明はまた、本発明のベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞に関する。
本発明はさらにまた、以下の工程を特徴とする、宿主細胞を調製する方法に関する：
a．本発明の哺乳動物宿主細胞に本発明のベクターを感染させる工程、
b．当該感染細胞を適切な条件下で培養する工程、
c．場合によって前記宿主細胞を採集する工程。
本発明はさらにまた、ウマヘルペスウイルス（EHV）ベクター、特にウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、もっとも具体的にはRacH株におけるORF70の前記ウマヘルペスウイルス（EHV）ベクターの挿入部位としての使用に関し、ここで、前記挿入部位は、対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、例えば抗原コード配列の発現を支持/促進し、前記ORF70挿入部位は、部分的欠失、切詰め、置換、改変などをORF70に含み、さらにORF71は機能的なままである。
本発明はさらにまた、本発明のベクターまたは本発明の哺乳動物宿主細胞の免疫原性組成物またはワクチンの製造のための使用に関する。
本発明はさらにまた、
a．本発明のベクター、および/または
b．本発明のベクター、例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（VLP）などによって発現されるポリペプチド、および
c．場合によって医薬的または獣医的に許容できる担体または賦形剤を含む免疫原性組成物に関し、好ましくは前記担体は経口、皮内、筋肉内または鼻内適用に適切であり、好ましくは前記免疫原性組成物はウイルスである。具体的な特徴では、前記ウイルスは感染性ウイルスである。
本発明はさらにまた、
a．本発明のベクター、および/または
b．本発明のベクター、例えば、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（VLP）などによって発現されるポリペプチド、および
c．場合によって医薬的または獣医的に許容できる担体または賦形剤（好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内または鼻内適用に適切である）
を含むワクチンまたは医薬組成物に関し、
d．場合によって、前記ワクチンはさらにまたアジュバントを含む。
本発明は、本発明のベクターまたは発現カセットを用い多様な種（特にブタおよび畜牛）でワクチン免疫の成功を示す。例えば、新しく記載するORF70挿入部位で改変シュマーレンベルクウイルス（SBV）抗原を発現する、EHV-1 RacHをベースにする実験的ワクチン構築物は、畜牛で有効であることが示された（実施例9参照）。全てのワクチン接種動物は、病毒性シュマーレンベルクウイルスチャレンジ後に定量逆転写PCR（qRT-PCR）で評価したところ、ウイルス複製レベルの減少を示した。4匹のワクチン接種動物のうち2匹は完全に防御され、ウイルス複製は全サンプリング期間を通して検出されなかった。当該グループの他の2匹の動物では、SBVゲノム複製はqRT-PCRによって検出されたが、チャレンジコントロールグループよりも低いレベルで検出された（図27A）。さらにまた、非ワクチン接種コントロール動物では、チャレンジ感染前の血清中和試験でSBV特異的抗体は検出されなかった。感染後1または2週間以降に、全ての非ワクチン接種動物で中和抗体が検出できた（図27B）。非ワクチン接種コントロールグループとは対照的に、rEHV-SBV-Gcで免疫した4匹の畜牛のうち2匹でSBV特異的中和抗体がチャレンジ感染の日に検出できた。このグループの残りの2匹の動物では、チャレンジ感染前にSBV特異的中和抗体は検出されなかったが、感染後2週間から中和抗体は存在した（図27B）。4匹全ての動物でSBV特異的中和抗体はチャレンジコントロールよりも低く、チャレンジ後のウイルス複製がより強く減少したことを示している。
したがって、具体的な特徴では、前記免疫原性組成物またはワクチンまたは医薬組成物は本発明のベクターまたは発現カセットを含み、前記抗原コード配列は畜牛に感染する病原体に関する。さらに別の具体的な特徴では、前記病原体はシュマーレンベルクウイルス（SBV）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原はSBVのGcタンパク質（SBV-Gc）である。より具体的な特徴では、前記抗原はSBV-Gcの切詰め型、例えばSBV-Gcのコード領域の234アミノ酸部分である。具体的な特徴では、SBV-GCのコード領域のそのような234アミノ酸部分はSBV糖タンパク質Gcのアミノ末端に由来する。さらに別の具体的な特徴では、SBV-GCのコード領域のそのような234アミノ酸部分は改変されて、感染細胞の形質膜への効率的輸送および挿入を達成するか（例えば、SBV-Gcの配列へのシグナルペプチドの挿入によって、および/またはSBV-Gcの配列へのトランスメンブレンアンカーペプチドの挿入によって）、および/または前記234アミノ酸部分はEHV-1での発現のためにコドン使用頻度が最適化されるか、および/またはGSリンカー（例えば配列番号:30）がGc部分およびシグナルペプチド/トランスメンブレンアンカーとの間に挿入される。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:31に示される核酸配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％同一性を有する配列によってコードされる。別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:31によってコードされる配列を含むかまたは前記配列から成る。
さらにまた、別の具体的な特徴では、前記免疫原性組成物またはワクチンまたは医薬組成物は本発明のベクターまたは発現カセットを含み、前記抗原コード配列はブタに感染する病原体に関係する。さらに別の具体的な特徴では、前記病原体はブタインフルエンザAウイルス（IAV）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原はヘマグルチニン（HA）抗原であり、特に前記ヘマグルチニン抗原はインフルエンザAウイルスに由来する。例えば、当該インフルエンザAウイルスは、インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/116114/2010（H1N2））、インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/7680/2001（H3N2））、インフルエンザAウイルス（A/swine/Gent/132/2005（H1N1））、および/またはインフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/4675/2003（H1N2））である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:26、27、28および29から成る群から選択される配列番号によってコードされる配列を含むかまたはそれらから成る。別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28および配列番号:29に示すアミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそれらから成る。
本発明はさらにまた、感染に関連するかまたは感染によって引き起こされる1つ以上の臨床徴候の発生率または重篤度を軽減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：
a．本発明の哺乳動物宿主細胞に本発明のベクターを感染させる工程、
b．当該感染細胞を適切な条件下で培養する工程、
c．感染細胞培養物を収集する工程、
d．場合によって工程c）の収集感染細胞培養物を精製する工程、
e．場合によって前記収集感染細胞培養物を医薬的に許容できる担体と混合する工程。
医学的用途：
本発明はさらにまた、病原体による感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を動物で軽減若しくは予防する方法で使用される、または病原体による感染を動物で治療若しくは予防する方法で使用される本発明の免疫原性組成物またはワクチンに関し、好ましくは前記動物は、食料生産動物、例えばブタまたは畜牛、特にブタである。
本発明はさらにまた、動物、例えば食料生産動物（ブタを含む）を、前記動物で病原体によって引き起こされる臨床的疾患に対して免疫する方法に関し、前記方法は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを当該動物に投与する工程を含み、ここで、前記免疫原性組成物またはワクチンは感染の臨床的徴候を引き起こすことはできないが、前記病原体の病原型に対し当該動物を免疫する免疫応答を誘発することができる。
上記の本発明の医療的使用または上記の動物の免疫方法の具体的な特徴では、前記抗原コード配列はブタに感染する病原体と関係する。さらに別の具体的な特徴では、前記病原体はブタインフルエンザAウイルス（IAV）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原はヘマグルチニン（HA）抗原であり、特に前記ヘマグルチニン抗原はインフルエンザAウイルスに由来する。例えば、当該インフルエンザAウイルスは、インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/116114/2010（H1N2））、インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/7680/2001（H3N2））、インフルエンザAウイルス（A/swine/Gent/132/2005（H1N1））、および/またはインフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/4675/2003（H1N2））である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:26、27、28および29から成る群から選択される配列番号によってコードされる配列を含むかまたはそれらから成る。別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28および配列番号:29に示すアミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそれらから成る。
上記の本発明の医学的用途または上記の動物の免疫方法の別の具体的な特徴では、前記抗原コード配列は畜牛に感染する病原体に関する。さらに別の具体的な特徴では、前記病原体はシュマーレンベルクウイルス（SBV）である。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原はSBVのGcタンパク質（SBV-Gc）である。より具体的な特徴では、前記抗原はSBV-Gcの切詰め型、例えばSBV-Gcのコード領域の234アミノ酸部分である。具体的な特徴では、SBV-GCのコード領域のそのような234アミノ酸部分はSBV糖タンパク質Gcのアミノ末端に由来する。さらに別の具体的な特徴では、SBV-GCのコード領域のそのような234アミノ酸部分は改変されて、感染細胞の形質膜への効率的輸送および挿入を達成するか（例えば、SBV-Gcの配列へのシグナルペプチドの挿入によって、および/またはSBV-Gcの配列へのトランスメンブレンアンカーペプチドの挿入によって）、および/または前記234アミノ酸部分はEHV-1での発現のためにコドン使用頻度が最適化されるか、および/またはGSリンカー（例えば配列番号:30）がGc部分およびシグナルペプチド/トランスメンブレンアンカーとの間に挿入される。さらに別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:31に示される核酸配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％同一性を有する配列によってコードされる。別の具体的な特徴では、前記抗原は、配列番号:31によってコードされる配列を含むかまたは前記配列から成る。
本発明はまた、動物、好ましくは食料生産動物（例えばブタまたは畜牛）を動物の病原体と関係する疾患に対してワクチン免疫し、および/または動物の病原体と関係するかまたは動物の病原体によって引き起こされる1つ以上の臨床徴候の発生率または重篤度を軽減するためのキットに関し、前記キットは以下を含む：
a）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
b）本発明の免疫原性組成物またはワクチン、および
c）場合によって指示小冊子。
定義
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、出願時に本発明が属する技術分野で一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。用語の意味および範囲は明瞭であるべきであるが、しかしながら何らかの隠されたあいまいさがある場合には、本明細書で提供する定義がいずれの辞書または付帯的定義に優先する。さらにまた、文脈がそうではないことを要求しないかぎり、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。本明細書では、そうではないと明示されないかぎり、“or（または）”は“and/or（および/または）”を意味する。さらにまた、“including（含む）”という用語は、他の形（例えば“includes”および“included”）とともに制限的ではない。本明細書に引用される全ての特許および刊行物は参照によって本明細書に含まれる。
特段の指定がなければ、本発明の実施では、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、タンパク質化学および免疫学の通常的技術が利用され、前記技術は当業界内に存在する。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols.I, II and III, Second Edition, 1989；DNA Cloning, Vols.I and II, D.N.Glover ed., 1985；Oligonucleotide Synthesis, M.J.Gait ed.1984, ；Nucleic Acid Hybridization, B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984；Animal Cell Culture, R.K.Freshney ed., 1986；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984；the series, Methods In Enzymology (S.Colowick and N.Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods-a practical approach (E.L.V.Harris and S.Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定のDNA、ポリペプチド配列またはプロセスパラメーターに限定されず、したがってもちろんのこと変動し得ることは理解されるべきである。さらにまた、本明細書で用いられる用語法は本発明の特定の実施態様を説明することだけを目的とし、制限することを意図しない。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”および“the”は、文脈が明瞭にそうでないと示さない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、“an antigen（抗原）”と言えば2つ以上の抗原の混合物を含み、“an excipient（賦形剤）”と言えば2つ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
分子生物学の定義
当業界で知られているように、“ベクター”という用語は、宿主細胞に遺伝物質を伝達するために用いられる、ポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミドまたはプラスミドであり得る。本明細書で用いられるベクターは、DNAまたはRNAで構成されるかまたはそれらを含むことができる。いくつかの実施態様では、ベクターはDNAで構成される。いくつかの実施態様では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターはウイルスゲノムを含み、当該ウイルスゲノムは、細胞培養でも宿主動物においても当該ウイルスベクターの複製について機能をもたない外来遺伝子を運ぶように操作されている。本開示の具体的な特徴にしたがえば、ベクターは多様な局面、例えば遺伝物質の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクション、ワクチン（例えばDNAワクチン）としての使用、または遺伝子発現の目的のために用いることができる。遺伝子発現は、遺伝子と称される特別なポリヌクレオチド配列によって指令される、細胞におけるタンパク質の生合成を示す用語である。具体的な特徴では、ベクターは“発現ベクター”であることができ、適切な環境に存在するとき、当該ベクターによって運ばれる1つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指令することができるベクターである。
ベクターおよび発現のためにベクターを作製および/または使用する方法は、以下に開示された方法によるか、またはそれら方法に類似し得る：米国特許4,603,112号、4,769,330号、5,174,993号、5,505,941号、5,338,683号、5,494,807号、4,722,848号、5,942,235号、5,364,773号、5,762,938号、5,770,212号、5,942,235号、382,425号、PCT公開公報WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al.,米国特許4,745,051号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C.D.(Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol.3, No.12, p.2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol.4, No.3, p.406；EPA0 370 573；米国特許出願No.920,197（1986年10月16日出願）；EP特許公開公報No.265785；米国特許4,769,331号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J.Virol.65, 3068-3075, 1991；米国特許5,591,439号、5,552,143号；WO 98/00166；allowed U.S.application Ser.Nos.08/675,556および08/675,566（ともに1996年7月3日出願）（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol.3) p.237-52, 1993；Ballay et al.EMBO Journal, vol.4, p.3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J.Gen Virol.70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner et al.(1994), J.Biol.Chem.269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；および米国特許5,591,639号、5,589,466号および5,580,859号、並びにWO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors。さらにまた以下を参照されたい：WO 98/33510；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998（レンチウイルス発現系）；Sanford et al., 米国特許4,945,050号；Fischbachet al.(Intracel)；WO 90/01543；Robinson et al., Seminars in Immunology vol.9, pp.271-283, 1997（DNAベクター系）；Szoka et al., 米国特許4,394,448号（生細胞へDNAを挿入する方法）；McCormick et al., 米国特許5,677,178号（細胞変性性ウイルスの使用）；および米国特許5,928,913号（遺伝子デリバリー用ベクター）；並びに本明細書に引用される他の文書。
“ウイルスベクター”という用語は遺伝的に改変されたウイルスを指し、前記ウイルスは、宿主細胞への進入が具体的な生物学的活性（例えば当該ベクターによって運ばれるトランスジーンの発現）を生じるように、DNA技術によって操作されている。具体的な特徴では、トランスジーンは抗原である。ウイルスベクターは、標的細胞、組織または生物で複製コンピテントであることも、そうでないこともある。
ウイルスベクターの作出は、当業界で周知である任意の適切な遺伝子操作技術を用いて達成できる。前記技術には、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、DNA配列決定、細胞培養のトランスフェクションの標準的技術が含まれ（ただしこれらに限定されない）、例えば以下に記載されている：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989；またはK.Maramorosch and H.Koprowski, Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc.London, UK, 2014。
ウイルスベクターは、任意の既知生物のゲノムに由来する配列を取り込むことができる。配列はそれらの自然のままの形態で取り込むことができ、或いは所望の活性を得るように任意の態様で改変することができる。例えば、配列は挿入、欠失または置換を含むことができる。
ウイルスベクターは、対象とする2つ以上のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、対象とする第一のタンパク質のコード領域および対象とする第二のタンパク質コード領域を含むことができる。対象とする第一のタンパク質および対象とする第二のタンパク質は同じでも異なってもよい。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、対象とする第三または第四のタンパク質のコード領域を含むことができる。対象とする第三および第四のタンパク質は同じでも異なってもよい。1つのウイルスベクターによってコードされる対象とする2つ以上のタンパク質の合計長は変動し得る。例えば、2つ以上のタンパク質の合計長は、少なくとも約200アミノ酸、少なくとも約250アミノ酸、少なくとも約300アミノ酸、少なくとも約350アミノ酸、少なくとも約400アミノ酸、少なくとも約450アミノ酸、少なくとも約500アミノ酸、少なくとも約550アミノ酸、少なくとも約600アミノ酸、少なくとも約650アミノ酸、少なくとも約700アミノ酸、少なくとも約750アミノ酸、少なくとも約800アミノ酸、またはそれ以上であり得る。
好ましいウイルスベクターにはヘルペスウイルスベクターが含まれ、例えばEHV-1若しくはEHV-4、または他のバリセロウイルス類似PrV（仮性狂犬病ウイルス）またはBHV-1（ウシヘルペス1）に由来する。
本開示の具体的な特徴にしたがえば、“ウイルスベクター”或いはまた別に“ウイルス構築物”という用語は、ヘルペスウイルス科（例えばEHV-1、EHV-4）から選択されるウイルスに由来する組換えウイルス構築物を指す。好ましいウイルスベクターにはヘルペスウイルスベクターが含まれ、EHV-1またはEHV-4に由来する。
“ウイルスベクター”および“ウイルス構築物”という用語は互換的に用いることができる。
本明細書で用いられる“構築物”という用語は、組換え核酸（例えばプラスミド、BAC、または人工的に作出された組換えウイルス）を指す。
“プラスミド”という用語は、細菌宿主細胞内で細菌染色体から独立して複製する細胞質DNAを指す。本発明の具体的な特徴では、“プラスミド”および/または“トランスファープラスミド”という用語は、ウイルスベクターへ挿入される例えば発現カセットの構築のために有用な組換えDNA技術のエレメントを指す。別の具体的な特徴では、“プラスミド”という用語は、DNAワクチン免疫の目的のために有用なプラスミドを指定するために用いられ得る。
本明細書で用いられるように、“核酸”または“ポリヌクレオチド”という用語は互換的に用いられ、任意の核酸を指す。
本明細書で用いられる“核酸”、“核酸配列”、“ヌクレオチド配列”、“ポリヌクレオチド”、“ポリヌクレオチド配列”、“RNA配列”、または“DNA配列”という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド並びにそのフラグメントおよび部分、並びにゲノム起原若しくは合成起原のDNAまたはRNAを指し、一本鎖または二本鎖で、センスまたはアンチセンスを表すことができる。配列は、非コード配列、コード配列または両方の混合物であり得る。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を用いて調製することができる。
“核酸”および“ポリヌクレオチド”という用語はまた、特に5つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の他の塩基で構成される核酸を含む。
“調節核酸”、“調節エレメント”および“発現コントロールエレメント”という用語は互換的に用いられ、作動できるように連結されたコード配列を特定の宿主生物で発現させるために影響を及ぼす核酸分子を指す。これらの用語は広範囲に用いられ、転写を促進または調節する全てのエレメントをカバーする。前記エレメントには、プロモーター、プロモーター配列、RNAポリメラーゼと転写因子との基礎的相互作用のために必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントが含まれる。原核細胞の例示的な調節エレメントには、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞で用いられる調節エレメントには、転写及び翻訳制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、内部リボソーム進入部位（IRES）、ピコルナビリダル2A配列などが含まれ（ただしこれらに限定されない）、宿主細胞でコード配列の発現および/またはコードポリペプチドの生成を提供および/または調節することができる。
“内部リボソーム進入部位”または“IRES”は、IRESの5’側遺伝子から独自の翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞で単一転写物から2つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が翻訳されることを可能にする配列を指す。IRESは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のために独自のリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロン性であることができる細菌のmRNA（すなわちmRNAから連続的に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードする）と異なり、動物細胞のほとんどのmRNAはモノシストロン性であり、ただ1つのポリペプチドの合成をコードする。真核細胞ではポリシストロン性転写物により、翻訳は最5'側の翻訳開始部位から開始して最初の終止コドンで終了し、転写物はリボソームから遊離されてmRNAの第一のコードポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物で第二のまたは後続のオープンリーディングフレームに作動できるように連結されたIRESを有するポリシストロン性転写物は、その下流のオープンリーディングフレームの連続的翻訳を可能にして、同じ転写物によってコードされる2つ以上のポリペプチドを生成する。IRESは、長さに変動があり得るもので、種々の供給源（例えば脳脊髄炎ウイルス（EMCV）、ピコルナウイルス（例えば口蹄疫ウイルス（FMDV）またはポリオウイルス（PV））またはC型肝炎ウイルス（HCV））に由来し得る。多様なIRES配列およびベクター構築物におけるそれらの使用は記載されてあり、当分野では周知である。下流のコード配列は、IRESの3’末端に下流遺伝子の発現に負の影響を与えない任意の距離で作動できるように連結されている。IRESと下流遺伝子の開始部との間の最適または許容し得る距離は、距離を変動させ距離の関数として発現を測定することによって容易に決定できる。
“2a”または“2aペプチド”という用語は、リンカーとして役立つ短いオリゴヌクレオチド配列（2aおよび‘2a様’と記される）を意味し、前記リンカーは、リボソームスキッピングと定義されるプロセスによってタンパク質間の共翻訳切断を媒介することができる。そのような2aおよび‘2a様’配列（ピコルナウイルス科および他のウイルスまたは細胞性配列に由来する）を用い、複数の遺伝子配列を単一遺伝子として連鎖させ同じ細胞内でのそれらの共発現を担保することができる（Luke and Ryan, 2013）。
本明細書で用いられるように、“プロモーター”または“プロモーター配列”という用語は、RNAポリメラーゼの結合を許容し遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは遺伝子の5’非コード領域（遺伝子の転写開始部位の基部）に位置する。転写開始で機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。プロモーターの例には以下に由来するプロモーターが含まれる（ただしそれらに限定されない）：細菌、酵母、植物、ウイルス、および動物、例えば哺乳動物（ウマ、ブタ、畜牛およびヒト）、鳥類または昆虫。プロモーターは誘導性、抑制性、および/または構造性であり得る。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変化、例えば温度の変化（Ptashne, 2014）に応答してそれらプロモーターの制御下のDNAの転写レベルの増加を開始させる。当業者に周知のプロモーターの例は、例えばSV40ラージT、HCMVおよびMCMV前初期遺伝子1、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターである。
本明細書で用いられるように、本発明の文脈ではプロモーターという用語は、特に4pgG600（配列番号:1）またはその相補性ヌクレオチド配列の機能性フラグメント、例えば切詰め部を指し、好ましくは配列同一性は全長にわたって（少なくとも）72％である（またはそれより高い）。さらにまた、本明細書で用いられるように、本発明の文脈ではプロモーターという用語は、特に4pMCP600（配列番号:2）またはその相補性ヌクレオチド配列の機能性フラグメント、例えば切詰め部を指し、好ましくは、配列同一性は全長にわたって（少なくとも）78％である（またはそれより高い）。さらにまた本明細書で用いられるように、本発明の文脈ではプロモーターという用語は、特にp430（配列番号:3）若しくはp455（配列番号:4）の機能的誘導体、またはその配列同一性が70％、80％、85％、90％、95％、99％同一若しくは相同であるように、例えば小さな置換、変異若しくは倒置を有する4pgG600（配列番号:1）若しくは4pMCP600（配列番号:2）を指す。
“p430”、“gG430”および“430”という用語は同義語としておよび互換的に本明細書、図、配列表などを通して用いられる。“p455”、“MCP455”および“455”という用語は同義語としておよび互換的に本明細書、図、配列表などを通して用いられる。
“エンハンサー”という用語は、cis配置でプロモーターの活性に影響を及ぼし、したがってこのプロモーターに機能的に接続される遺伝子またはコード配列の転写を刺激するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの影響は位置および向きとは無関係で、エンハンサーはしたがって、転写ユニットの前若しくは後ろにイントロン内にまたはコード領域内にすら配置され得る。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近傍およびプロモーターから相当な距離の両方に配置され得る。プロモーターとの物理的および機能的オーバーラップを有することもまた可能である。当業者は、多様な供給源に由来する多数のエンハンサー（およびデータバンク（例えばGenBank）に寄託された、例えばSV40エンハンサー、CMVエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）を承知していよう。それらエンハンサーは、独立したエレメントとしてまたはポリヌクレオチド配列内のクローン化エレメントとして利用可能である（例えばATCCに寄託されているか、または市場および個人的供給源から得られる）。多数のプロモーター配列はまたエンハンサー配列を含む（例えばしばしば用いられるCMVプロモーター）。ヒトCMVエンハンサーはこれまでに同定されたもっとも強力なエンハンサーの1つである。誘導性エンハンサーの一例はメタロチオネインエンハンサーであり、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激できる。
“相補性ヌクレオチド配列”という用語は、ポリヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）の2本の対を成す鎖の一方の鎖を指す。相補鎖のヌクレオチド配列はその対を成す鎖のヌクレオチド配列を反映し、したがって各アデノシンに対しヌクレオチド配列はチミン（RNAについてはウラシル）を含み、各グアニンに対してシトシンを含み、逆もまた然りである。例えば、5’-GCATAC-3’の相補性ヌクレオチド配列は3’-CGTATG-5’であり、RNAについては3’-CGUAUG-5’である。
本明細書で用いられる“遺伝子”、“対象とする遺伝子”という用語は同じ意味を有し、対象とする生成物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子はさらにまた、コード配列に先行する（5’非コードまたは非翻訳配列）および後続する（3’非コードまたは非翻訳配列）調節配列を含むことができる。選択される配列は、完全長または切詰められた遺伝子でも融合またはタグ付き遺伝子であってもよく、さらにcDNA、ゲノムDNA、またはDNAフラグメントであってもよい。ポリペプチドまたはRNAをコードするゲノムDNAは非コード領域（すなわちイントロン）を含み得ることは一般的に理解されている。前記領域は成熟メッセンジャーRNAからスプライスされ、したがって同じポリペプチドまたはRNAをコードするcDNAには存在しない。遺伝子は、自然のままの配列（すなわち天然に存在する形態）であってもよく、または変異誘導されることも若しくは異なる供給源に由来する配列を含むこともまたは所望にしたがって改変されることもできる。これらの改変には、選択される宿主細胞でコドン使用頻度を最適化するためのコドン最適化またはタグ付加が含まれる。さらにまた、ほんの少しであるが制限的ではない例を挙げれば、改変には以下の除去または付加が含まれ得る：cis作動性部位、例えば（隠れた）スプライスドナー、アクセプター部位およびブランチポイント、ポリアデニル化シグナル、TATAボックス、カイ部位、リボソーム進入部位、リピート配列、二次構造（例えばステムループ）、転写因子または他の調節因子のための結合部位、制限酵素部位など。選択される配列は、分泌性、細胞質性、核内、膜結合または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
本明細書で用いられる“対象とするヌクレオチド配列”という用語は対象とする遺伝子よりもさらに概括的な用語である。なぜならば、前記用語は必ずしも遺伝子を含まないが、エレメントまたは遺伝子の部分または他の遺伝情報、例えばori（複製起点）を含むことができるからである。対象とするヌクレオチド配列は、それがコード配列を含むか否かに無関係に任意のDNAまたはRNA配列であり得る。
“オープンリーディングフレーム”または“ORF”は、翻訳開始シグナルまたは開始コドン（例えばATGまたはAUG）および終止コドンを含み、潜在的にポリペプチド配列に翻訳されることができるある長さの核酸配列（DNAまたはRNA）を指す。
“転写”という用語は細胞でのmRNAの生合成を指す。
本明細書で用いられる“発現”という用語は、宿主細胞内での核酸配列の転写および/または翻訳を指す。本発明の具体的な特徴にしたがえば、“発現”という用語は、宿主細胞内での異種および/または外因性核酸配列の転写および/または翻訳を指す。宿主細胞における所望される生成物の発現レベルは、細胞に存在する対応するRNA若しくはmRNAの量、または選択配列によってコードされる所望のポリペプチドの量を基準にして決定できる。例えば、選択配列から転写されるmRNAは、ノザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼRNA防御、細胞RNAへのin situハイブリダイゼーションまたはRTqPCR（逆転写とその後の定量的PCR）によって定量できる。選択配列から発現されるタンパク質は、多様な方法によって、例えばELISA、ウェスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ、免疫沈澱、タンパク質の生物学的活性のためのアッセイ、またはタンパク質の免疫染色とその後のFACS分析によって定量できる。
“発現カセット”または“転写ユニット”または“発現ユニット”という用語は、転写されるべき1つ以上の遺伝子を含むベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を規定し、ここで転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、発現カセット内に含まれる調節エレメントを含むポリヌクレオチド配列と同様に作動できるように互いに連結されている。それらはプロモーターから転写され、転写は少なくとも1つのポリアデニル化シグナルによって終了する。ある具体的な特徴では、それらは1つの単一プロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子がとにかく転写的に連結されている。2つ以上のタンパク質または生成物が各転写ユニットから転写され発現され得る（マルチシストロン転写ユニット）。各転写ユニットは、ユニット内に含まれる選択された配列のいずれかの転写及び翻訳に必要な調節エレメントを含むであろう。さらに各転写ユニットは同じまたは異なる調節エレメントを含むことができる。例えば、各転写ユニットは同じターミネーターを含むことができ、IRESエレメントまたはイントロンを転写ユニット内の遺伝子の機能的な連結のために用いることができる。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は2つ以上の転写ユニットを含むことができる。
“増加した発現”、“増加した力価または生産性”または“改善発現または生産性”という用語は、宿主細胞に導入された異種および/または外因性配列（例えば治療タンパク質をコードする遺伝子）の発現、合成または分泌の増加を意味し、適切なコントロールを用いて、例えばcDNAによってコードされるタンパク質対イントロン含有遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて比較される。本発明の細胞が本明細書に記載の方法にしたがって培養され、この細胞が指定の生産性または力価について少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、または5倍の増加を示すならば、力価または生産性の増加があるとする。さらにまた、本発明の細胞が本明細書に記載の方法にしたがって培養され、この細胞が指定の生産性または力価について少なくとも1.2倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、または少なくとも3倍の増加を示すならば、力価または生産性の増加があるとする。さらにまた本発明の細胞が本明細書に記載の方法にしたがって培養され、この細胞が指定の生産性または力価で少なくとも1.2倍から5倍、好ましくは1.5倍から5倍、より好ましくは2倍から5倍、特に好ましくは3倍から5倍の増加を示すならば、特に力価または生産性の増加があるとする。“増加した発現”は、より多くの細胞が対象とする遺伝子/配列を実際に発現していることを同様に意味することができる。例えば、増加した発現は、本発明の新規なプロモーターが、ウイルス複製周期の間に他のプロモーターと比較してより長期間にわたって活性であることを意味することができる。
増加した発現、力価、または生産性は、本発明の異種ベクターを用いることによって得ることができる。これは、他のアプローチ、例えば組換え宿主細胞のFACS支援選別と組合わせることができる（組換え宿主細胞は、追加の選別可能マーカーとして1つ以上の蛍光タンパク質（例えばGFP）または細胞表面マーカーを含む）。増加した発現を得る他の方法および用いることができる種々の方法の組合せは例えば以下に基づく：染色体構造物（例えばLCR、UCOE、EASE、アイソレーター、S/MARs、STARエレメント）の操作のためにcis-作動性エレメントの使用、（人口）転写因子の使用、内因性または異種および/または外因性遺伝子発現をアップレギュレートさせる天然または合成薬剤による細胞の処理、mRNAまたはタンパク質の安定性（半減期）の改善、mRNA翻訳開始の改善、エピソームプラスミドの使用による遺伝子用量の増加（複製起点としてウイルス配列（例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、EBVまたはBPV）を使用することによる）、増幅促進配列またはDNAコンカテマー系in vitro増幅系の使用。
“増加した発現”を測定するアッセイは、LC-MS/MS系タンパク質測定、例えばマルチ反応モニタリング（MRM）；抗体による検出方法、例えばウェスタンブロット、ドットブロットまたは免疫拡散およびフローサイトメトリー；ヘマグルチニンアッセイによる生物学的活性の測定である。
“プロモーター活性”は、対応するプロモーターの制御下で転写されるmRNAの定量によって間接的に測定される。mRNAは内因性標準物と比較するRTqPCRによって定量される。
“ウイルス力価”という用語は、ウイルス調製物の単位体積当たりの感染ユニットの測定値である。ウイルス力価は生物学的手順のエンドポイントであり、並行して実施される試験の一定の割合が効果を示す希釈と定義される（Reed and Muench, 1983）。特に1ミリリットル当たりの組織培養感染用量50（TCID50/mL）はウイルス調製物の希釈を提供し、その希釈において、並行して接種される当該希釈の細胞培養の数の50％が感染性である。
“転写調節エレメント”は通常、発現されるべき遺伝子配列、転写開始および終了部位並びにポリアデニル化シグナルの上流にプロモーターを含む。
“転写開始部位”という用語は、一次転写物（すなわちmRNA前駆体）に取り込まれる最初の核酸に一致する構築物中の核酸を指す。転写開始部位はプロモーター配列とオーバーラップすることがある。
“終了シグナル”若しくは“ターミネーター”または“ポリアデニル化シグナル”若しくは“ポリA”または“転写終了部位”もしくは“転写終了エレメント”は、真核細胞のmRNAの3’末端の特異的部位での切断、および約100−200アデニンヌクレオチド（ポリAテール）配列の当該切断3’末端への転写後取り込みを引き起こし、したがってRNAポリメラーゼに転写を終了させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは、当該切断部位の約10−30ヌクレオチド上流に配列AATAAAおよび下流に位置する配列を含む。多様なポリアデニル化エレメント、例えばtkポリA、SV40後期および初期ポリA、BGHポリA（例えば以下に記載されている：U.S.Pat.No.5,122,458）またはハムスター成長ホルモンポリA（WO2010010107）が公知である。
“翻訳調節エレメント”は、翻訳されるべき個々のポリペプチドの各々のための翻訳開始部位（AUG）、終止コドンおよびポリAシグナルを含む。内部リボソーム進入部位（IRES）はいくつかの構築物に含まれ得る。発現を最適化するために、発現されるべき核酸配列の5’-および/または3’-非翻訳領域の除去、付加または改変を実施して、一切の潜在的に余分で不適切であるまた別の翻訳開始コドンまたは転写または翻訳レベルで発現に干渉し得る若しくは発現を減少させ得る他の配列を除去することが助言され得る。コンセンサスリボソーム結合部位（Kozak配列）を開始コドンのすぐ上流に挿入して、翻訳（したがって発現）を強化することができる。このリボソーム結合部位周辺のA/U含有量増加はより効率的なリボソーム結合部位を提供する。
定義によれば、宿主細胞に挿入される全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれらによってコードされる対応するタンパク質またはRNAは、それらが異なる（ウイルス）種に由来するとき、宿主細胞に対して“外因性”、“外因性配列”、“外因性遺伝子”、“外因性コード配列”と称される。したがって、本発明のEHV-4系プロモーターはEHV-1ウイルスベクターからみれば外因性である。対象とする配列または遺伝子、例えば抗原に関して本明細書で用いられるように、“外因性”という用語は、対象とする前記配列または遺伝子、特に前記抗原がその天然の種との関係を外れて発現されることを意味する。したがって、ブタIAVのH3抗原はEHV-1ベクターに対して外因性抗原の一例である（実施例3参照）。対象とする任意の非ウマ配列、例えば非ウマ抗原のような対象遺伝子は、したがって本発明の具体的な特徴にしたがえば、外因性の配列、対象遺伝子または抗原である。
定義によれば、宿主細胞に挿入される全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれらによってコードされる対応するタンパク質またはRNAは、宿主細胞に対して“異種”、“異種配列”、“異種遺伝子”、“異種コード配列”、“トランスジーン”または“異種タンパク質”と称される。これは、導入されるべき配列または導入されるべき遺伝子が、宿主細胞の内因性配列または内因性遺伝子と同一であっても適用される。例えば、EHV-4野生型ウイルスの場合とは異なる部位にまたは改変された形態でEHV-4ウイルスベクターに導入されるEHV-4プロモーター配列は定義によれば異種配列である。対象とする配列または遺伝子、例えば抗原に関して本明細書で用いられるように、“異種”という用語は、対象とする配列または遺伝子、特に抗原がその天然の亜種の関係を無視して発現されることを意味する。したがって、対象とする任意の非EHV-1特異的配列または遺伝子（例えば抗原）、例えばEHV-1を除く任意のウマアルファウイルス、例えばEVH-3、EVH-8由来の抗原は、したがって、本発明の具体的な特徴にしたがえば異種の配列または対象遺伝子または抗原である。
“天然に存在しない”という用語は、本状況では天然に存在しない、対象とする任意の配列若しくは遺伝子（例えば抗原）、例えばハイブリッド配列または異なる種に由来する対象とする配列若しくは遺伝子（例えば抗原）、または人工的な変異、挿入、欠失などのために天然の生成物ではない、対象とする配列若しくは遺伝子（例えば抗原）を意味する。
“組換え体”という用語は、本発明の明細書を通して“天然に存在しない”、“異種”および“外因性”という用語と互換的に用いられる。したがって、“組換え体”タンパク質は、異種または外因性ポリヌクレオチド配列から発現されるタンパク質である。ウイルスに関して用いられる組換え体という用語は、ウイルスゲノムの人工的操作によって生成されるウイルスを意味する。異種または外因性配列、例えば外因性抗原コード配列を含むウイルスは組換えウイルスである。組換えウイルスという用語および天然に存在しないウイルスという用語は互換的に用いられる。
“異種ベクター”という用語は、異種または外因性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。“組換えベクター”という用語は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
本明細書で用いられるように、“作動できるように連結されている”という用語は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との間の接続を示す。典型的には、遺伝子発現は、1つ以上の調節エレメント（例えば構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーであるが、ただしこれらに限定されない）の制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、調節エレメントと“作動できるように連結”または“作動的に連結”または“作動的に結合”されると称され、これは、当該遺伝子またはコード領域が調節エレメントによって制御または影響されることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現を達成するならば、当該プロモーターはコード配列に作動できるように連結されている。
さらにまた、本開示の範囲内では、“機能的に連結する”、“機能的に連結されている”または“作動できるように連結されている”という用語は、2つ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらの意図ーする態様で機能することを可能にするように配置されることを意味する。例えば、プロモーター/エンハンサーまたはターミネーターが、cis位にある連結遺伝子配列の転写を制御または調整できるならば、それは当該コード遺伝子配列に機能的に連結されている。一般的には（ただし必ずしもというわけではないが）、機能的に連結された複数のDNA配列は連続的であり、必要な場合には2つのポリペプチドコード領域を結合させるためにまたは分泌シグナルペプチドの場合には連続的でありかつリーディングフレーム内にある。しかしながら、作動できるように連結されたプロモーターは一般的にコード配列の上流に位置し、または作動できるように連結されたターミネーターは一般的にコード領域の下流に位置するというが、それがコード領域と必ずしも連続的であるというわけではない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加させるかぎり連続的である必要はない。これについては、それらはコード配列の上流または下流にさらにはある程度離れても配置され得る。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列からポリアデニル化シグナルまで進行するようにコード配列の3'末端に配置されるならば、当該コード配列に作動できるように連結されている。連結は、当業界で公知の組換え体の方法によって、例えば適切な制限部位または平滑端での連結によって、または融合PCR方法論を用いることによって達成される。適切な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターを通常的作業にしたがって用いることができる。
したがって、プロモーター配列の“機能的フラグメント”または“機能的誘導体”という用語は、当該フラグメントまたは誘導体がなおプロモーター活性を達成することを意味する。プロモーター活性を評価するための機能的アッセイは当業者には周知である（Bustin, 2000；Nolan et al., 2006）。そのような機能的アッセイの例示的実施態様には例えばプロモーター動態実験が含まれる。発現カセット（プロモーターまたはそのフラグメントがレポーター遺伝子の転写を指令する）を運ぶベクターウイルスを感染させた細胞を種々の時間インキュベートする。感染後種々の時間で収集したサンプルから全RNAを調製する。夾雑DNAのDNAse Iによる破壊後に、RNAを逆転写する。1つのレプリカサンプルを逆転写酵素（RT）の添加により処理し、第二のレプリカをRTの添加無しに処理して当該RNA調製物から夾雑DNAが首尾よく除去されたことを提示する。得られたcDNAを精製し、通常的PCRの鋳型として用いる。RTを用いて処理したサンプルのみがPCR生成物を生じるであろう。続いて、レポータートランスジーンのためのプライマーおよび並行してウイルスベクターの必須遺伝子（内部標準遺伝子）のためのプライマーとともに、これらのcDNAをqPCRのために用いることができる（内部標準遺伝子の転写は感染および複製の効率のための内部標準を提供する）。レポーターのqPCR値は、内部標準遺伝子のqPCR値を用いて種々の構築物および感染後時間の間で正規化される。これは種々のプロモーターおよびそのフラグメントのプロモーター活性の解釈を可能にする。
本明細書で用いられる“配列相同性”は2つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、2つ以上の配列を最適にアラインメントし、必要ならばギャップを導入する。しかしながら、“配列同一性”とは対照的に、配列相同性を決定するときには保存的アミノ酸置換が一致として数えられる。
換言すれば、参照配列と95％の配列相同性を有する類似のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの85％、好ましくは90％、91％、92％、93％、94％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％、99.9％が一致するか、または別のアミノ酸またはヌクレオチドによる保存的置換を含む必要がある。また別には、参照配列中の15％まで、好ましくは10％、9％、8％、7％、6％まで、より好ましくは5％、4％、3％、2％、1％、0.1％までの数のアミノ酸またはヌクレオチド（保存的置換を含まない）が参照配列に挿入され得る。好ましくは、ホモローグ配列は、少なくとも一続きが50、より好ましくは100、さらに好ましくは250、さらに好ましくは500ヌクレオチドを含む。
当業界で知られる“配列同一性”という用語は、2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち参照配列と当該参照配列と比較されるべき与えられた配列との間の関係を指す。配列同一性は、配列を最適にアラインメントして最高度の配列類似性を生じた後で（そのような配列鎖間の一致によって決定される）、当該与えられた配列を当該参照配列と比較することによって決定される。そのようなアラインメントに際しては、配列同一性は1つの位置ごとに確認される。例えば、ある特定の位置でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であるならば、当該配列は当該位置で“同一”である。そのような位置の総数を参照配列のヌクレオチドまたは残基の総数で割って％配列同一性が与えられる。配列同一性は公知の方法によって容易に計算できる。当該方法は、以下に記載された方法であるが、ただしこれらに限定されない：Computational Molecular Biology, Lesk, A.N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M.Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J.Applied Math., 48: 1073 (1988)（これらの文献の教示は参照により本明細書に含まれる）。配列同一性を決定するために好ましい方法は、試験される配列の最大一致をもたらすように設計される。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公開コンピュータプログラムで体系化されている。そのようなプログラムの例には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387, 1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Altschul, S.F.et al., J.Molec.Biol., 215:403-410, 1990）。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他の供給源（BLAST Manual, Altschul, S.et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S.F.et al., J.Molec.Biol., 215:403-410, 1990（その教示は参照により本明細書に含まれる））から公開されている。これらのプログラムは、デフォルトギャップ重を用いて配列を最適にアラインメントし、与えられた配列および参照配列間の最高レベルの配列同一性をもたらす。例示すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば85％、好ましくは90％、91％、92％、93％、94％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％、99.9％“配列同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、当該与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、当該与えられたポリヌクレオチド配列は当該参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドに付き15まで、好ましくは10まで、より好ましくは5までの点変異を含み得るという点を除いて当該参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも85％、好ましくは90％、91％、92％、93％、94％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％、99.9％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、参照配列のヌクレオチドの15％まで、好ましくは10％、9％、8％、7％、6％、より好ましくは5％、4％、3％、2％、1％、0.1％までが欠失または別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列の全ヌクレオチドの15％まで、好ましくは10％、9％、8％、7％、6％、より好ましくは5％、4％、3％、2％、1％、0.1％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’若しくは3’末端の位置またはそれら末端の間にある任意の位置に、参照配列中のヌクレオチドの間に単独でまたは参照配列内に1つ以上の連続する群として散らばって存在し得る。同様に、参照アミノ酸配列と少なくとも例えば85％、好ましくは90％、91％、92％、93％、94％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％、99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、当該与えられたポリペプチドのアミノ酸配列は、当該与えられたポリペプチド配列は当該参照アミノ酸配列の各100アミノ酸に付き15まで、好ましくは10、9、8、7、6まで、より好ましくは5、4、3、2、1までのアミノ酸変異を含み得るという点を除いて当該参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも85％、好ましくは90％、91％、92％、93％、94％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％、99％同一性を有する与えられたポリペプチド配列得るために、参照配列のアミノ酸残基の15％まで、好ましくは10％、9％、8％、7％、より好ましくは5％、4％、3％、2％、1％までが欠失または別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列のアミノ酸残基の総数の15％まで、好ましくは10％、9％、8％、7％、より好ましくは5％、4％、3％、2％、1％までの数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端の位置またはそれら末端の間にある任意の位置に、参照配列中の残基の間に単独でまたは参照配列内に1つ以上の連続する群として散らばって存在し得る。好ましくは、同一ではない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって相違する。しかしながら、配列同一性を決定するとき、保存的置換は一致として含まれない。
“配列同一性”または“パーセント同一性”という用語は本明細書では互換的に用いられる。本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な比較のためにアラインメントするということが規定される（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために、第一のアミノ酸または核酸の配列にギャップを導入することができる）。続いて、対応するアミノ酸またはヌクレオチド位置のアミノ酸またはヌクレオチド残基が比較される。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチド残基と同じものによって占められているとき、当該分子は当該位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、当該配列によって共有される同一である位置の数の関数である。（すなわち、％同一性＝同一である位置の数／位置の総数（すなわちオーバーラップする位置）ｘ100）。好ましくは、2つの配列は同じ長さである。
配列比較は、比較される2つの配列の全長にわたってまたは2つのフラグメントにわたって実施される。典型的には、比較は、比較される2つの配列の全長にわたって実施されるであろう。しかしながら、配列同一性は、例えば20、50、100またはそれ以上の連続するアミノ酸残基の領域にわたって実施できる。
当業者は、2つの配列間の相同性の決定のためにいくつかの異なるコンピュータプログラムを利用できるという事実を承知しているであろう。例えば、2つの配列間の配列比較およびパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて達成できる。好ましい実施態様では、2つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、ニードルマンとワンシュのアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.(48):444-453, 1970）を用いて決定され（前記アルゴリズムはAccelrys GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに取り込まれている（以下で利用できる：http://www.accelrys.com/products/gcg/））、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、並びにギャップ重16、14、12、10、8、6または4および長さ重1、2、3、4、5または6を用いる。当業者は、これらの異なるパラグラフのいずれもわずかに相違する結果をもたらすが、2つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを用いたときに有意には変化しないことを理解するであろう。
本発明のタンパク質配列または核酸配列はさらにまた、公開データベースに対する検索を実施するために“問い合わせ”配列として用いられ、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定できる。そのような検索は、BLASTNおよびBLASTPプログラム（バージョン2.0）（Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10）を用いて実施できる。BLASTタンパク質検索は、BLASTPプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて実施され、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を入手できる。比較の目的のためにギャップ付加アラインメントを得るために、ギャップ付加BLASTをAltschulらが記載したように利用することができる（Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res.25(17): 3389-3402）。BLASTおよびギャップ付加BLASTプログラムを利用するとき、対応するプログラム（例えばBLASTPおよびBLASTN）のデフォルトパラメーターを用いることができる。以下のホームページを参照されたい：National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
EHV-1およびEHV-4/組換えベクターの技術的定義
“ウマ類（equid）”または“ウマ類の（equine）”または“ウマ（equin）”という用語はウマ科を意味するかまたはウマ科に属することを意味する。ウマ科にはウマ、ロバ、およびシマウマ、好ましくはウマが含まれる。加えて、“ウマ類”または“ウマ類の”または“ウマ”という用語はまたウマ科のメンバーの雑種（例えばラバ、ケッテイなど）を包含する。
“ヘルペスウイルス”または“ヘルペスウイルスベクター”は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
“ウマヘルペスウイルスベクター”または“ウマヘルペスウイルス”または“EHV”という用語は、ウマに感染するヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。今日までに8つの異なる種のウマヘルペスウイルスが同定され、5つはアルファヘルペスウイルス亜科に属し（EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9）、3つはガンマヘルペスウイルス亜科に属する（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)）。
“EHV-1”という用語はウマアルファヘルペスウイルス1を意味し、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバーである。EHV-1の比限定的参考配列は、例えば野生型EHV-1のab4株（Genbankアクセッション番号AY665713.1）またはRacH株（Hubert 1996）である。
“EHV-4”という用語はウマアルファヘルペスウイルス4を意味し、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバーである。
“ORF70に挿入された”という用語は、DNAフラグメントが、ウマアルファヘルペスウイルス1のオープンリーディングフレーム70をコードする位置でゲノムDNAに挿入されたことを意味する。本発明の具体的な特徴では、言及の挿入は、ORF70の5’塩基対801の欠失をもたらし、3’末端の残りの423bpを無傷で残留させるがORF70遺伝子生成物の糖タンパク質Gの発現を停止させた。EHV-1を含むいくつかのアルファヘルペスウイルスの糖タンパク質Gは感染細胞から分泌され、炎症促進サイトカインと結合することによって免疫調節タンパク質として機能することが示された。ウイルスベクターにおけるその発現の停止は、無傷の糖タンパク質G発現を示す野生型と比較してウイルス感染の免疫原性を増加させるはずである。
“ORF1/3に挿入された”という用語は、ワクチン株EHV-1 RacHの弱毒化工程時の継代で偶然に欠失することによって、ORF1の90％および全ORF2を含む1283bpフラグメントが失われた位置でDNAフラグメントがウイルスゲノムへ挿入されたことを意味する。この挿入部位は、この場所からのトランスジーンの発現がウイルス複製を妨げる可能性が極めて低いことが予想されるので選択された。
ワクチンの定義
“免疫原性または免疫学的組成物”は、組成物に対し細胞性または抗体媒介免疫応答の免疫学的応答を宿主で引き起こす、少なくとも1つの抗原またはその免疫原性部分を含む物質組成物を指す。
本明細書で用いられる“抗原”という用語は当業界ではよく理解され、免疫原性である物質（すなわち免疫原）とともに、免疫学的不応答性（またはアネルギー、すなわち外来物質に対する身体の防御メカニズムによる反応の欠如）を誘発する物質を含む。本明細書で用いられるように“抗原”という用語は、完全な長さのタンパク質とともにエピトープを収納または含むそのペプチドフラグメントを意味することが意図される。
“食料生産動物”という用語は、人間の消費のために用いられる動物、例えばブタ、畜牛、家禽、魚類などを意味する。好ましくは、食料生産動物はブタおよび畜牛、もっとも好ましくはブタを意味する。
本明細書で用いられる“免疫原性組成物”は、本明細書に記載の免疫学的応答を引き起こすポリペプチドまたはタンパク質（例えばウイルス表面タンパク質）を指すことができる。“免疫原性フラグメント”または“免疫原性部分”という用語は、1つ以上のエピトープを含み、したがって本明細書に記載の免疫学的応答を引き起こす、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントまたは切詰めおよび/または置換形を指す。一般的には、そのような切詰めおよび/または置換形またはフラグメントは、完全長タンパク質に由来する連続する少なくとも6つのアミノ酸を含むであろう。そのようなフラグメントは、当業界で周知の多くのエピトープマッピング技術を用いて同定できる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。例えば、線状エピトープは、固体支持体で多数のペプチド（当該ペプチドはタンパク質分子の部分に一致する）を同時に合成し、当該ペプチドを支持体に結合させたままで抗体と当該ペプチドを反応させることによって決定され得る。そのような技術は当業界で公知であり記載されている。例えば以下を参照されたい：米国特許4,708,871号；Geysen et al.(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；およびGeysen et al.(1986) Molec.Immunol.23:709-715。同様に、立体エピトープは、例えばx線結晶学および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間配座を決定することによって容易に同定される。上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい。合成抗原もまた本定義に含まれる（例えばポリペプチド、フランキングエピトープ、および他の組換え体または合成により誘導される抗原）。例えば以下を参照されたい：Bergmann et al.(1993) Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann et al.(1996), J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier, A.(1997), Immunol.and Cell Biol.75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998（前記文献の教示および内容は参照により本明細書に含まれる）。
本明細書で用いられる“ワクチン”という用語は、動物で免疫学的応答を誘発する少なくとも1つの免疫学的に活性な成分、および可能ではあるが必然的ではない、前記活性成分の免疫学的活性を強化する1つ以上の追加の成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらに別の成分を追加的に含むことができる。弁別すれば、ワクチンの免疫学的に活性な成分は以下のどちらかの完全なウイルス粒子を含むことができる：いわゆる改変生ワクチン（MLV）としてそれらの本来の形若しくは弱毒化粒子として、またはいわゆる死滅ワクチン（KV）として適切な方法で不活化された粒子。別の形態では、ワクチンの免疫学的に活性な成分は生物の適切なエレメントを含むことができ（サブユニットワクチン）、したがって、これらのエレメントは以下によって生成される：粒子全体またはそのような粒子を含む増殖培地を破壊し、さらに場合によって所望の構造物を得るその後の精製工程；または適切な系（例えば細菌、昆虫、哺乳動物または他の種をベースにする）の使用による適切な操作を含む合成プロセスおよび場合によってその後の単離および精製工程；または適切な医薬組成物を用いる遺伝物質の直接取り込みによる、ワクチンを必要とする動物での合成プロセスの誘発（ポリヌクレオチドワクチン免疫）。ワクチンは、上記に記載のエレメントの1つまたは同時に2つ以上を含むことができる。本発明の具体的な特徴で用いられるように、“ワクチン”は生ワクチンまたは生ウイルス（組換えワクチンとも呼ばれる）を指す。本発明の別の具体的な特徴では、“ワクチン”は不活化または死滅ウイルス（ウイルス様粒子（VLP）を含む）を指す。したがって、ワクチンはサブユニットワクチンまたは死滅（KV）若しくは不活化ワクチンであり得る。
“感染多重度（MOI）”という用語は、ウイルス調製物で細胞当たりどれほど多くの感染ユニット（例えばTCID50）が培養細胞の感染に用いられるかを示す。例えば0.001のMOIは、培養容器中の100細胞毎に1感染ユニットが接種されることを意味する。
“DNAワクチン免疫”または“ポリヌクレオチドワクチン免疫”という用語は、適切な医薬組成物を用いる遺伝物質の直接接種を意味する。
多様な物理的および化学的不活化方法が当業界では公知である。“不活化”という用語は、（紫外線（UV）、X-線、電子ビームまたはガンマ線）照射、加熱または化学処理を実施して、以前には病毒性または非病毒性であったウイルスまたは細菌を不活化または死滅させ、一方その免疫原性を保持するウイルスまたは細菌を指す。適切な不活化剤には、ベータプロピオラクトン、バイナリー-若しくはベータ-若しくはアセチル-エチレンイミン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）が含まれる。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活化のために、ホルムアルデヒドは典型的には水およびメチルアルコールと混合され、ホルマリンが生成される。メチルアルコールの添加は、不活化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。ある実施態様は、ホルムアルデヒドの38％溶液の約0.1から1％を用いてウイルスまたは細菌を不活化する。ホルマリンの量を調整して、材料は不活化されるが高投与量による副作用はそれほど生じないことを担保することが重要である。
より具体的には、ウイルスとの関係で“不活化された”という用語は、ウイルスがin vivoまたはin vitroでそれぞれ複製できないことを意味し、細菌との関係で“不活化された”という用語は、細菌がin vitroまたはin vivoで再生できないことを意味する。例えば、“不活化された”という用語は、以前にin vitroで増殖し、続いてもはや複製できないように化学的または物理的手段を用いて不活化されたウイルスを指すことができる。別の例では、“不活化された”という用語は、以前に増殖し、続いて化学的または物理的手段を用いて不活化され、細菌、細菌のフラグメントまたは成分の懸濁物を生じた、例えばワクチンの成分として用いることができるバクテリンを生じた細菌を指す。
本明細書で用いられるように、“不活化”、“殺滅”または“KV”は互換的に用いられる。
“生ワクチン”という用語は、生きている生物または複製コンピテントウイルスまたはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
“医薬組成物”は、本質的には、それが投与される生物、または当該生物の内部若しくは表面で生存する生物の生理学的な（例えば免疫学的な）機能を改変することができる1つ以上の成分から成る。当該用語には、抗生物質または抗寄生動物薬とともに一定の他の目的を達成するために一般的に用いられる他の成分が含まれ（ただしこれらに限定されない）、当該他の目的には、例えば処理特性、無菌性、安定性、経腸または非経口ルート（例えば経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内または他の適切なルート）による組成物の投与の実現可能性、投与後の耐性または制御放出特性が含まれる（ただしこれらに限定されない）。そのような医薬組成物のある非限定的な例（もっぱら提示目的のために提供される）は以下のように調製し得る：感染細胞培養の細胞培養上清を安定化剤（例えばスペルミジンおよび/またはウシ血清アルブミン（BSA））と混合し、当該混合物を続いて水溶液（例えば食塩水、リン酸緩衝食塩水（PBS））または非水溶液（例えばオイルエマルジョン、アルミニウム系アジュバント）中で再水和する。
本明細書で用いられるように、“医薬的または獣医的に許容できる担体”には、任意のかつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌および抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。いくつかの好ましい実施態様、特に凍結乾燥された免疫原性組成物を含む実施態様では、本発明で使用される安定化剤は、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定化剤を含む。
いくつかの実施態様では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含む。本明細書で用いられる“アジュバント”には以下が含まれ得る：水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン。エマルジョンは特に以下を基剤とする：形質流動パラフィン油（欧州薬局方タイプ）；イソプレノイド油、例えばスクアランまたはスクアレン；アルケン（特にイソブテンまたはデセン）のオリゴマー化から生じる油；酸または直鎖アルキル基を含むアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ-(カプリレート/カプレート)またはプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。油は乳化剤と組合わせて用いられエマルジョンを生成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタン、マンニド（例えば無水マンニトールオレエート）、グリコール、ポリグリセロールプロピレングリコールのエステルおよびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステル（場合によってエトキシル化される）、並びにポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、具体的にはプルロニック（Pluronic）の製品、特にL121である。以下を参照されたい：Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D.E.S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94, 1995；およびTodd et al., Vaccine 15:564-570, 1997。例示的なアジュバントは、SPTエマルジョン（下記の147ページに記載（"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M.Powell and M.Newman, Plenum Press, 1995）およびエマルジョンMF59（同書の183ページに記載）である。
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸若しくはメタクリル酸のポリマー並びに無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有益なアジュバント化合物はアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーであり、それらは特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマー（Phameuropa Vol.8, No.2, June 1996）という呼称で知られている。当業者はまた、ポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリル酸ポリマーを記載する米国特許2,909,462号を参照することができる。前記ポリヒドロキシル化化合物は少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8つを超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子は少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられる。好ましいラジカルは、2つから4つの炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルはそれ自体他の置換基、例えばメチルを含むことができる。CARBOPOL(商標)（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売される製品が特に適切である。それらは、アリルシュクロースまたはアリルペンタエリトリトールで架橋される。とりわけカルボポル974P、934Pおよび971Pを挙げることができる。CARBOPOL(商標)971Pがもっとも好ましい。無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーにはとりわけコポリマーEMA（Monsanto）があり、これは無水マレイン酸およびエチレンのコポリマーである。これらのポリマーの水への溶解は酸性溶液を生じ、前記を好ましくは生理学的pHに中和してアジュバント溶液が得られる。前記アジュバント溶液に免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物自体が取り込まれるであろう。
さらに別の適切なアジュバントには多くの中でとりわけ以下が含まれる(ただしそれらに限定されない)：RIBIアジュバント系（Ribi Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、アビリジン脂質-アミンアジュバント、大腸菌の易熱性エンテロトキシン(組換え体またはそれ以外)、コレラトキシン、IMS 1314若しくはムラミルジペプチド、または天然に存在するか若しくは組換え体サイトカインまたはそのアナローグ、または内因性サイトカイン放出刺激物質。
アジュバントは、一用量当たり約100μgから約10mgの量で、好ましくは一用量当たり約100μgから約10mgで、より好ましくは一用量当たり約500μgから約5mgの量で、さらに好ましくは一用量当たり約750μgから約2.5mgの量で、もっとも好ましくは一用量当たり約1mgの量で添加できると予想される。また別には、アジュバントは、最終製品の体積で約0.01から50％の濃度、好ましくは約2％から30％の濃度、より好ましくは約5％から25％の濃度、さらに好ましくは約7％から22％の濃度、もっとも好ましくは10％から20％の濃度であり得る。
“希釈剤”には水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースがとりわけ含まれ得る。安定化剤にはアルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩がとりわけ含まれる。
“単離”されているとは、その天然の状態から“人間の手によって”変更されたことを意味する。すなわち、それが天然に存在するならば、それが変化したかまたは本来の環境から取り出されたかまたはその両方である。例えば、生きている生物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは“単離されて”いないが、その天然の状態で共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、当該用語が本明細書で用いられるように“単離されて”いる。
“弱毒化”は病原体の病毒性を減少させることを意味する。本発明では、“弱毒化”は“非病毒性”と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、病毒性が減少させられ、したがって感染の臨床徴候を引き起こさないが、標的動物で免疫応答を誘発できるウイルスであり、また、弱毒化ウイルス(特に特許請求項に記載のEHV-1 RacHウイルスベクター)に感染した動物では、非弱毒化ウイルスまたは病原体に感染し弱毒化ウイルスを投与されていない動物の“コントロールグループ”と比較して、当該臨床徴候が発生率または重篤度において軽減されることを意味し得る。この関係では、“減少する/減少させられる”という用語は、上記に規定のコントロールグループと比較して、少なくとも10％、好ましくは25％、さらに好ましくは50％、さらに好ましくは60％、さらに好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらに好ましくは90％、もっとも好ましくは100％の減少を意味する。したがって、弱毒化、非病毒性病原体、例えば請求項に記載の弱毒化ウイルスベクター、特にEHV-1(好ましくはRacH)ウイルスベクターが、改変生ワクチン（MLV)または改変生免疫原性組成物の生成に適切である。
本明細書では、“有効用量”は、抗原を投与された動物で臨床的症状の軽減をもたらす免疫応答を引き起こすまたは引き起こすことができる、抗原の量（ただしこれに限定されない）を意味する。
本明細書で用いられるように、組成物の関係で“有効量”という用語は、動物で感染の発生を軽減しまたは重篤度を緩和しまたは疾患の発生を軽減する、免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は用量当たりのコロニー形成単位（CFU）を指す。また別に、治療の関係では、“有効量”という用語は、疾患若しくは異常またはその1つ以上の症状の重篤度または期間を軽減若しくは緩和する、疾患若しくは異常の進行を防ぐ、疾患若しくは異常の回復を引き起こす、疾患若しくは異常に関連する1つ以上の症状の再発、悪化、開始または進行を防ぐ、または予防或いは別の治療方法若しくは治療薬による治療を強化するか若しくは改善するために十分である、治療方法の量を指す。
“免疫応答”または“免疫学的応答”は、対象とする（免疫原性）組成物またはワクチンに対する細胞性および/または抗体媒介免疫応答の発達を意味する（ただしこれらに限定されない）。通常、免疫または免疫学的応答には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：対象とする組成物またはワクチンに含まれる1つの抗原または複数の抗原に特異的に向けられる、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、および/または細胞傷害性T細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的（メモリー）応答を示し、したがって新たな感染に対する耐性は強化されおよび/または疾患の重篤度は軽減されるであろう。そのような防御は、症状の数の減少、症状の重篤度の軽減または当該病原体の感染に関連する1つ以上の症状の欠如、ウイルス血症の開始の遅延、ウイルス存続の軽減、全体的なウイルス量の減少、および/またはウイルス排出減少によって示されるであろう。
“疾患に対する防御”、“防御免疫”、“機能的免疫”、“臨床症状の軽減”、“中和抗体および/または血清転換の誘発/生成”および類似の語句は、本発明の1つ以上の治療組成物またはその組み合わせの投与によって生じる、疾患または症状に対する部分的または完全な応答を意味し、前記応答は、疾患または感染に暴露された非免疫動物で予想されるよりも少ない有害作用をもたらす。すなわち、当該感染の有害作用の重篤度はワクチン接種動物で軽減される。ワクチン接種動物では、感染は軽減され、感染速度は遅く、または完全に防御されることがある。完全な予防が意図される場合には、それは具体的に表明される。完全な予防が表明されない場合、前記用語は部分的予防を含む。
本明細書では、“臨床徴候の発生率および/または重篤度の軽減”または“臨床症状の軽減”は、野生型感染と比較して、グループ内の感染動物の数の減少、感染の臨床徴候を示す対象動物の数の減少または消滅、または1匹以上の対象動物に存在する任意の臨床徴候の重篤度の軽減を意味する（ただしこれらに限定されない）。例えば、これらの用語は、病原体量、病原体排出のいずれかの減少、病原体伝播の軽減、またはマラリアに典型的な任意の臨床徴候の軽減を指すはずである。好ましくは、これらの臨床徴候は、本発明の治療組成物を投与されず感染に至った対象動物と比較して、当該組成物を投与された1匹以上の対象動物で少なくとも10％軽減される。より好ましくは、臨床徴候は、本発明の組成物を投与された対象動物で少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％軽減する。
本明細書の“増加した防御”という用語は、ワクチン接種動物グループ対非ワクチン接種コントロール動物グループにおける、感染因子による感染に関連する1つ以上の臨床症状の統計的に有意な軽減を意味する（ただしこれらに限定されない）。“臨床症状の統計的に有意な軽減”という用語は、ワクチン接種動物グループの少なくとも1つの臨床症状の発生頻度が、感染因子チャレンジ後の非ワクチン接種コントロールグループの頻度より少なくとも10％、好ましくは20％、より好ましくは30％、さらに好ましくは50％、さらに好ましくは70％低いことを意味する（ただしこれらに限定されない）。
“長期持続防御”は、少なくとも3週間、より好ましくは少なくとも3か月、さらに好ましくは少なくとも6か月持続する“改善された有効性”を指す。家畜の場合、長期持続防御は、動物が肉のために出荷される平均齢まで持続することがもっとも好ましい。
ウイルスによって誘発される“ウイルス血症の軽減”という用語は動物の血流に進入するウイルスの減少を意味する（ただしこれらに限定されない）。ここで、ウイルス血症レベル、すなわち血清1mL当たりのウイルスDNAまたはRNAコピー数または血清1デシリットル当たりのプラーク形成コロニー数は、本発明の組成物を投与されず感染に至る可能性がある動物と比較して、当該組成物を投与された動物の血清で少なくとも50％減少する。より好ましくは、ウイルス血症レベルは、本発明の組成物を投与された動物で少なくとも90％、好ましくは少なくとも99.9％、より好ましくは少なくとも99.99％、さらに好ましくは少なくとも99.999％減少する。
本明細書で用いられるように、“ウイルス血症”という用語は、特に、ウイルス粒子が再生産されおよび/または動物（特に哺乳動物、鳥類または昆虫）の血流で循環する状態と理解される。
“安全性”は、ワクチン接種動物でワクチン接種後に不利な結果が存在しないことを指し、前記にはウイルス系ワクチンの病毒性への潜在的復帰、臨床的に有意な副作用、例えば持続的全身的な不健康またはワクチン接種部位の許容不能な炎症が含まれる（ただしこれらに限定されない）。
本明細書で用いられる“ワクチン免疫”または“ワクチン免疫する”またはその変形は、本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する（ただしこれらに限定されない）。前記組成物は、動物に投与されたとき、前記動物で免疫応答を直接的または間接的に引き起こしまたは引き起こすことができる。
本発明の関係で、“死亡率”は感染によって引き起こされる死を指し、感染が非常に重篤であり、苦痛を防ぎその生命を人為的に終結させるために安楽死させる状況が含まれる。
処方物
組成物が投与される対象動物は、好ましくは以下を含む（ただしそれらに限定されない）動物である：畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えばニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット。もっとも好ましくは、哺乳動物はブタである。
本発明の処方物は、免疫有効量の1つ以上の免疫原性組成物および生理学的に許容できるベヒクルを含む。ワクチンは、免疫有効量の1つ以上の免疫原性組成物および生理学的に許容できるベヒクルを含む。処方物は投与態様に適しているべきである。
所望される場合には、免疫原性組成物はまた、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むことができる。免疫原性組成物は、液体溶液、懸濁物、乳剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方物、または散剤であり得る。経口処方物は、標準的な担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
治療方法
好ましい投与ルートには鼻内、経口、皮内および筋肉内が含まれるが、ただしこれらに限定されない。飲水への投与（もっとも好ましく一用量）が所望され得る。本発明の組成物はまた1、2、またはそれより多い用量で、或いは他の投与ルートで投与できることは当業者には理解されよう。例えば、そのような他のルートには皮下、皮内、腹腔内、皮内が含まれ、さらに所望される治療の期間および有効性に応じて、本発明の組成物は、1回若しくは数回または断続的に（例えば毎日数日間、数週間または数か月）、種々の投薬量で（特に生ウイルス/生ワクチンのためには例えば約103から108 TCID50（上記ウイルス力価参照））投与され得る。
所望される場合、組成物は、活性成分を含む1つ以上のユニット投薬形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置で提供される。例えば、パックは金属またはプラスチックフォイル（例えばブリスターパック）を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は投与のため（好ましくは哺乳動物（特にブタ）への投与のため）の指示を含むことができる。そのような容器に添えて、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指定された書式の通知を入れることができ、前記通知は、人間の投与について製造、使用または販売規制庁による承認を反映する。
配列概要
以下の配列をこれにより本発明で詳述し開示する：
プロモーター：
配列番号:1 EHV-4 600bpデオキシリボ核酸配列4pgG600
配列番号:2 EHV-4 600bpデオキシリボ核酸配列4pMCP600
配列番号:3 EHV-4 430bpデオキシリボ核酸配列pG430
配列番号:4 EHV-4 449bpデオキシリボ核酸配列p455
配列番号:5 orf72特異的プライマーNo.1130
配列番号:6 orf72特異的プライマーNo.1131
配列番号:7 mCherry特異的プライマーNo.1079
配列番号:8 mCherry特異的プライマーNo.1080
挿入部位：
配列番号:9 orf70挿入領域のための人工配列核酸PCRプライマー1017
配列番号:10 orf70挿入領域のための人工配列核酸PCRプライマー1018
配列番号:11 orf1/3挿入領域のための人工配列核酸PCRプライマー1007
配列番号:12 orf1/3挿入領域のための人工配列核酸PCRプライマー1008
配列番号:13 左（Up70）フランキング領域（417bp）
配列番号:14 右（Up71）フランキング領域（431bp）
配列番号:15 野生型EHV-1のab4株（Genbankアクセッション番号AY665713.1）の左（up orf70）フランキング領域、ヌクレオチド127264−127680に位置する
配列番号:16 野生型EHV-1のab4株（Genbankアクセッション番号AY665713.1）の右（up orf71）フランキング領域、ヌクレオチド128484−128913に位置する
配列番号:17 RED系の切詰めフランキング領域：左（Up70）フランキング領域（283bp）＝417bp“古典的”フランキング領域の3’283bpと同一
配列番号:18 RED系の切詰めフランキング領域：右（Up71）フランキング領域（144bp）＝431bp“古典的”フランキング領域の5’144bpと同一
配列番号:19 野生型ab4（Genbankアクセッション番号AY665713.1）ゲノム配列の欠失部分、nt 127681−128482
配列番号:20 RacHゲノム配列の欠失部分（完全なゲノム配列が不明のためヌクレオチド番号は利用不可）
プラスミド/ベクター配列：
配列番号:21 トランスファープラスミドpU-mC70-BGHのヌクレオチド配列
配列番号:22 トランスファーベクターpU70-p455-71K71のヌクレオチド配列
配列番号:23 トランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71のヌクレオチド配列
配列番号:24 トランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGHのヌクレオチド配列
配列番号:25 トランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGHのヌクレオチド配列
ヘマグルチニン配列：
配列番号:26 ヘマグルチニン［インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/116114/2010（H1N2））］GenBank：ADR01746.1 H1pdm
配列番号:27 ヘマグルチニン［インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/7680/2001（H3N2））］GenBank：ABS50302.2 H3:
配列番号:28 ヘマグルチニン［インフルエンザAウイルス（A/swine/Gent/132/2005（H1N1））］GenBank：AFR76623.1 H1av:
配列番号:29 ヘマグルチニン［インフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/4675/2003（H1N2））］GenBank：ADK98476.1* H1hu
* アミノ酸531（X、終止コドン）は発明者らによりIに変更されたことに留意されたい。
SBV構築物配列：
配列番号:30 GSリンカー配列
配列番号:31 サブクローニング用制限部位を含む合成DNA配列
配列番号:32 pRacH-SE-70-455-SBVGc製作のためにRED組換えに用いられるDNAフラグメント
配列番号:33 up70 Fプライマー
配列番号:34 up71 Rプライマー
配列番号:35 seq455-F1プライマー
配列番号:36 SBV Gc F1プライマー
配列番号:37 SBV Gc R1プライマー
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を提示するために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施で良好に機能することが本発明者らによって見出された技術であり、したがって本発明の実施のために好ましい態様を構成すると考えられることは当業者には理解されよう。しかしながら、本開示に照らせば、開示される具体的な実施態様に多くの変更を加えてもなお同様または類似の結果を本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく得ることができることは当業者には理解されるはずである。
新規な挿入部位ORF70の樹立
EHV-1ベクターの能力を増強させるために、本発明者らは、1つのベクターバックボーンから2つの異なるトランスジーンを、2つのトランスジーンを結合させることなく1つのプロモーターの制御下でRNAウイルス由来機能によって発現する方法を発見しようと試みた。本発明者らは、ヘルペスウイルスゲノムは、2つの別個のトランスジーン挿入部位を並行して使用することを許容するであろうと仮定した。EHV-1 ORF70が適切なトランスジーン挿入部位であるか否かを決定するために、orf70（1236bp）の5’末端801塩基対を、自家蛍光mCherryタンパク質をコードする発現カセット（Shaner et al., 2004）と古典的相同組換えによって取り替えた（図2）。プラスミドpU-mC70-BGHのマップは図3に示される（配列番号:21）。相同組換えに用いられるDNAフラグメントはpU-mC70-BGHからXbaIで切り出された。ゲル精製フラグメントをEHV-1 RacHのウイルスゲノムDNAとともにRK13細胞に共トランスフェクトした。培養細胞での組換えベクターウイルスの効率的なレスキューおよび効率的な複製は生蛍光およびウイルス力価測定によって示された（データは提示されていない）。orf70の2/3の欠失は、orf70によってコードされる糖タンパク質Gの発現が停止するという付加的利益をもたらした。EHV-1の糖タンパク質Gは、宿主の免疫応答を弱める、非構造性の分泌ケモカイン結合タンパク質であることが示された（Drummer et al., 1998；Bryant et al., 2003）。ベクターワクチンはワクチン受容動物の免疫応答を刺激することが意図されるので、当該ウイルスベクターのまさにこの免疫抑制機能の除去は当該ウイルスベクタープラットフォームEHV-1 RacH-SEの能力をさらに改善することが可能であろう。
組換えEHV-1ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築におけるp455プロモーターと新規なORF70挿入部位の使用
p455プロモーター：
最初の動物実験のために、ブタ起原のインフルエンザAウイルス（A/swine/Italy/7680/2001（H3N2）、GenBankアクセッション番号ABS50302.2）のインフルエンザヘマグルチニンサブタイプH3を用いた。そのコード配列を合成し、トランスファーベクターpU70-p455-71K71（図4、配列番号:22）でサブクローニングし、トランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71を生成して、H3を新規なp455プロモーターおよび新規な71pAポリアデニル化シグナルの制御下に置き、orf70への挿入のための組換え領域とともにカセットをフレーミングした（図5、配列番号:23）。
RED組換え系（Tischer et al.2006）を用いる変異誘導の途中で、発現カセットp455-H3-71をpRacH-SEのorf70に挿入し、pRacH-SE70-p455-H3を作製した（図6）。
PK/WRL細胞にpRacH-SE70-p455-H3をトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1 RacH-SE70-p455-H3をレスキューし2回プラーク精製を実施した。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域のハイフィデリティPCR生成物の配列決定によって立証した。感染細胞のトランスジーン発現は間接免疫蛍光アッセイによって分析した（IFA、図7）。
EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFA（データは示していない）およびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロット（図8）によって確認された。感染細胞の形質膜におけるH3トリマーの出現は、ニワトリ赤血球を用い血球吸着試験によってアッセイされた（データは示していない）。PK/WRL細胞のTCID50/mLとして決定したピーク力価は、親ウイルスのrEHV-1 RacH-SEの力価と同じ範囲にあり、トランスジーン発現がウイルス複製に有害な影響を与えないことを示した（データは示していない）。このことは、レスキュー後に20継代（P20）までrEHV-1 RacH-SE70-p455-H3をPK/WRL細胞で継代することによって確認された。P5、P10、P15およびP20でウイルスを力価測定、配列決定およびウェスタンブロットによって特徴づけ（図8）、P10およびP20では追加的にIFAによって、さらにHA発現並びにプロモーターおよびポリA配列と併せたHAコード挿入物の遺伝的安定性を確認した。
図8に示す2つのブロットは、EHV-1糖タンパク質II（gpII）を特異的に検出するモノクローナル抗体Ai2G7（左）またはインフルエンザヘマグルチニンサブタイプH3に対する市販のウサギポリクローナル抗体（PA5-34930）（右）のどちらかとインキュベートしたレプリカである。gpIIは、期待のとおり組換えEHV-1に感染した全ての細胞培養物で検出された。完全長H3は、期待のとおり種々の継代のrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3に感染した全ての細胞で検出された。H3抗血清の特異性は同じウェスタンブロットで示された（レーンgG430mCを参照されたい）。ここでは、期待のとおりgpII mabのみが反応を引き起こし、一方、抗H3抗体は対応するレプリカのレーンで結合を生じなかった。
P20を用いて感染させた細胞のウイルスプラークの二重免疫蛍光アッセイ（dIFA）（抗H3モノクローナル抗体およびウマ抗EHV抗血清を使用）によって、実質的に全てのEHV-1誘発プラークはまたH3を発現することが確認された（データは示していない）。全ての試験が組換えEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3の安定性を確認した。
新規なORF70挿入部位および血清学的応答の評価を用いる概念実証動物試験（POCI）
試験動物：組入れ基準および実験設計：
インフルエンザAナイーブ雌ブタから生まれた10匹の仔ブタによる5グループが、表2に要約するようにPOC-I試験に含まれた。
表2：
Figure 2021176307

感染用量1x107 TCID50のrEHV-1 RacH-70-p455-H3（EHV-1）を5週齢で1回、または2および5週齢で2回適用した。比較のために、市場で入手できる不活化ワクチンを2および5週齢で2回適用した。全ての仔ブタが、不活化ワクチン（Inact）の効果を停止させないように母体由来抗体フリーであった。2グループにはワクチンを接種しなかったが、生理学的塩化ナトリウム溶液（NaCl）を投与して、それぞれチャレンジコントロールまたは厳密陰性コントロールとして供した。第二のワクチン接種から21日後に、厳密陰性コントロールグループを除く全てのグループを、1x107 TCID50の異種インフルエンザA（IVA）株（ブタR452-14由来のH3N2インフルエンザAウイルス（BI所有チャレンジ株））でチャレンジした。非ワクチン接種チャレンジコントロールグループ（Chall ctrl）では、全てのブタがチャレンジ感染後1および3日でそれらの肺に高力価のインフルエンザウイルスを有したが、一方、厳密陰性コントロールグループ（neg ctrl）およびrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3で2回ワクチン接種したグループ（EHV 2x）の全てのブタは両方の日でIVA陰性であった。不活化コントロールワクチンで2回ワクチン接種したグループ（Inact 2x）では、5匹の動物の1匹がチャレンジ後3日に低いIVA力価を有した。rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3によるチャレンジの21日前に1回ワクチン接種したグループ（EHV 1x）では、5匹の動物の2匹がチャレンジ感染後1日で、さらに5匹のうち1匹がチャレンジ後3日でそれらの肺に低いIVA力価を有した（図9）。
1x107 TCID50のrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3による2回のワクチン接種は、異種IVAのサブタイプH3N2によるチャレンジ感染に対してブタを完全に防御した。EVH-1ベクターRacH-SEはブタのワクチン免疫に適切であること、および新規なプロモーターp455はワクチン接種ブタでのIVAヘマグルチニンの免疫原性発現の駆動に機能的であることが示された。
組換えEHV-1ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新規なp430プロモーターの使用
p430プロモーター：
新たに同定したp430を用いて、H1N1ウイルス（A/swine/Gent/132/2005（H1N1）、GenBankアクセッション番号AFR76623.1）由来の別のインフルエンザヘマグルチニンの発現を駆動させた。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子の起源はトリIAVであったので、H1avと称されるであろう。H1avを合成し、orf1/3挿入領域（図10、配列番号:24）についてトランスファーベクターでサブクローニングし、pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH（図11、配列番号:25）を作製した。H1avの発現をp430およびウシ成長ホルモン（BGH）ポリAシグナルの制御下に置いた。
RED組換え系（Tischer et al.2006）を用いる変異誘導の途中で、発現カセットp430-H1av-BGHをpRacH-SEのorf1/3に挿入し、pRacH-SE1/3-p430-H1avを作製した（図12）。
PK/WRL細胞にpRacH-SE1/3-p430-H1avをトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1avをレスキューし2回プラーク精製を実施した。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域のハイフィデリティPCR生成物の配列決定によって立証した。感染細胞のトランスジーン発現は、間接免疫蛍光アッセイ（IFA）および市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって確認された（図13）。EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFAおよびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロットによって確認された（データは示していない）。H1avの正確なプロセッシングおよび感染細胞の形質膜における分布は、ニワトリ赤血球を用い血球吸着試験によってアッセイされた（データは示していない）。PK/WRL細胞のTCID50/mLとして決定したピーク力価は、親ウイルスRacH-SEの力価と同じ範囲にあり、トランスジーン発現がウイルス複製に有害な影響を与えないことを示した（データは示していない）。
75kDaで泳動する広いバンドの抗体PA-34929による特異的検出は、その配列から想定される組換えHA糖タンパク質の予想される出現と一致する。モノクローナル抗体C102による細胞膜の明白な染色は、予想された細胞区域における分布と合致する（図13）。
発現された組換えヘマグルチニンが予想通りにプロセッシングされ輸送されたか否かを試験するために、VERO細胞をrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE（親）にMOI 0.01で感染させ、または感染させないままにした。感染後24時間で、生きている感染細胞または非感染細胞をPBS中のニワトリ赤血球懸濁物とともにインキュベートし、PBSで洗浄し、蛍光ヘキスト33342核染色で染色した。鳥類の赤血球は細胞核を含むので、それらはヘキスト33342で染色され、蛍光顕微鏡法で小さな青い斑点として出現する。ヘマグルチニンを発現しないrHEV-1 RacH-SEに感染した細胞と比較して、ニワトリ赤血球の吸着は、rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1avまたはrEHV-1 RacH-SE-70-p455-Hに感染した細胞で顕著に増加した（データは示していない）。このことから、ヘマグルチニンは、あたかもそれらが本物のインフルエンザウイルス感染によって生成されたような態様で、翻訳されプロセッシングされ、ベクターウイルス感染細胞の形質膜に輸送されたと結論できる。
感染細胞の明瞭な血球吸着表現型は、トランスジェニックタンパク質の効率的な発現を示すウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイを支持し、EHV-1ベクター感染細胞の細胞表面における機能的なHAトリマーの形成を示唆する。
組換えEHV-1ベクターワクチンにおける新ORF70挿入部位およびORF1/3挿入部位の並行的使用
2つの新しいプロモーターを並行して用いることができることを示すために、組換えEHV-1 RacHを作製して2つの異なるインフルエンザAウイルスサブタイプの2つの異なるヘマグルチニンを発現させた。
市販のポリクローナル抗体の特異性及びH3（PA5-34930）およびH1（PA5-34929）に対する交差反応性の欠如は、単一挿入ウイルスrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3およびrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1avを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって立証した（データは示していない）。
インフルエンザAウイルス（A/swine/Gent/132/2005（H1N1））のヘマグルチニンをコードするオープンリーディングフレームを合成し、トランスファーベクターpU1-3-p430-BGHKBGH（図10）でクローニングしてpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH（図11）を得た。組換えBAC pRacH-SE-70-p455-H3から始めて、pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH（図11、配列番号:25）で組み立てられた発現カセットp430-H1av-BGHを二工程RED組換えによってorf1/3に挿入し、pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3を作製した。PK/WRL細胞にpRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3をトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3をレスキューし、プラーク精製を2回実施した（図12）。
この組換えウイルスの短い表示名はrEHV-1 RacH-SE_Bである。発現カセットの正確な挿入は、フランキング配列を含む挿入領域のハイフィデリティPCR生成物の配列決定によって立証した。感染細胞のトランスジーン発現は、間接免疫蛍光アッセイ（IFA、データは示していない）および市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって確認された（図13）。EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFA（データは示していない）およびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロットによって確認された（図13）。
図13に示すように、H3およびH1avの両トランスジーンは、二重挿入組換え体rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3（B）を感染させた細胞培養物で並行して発現された。トランスジーン発現は安定であり、PK/WRL細胞での11継代まで試験ウイルス力価は損なわれなかった（データは示していない）。
2つの新しいプロモーターp430およびp455は、細胞培養におけるrEHV1-RacH複製に関しては機能的であることが示された。ウイルス複製周期の間の活性レベルは、in vitroプロモーター動態実験から推測すると非常に類似するように思われる。これらの特性は、EHV-1 RacHまたは2つの異なる抗原を類似の効率で並行して発現する他のベクタープラットフォームを基礎にする組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチン標的が2つの異なる病原体から成る場合、この新しい2つのプロモーターを2つの挿入部位で2つのポリアデニル化配列と組合わせて利用すれば、製品コストを顕著に減少させ、ただ1つの抗原成分を発現するベクターを凌ぐ明瞭な利点を提示することができる。
ブタ用一価EHV-1ベクター系インフルエンザAウイルスワクチン（H3ワクチン）の作製、in vitro特徴付けおよびin vivo試験
H3血清型のブタIAVインフルエンザウイルスヘマグルチニン（配列番号:27）（A/swine/Italy/7680/2001（H3N2）、GenBankアクセッション番号ABS50302.2）を、ブタのワクチン免疫試験のための被検抗原として選択した。ブタIAVに対するこの新規なワクチンは、例えばブタIAVタンパク質（NPまたはNA）に対する抗体をブタIAV野外株感染動物で検出することによってDIVAの特色を提供する（本明細書記載のワクチンのみを接種された動物では、前記ワクチンは1つのブタIAV HAタンパク質を発現するだけなので前記抗体は検出されない）。前記のコード配列を合成してサブクローニングし、トランスファーベクターpU70-p455-H3-71K71を作製し、H3を新規なp455プロモーターおよび71pAポリアデニル化シグナルの制御下に置き、当該カセットをorf70への挿入のために組換え領域とともにフレームに収めた（図2）。
RED組換え系を用いる変異誘導の途中で、発現カセットp455-H3-71をpRacH-SEのorf70に挿入し、pRacH-SE70-p455-H3を作製した（図6）。
PK/WRL細胞にpRacH-SE70-p455-H3をトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1 RacH-SE70-p455-H3をレスキューし2回プラーク精製を実施した。
発現カセットの正確な挿入は、挿入領域のハイフィデリティPCR生成物の配列決定によって立証した。感染細胞のトランスジーン発現は間接免疫蛍光アッセイ（IFA、図7）および市販のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット（図8）によって分析した。
EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFA（データは示していない）およびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロット（図8）によって確認された。感染細胞の形質膜におけるH3トリマーの出現は、ニワトリ赤血球を用い血球吸着試験によってアッセイされた（データは示していない）。PK/WRL細胞のTCID50/mLとして決定したピーク力価は、親ウイルスRacH-SEの力価と同じ範囲にあり、トランスジーン発現がウイルス複製に有害な影響を与えないことを示した（データは示していない）。このことは、レスキュー後に20継代（P20）までrEHV-1 RacH-SE70-p455-H3をPK/WRL細胞で継代することによって確認された。P5、P10、P15およびP20でウイルスを力価測定、配列決定およびウェスタンブロットによって特徴づけ（図8）、P10およびP20では追加的にIFAによって、さらにHA発現並びにプロモーターおよびポリA配列と併せたHAコード挿入物の遺伝的安定性を確認した。
図9に示す2つのブロットは、EHV-1糖タンパク質II（gpII）を特異的に検出するモノクローナル抗体Ai2G7（左）またはインフルエンザヘマグルチニンサブタイプH3に対する市販のウサギポリクローナル抗体（PA5-34930）（右）とインキュベートしたレプリカである。gpIIは、期待のとおり組換えEHV-1に感染した全ての細胞培養物で検出された。完全長H3は、期待のとおり種々の継代のrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3に感染した全ての細胞で検出された。H3抗血清の特異性は、H1サブタイプウイルスのインフルエンザヘマグルチニンを発現する他の組換えEHV-1 RacH-SEに感染させた細胞のウェスタンブロットによって示された（下記図15参照）。
P20を用いて感染させた細胞のウイルスプラークの二重免疫蛍光アッセイ（dIFA）（抗H3モノクローナル抗体およびウマ抗EHV抗血清を使用）によって、実質的に全てのEHV-1誘発プラークはまたH3を発現することが確認された（データは示していない）。全ての試験が組換えEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3の安定性を確認した。
幼若仔ブタにおけるベクター系ワクチンとしてのその特性を解明するために、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3をワクチン免疫チャレンジ試験で試験した。詳述すれば、ブタIAVに対する母体由来免疫をもたない仔ブタ（母体性抗体無し）に、RacH-SE-70-p455-H3を含む細胞培養上清を筋肉内に2回1x10^7 TCID50の用量で2および5週齢（2ショットワクチン接種、2x EHV-1）に、または5週齢のみ（1ショット、1x EHV-1）にワクチン接種した。非ワクチン接種グループを陰性コントロールとして供し、2および5週齢で市販の不活化ブタIAVワクチンを製造業者の指示にしたがい（ただしワクチン接種時点を除く）ワクチン接種した動物グループを陽性コントロール（殺滅）として供した。8週齢で、陰性コントロールを除くすべての動物を、1x10^7 TCID50のH3N2ブタIAVチャレンジ株の気管内適用投与によってチャレンジした（前記チャレンジ株はヨーロッパ野外ウイルス単離株R452-14であり、そのH3はRacH-SE-70-p455-H3で用いられたH3ワクチン抗原に対して異種である）。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性コントロールとして供され、一方、ワクチン接種せずにチャレンジした動物はチャレンジコントロールとして供された。ワクチン接種時および接種後並びにチャレンジ前およびチャレンジ後に、体温を測定し、血液サンプルを種々の時点で採取した。チャレンジから1日後に、各グループの動物の半分を殺し、肺をブタIAV感染に典型的な病巣についてスコアをつけ、各動物の左右の肺毎にそれぞれ3つの肺サンプルを採取して肺ホモジネート中の感染性ブタIAV力価を決定し、さらに気管支肺胞洗浄液（BALF）サンプルを採取した。チャレンジ後3日に各グループの残りの半分の動物で同じ手順を実施した。
ブタIAVチャレンジウイルス適用後の体温上昇を調べると、非ワクチン接種動物は、チャレンジ1日後に約1℃の体温増加を示した。チャレンジ1日後のこの体温増加は、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを2回接種したグループで予防された（図16）。
ブタIAVチャレンジウイルス適用から1日または3日後に殺した動物の肺スコアの評価は、陰性コントロールはブタIAV感染に典型的な肺病巣を示さず、チャレンジコントロールは6−7％の平均範囲で肺病巣を示し、さらにRacH-SE-70-p455-H3ワクチンを2回接種されたグループについては対応するグループ平均値肺病巣スコアは1から4％未満に大きく減少することを示した（図17）。
ブタIAVチャレンジウイルス適用から1日または3日後に殺した動物の平均ブタIAV肺力価は、陰性コントロールは肺サンプルでブタIAVを示さず、一方、チャレンジコントロールは5（3日目）から7log（1日目）を超える範囲の肺組織1g当たりのウイルス力価を有することを示した。全く対照的に、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを1回接種したグループについてはグループ平均値は約2log以下に大きく減少し、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを2回接種したグループについては検出不能レベルに減少した（図9）。
ブタIAV中和抗体の誘発を試験したところ、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを1回接種した動物の血清は、最初のワクチン接種から3週間後に約160の範囲の逆数の中和力価を示し、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを2回接種した動物の血清は、2回目のワクチン接種から3週間後に約2560の中和力価を示し、一方、非ワクチン接種グループの血清は検出可能なブタIAV中和抗体レベルを示さなかった（図18）。
ブタIAVチャレンジから1または3日後の動物のBALFの炎症促進サイトカインIL-1βの量を決定したところ、100pg/mLを超え900pg/mLまでのIL-1βレベルが1日目に試験した4匹の動物のうち1匹で検出されたが、一方、これらのレベルは、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを1回接種された動物のBALFでは100−300pg/mLのIL-1βに減少し、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを2回接種された全ての動物で0から100pg/mL未満のIL-1βレベルにさらに減少した（図19）。これは、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンの接種は、ブタIAV感染後の炎症促進サイトカインIL-1βの誘導を効率的に予防したことを示している。
試験28日目にサンプル採取した末梢血単核球（PBMC）の種々の刺激による再刺激を試験したところ、非ワクチン接種動物からのPBMCの刺激は、用いた刺激に無関係にIFNγ-ELISpotで75/1x10^6未満のカウントを示した（図20A）。不活化ワクチン（殺滅）を2回投与された動物のPBMCは、それらが組換えブタIAV核タンパク質NPで再刺激されたときは約150/1x10^6カウントを示し、それらがブタIAV H3N2チャレンジ株R452-14で再刺激されたときはIFNγ-ELISpotで約3000/1x10^6カウントを示したが、組換えブタIAV HAまたはEHV-1ウイルスを用いたときはPBMCの再刺激を示さなかった（75/1x10^6カウント以下のレベル）（図20B）。対照的に、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンで1回または2回ワクチン接種された動物はまた、それらがブタIAV H3N2チャレンジ株R452-14で再刺激されたときはIFNγ-ELISpotで約200（1x EHV-1）から300（2x EHV-1）/1x10^6カウントを示したが、組換えブタIAV NPを用いたときはPBMCの再刺激はなかった（75/1x10^6カウント以下のレベル）（図20C）。EHV-1ウイルスを再刺激に用いたときは、RacH-SE-70-p455-H3ワクチン1回または2回接種された動物は、それらが空EHV-1ワクチンRacH-SEで再刺激されたとき、IFNγ-ELISpotで約300/1x10^6カウントを示し、この値は、ブタIAV H3を発現するRacH-SE-70-p455-H3ワクチンを用いたとき400/1x10^6を超えてさらに増加した（図20CおよびD）。したがって、組換えブタIAV HAを再刺激に用いたとき、RacH-SE-70-p455-H3ワクチンを1回または2回接種された動物だけが、IFNγ-ELISpotで約100-150（1xEHV-1）から150-200（2x EHV-1）/1x10^6カウントを示した（図20CおよびD）。
ブタ用四価EHV-1ベクター系インフルエンザAウイルスワクチンの作製、in vitro特徴付けおよびin vivo試験
下記に記載するように、本明細書記載の発明では、H1N2、H3N2、H1N1トリおよびH1N1汎流行性ブタIAVサブタイプ/血清型に由来する、上記4つのブタIAVヘマグルチニン（HA）抗原が、2つの組換えEHV-1ベクターウイルスによって発現される。ブタIAVに対するこの新しい四価のワクチンはDIVAの特色を提供し、前記特色は、ブタIAV野外株に感染した動物ではブタIAVタンパク質NPまたはNAに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンを接種されただけの動物では前記抗体は検出されないということである。なぜならば、前記ワクチンはブタIAV HAタンパク質を発現するだけだからである。
この新規な四価ブタIAVワクチンをin vitroで特徴付けし、ブタIAVに対するその有効性をin vivoで試験した。
新しく同定したp430プロモーターを用い、ブタ（A/swine/Gent/132/2005（H1N1）、GenBankアクセッション番号AFR76623.1）の発現を駆動した。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子はトリIAVを起源とするので、H1avと称されるであろう。H1avを合成し、orf1/3挿入領域のためにトランスファーベクターでサブクローニングし、pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGHを作製した。H1avの発現をp430プロモーターおよびウシ成長ホルモン（BGH）ポリAシグナルの制御下に置き、orf1/3への挿入のために組換え領域とともにフレームに収めた（図11、配列番号:25）。
RED組換え系を用いる変異誘導の途中で、発現カセットp430-H1av-BGHをpRacH-SEのorf1/3に挿入し、pRacH-SE1/3-p430-H1avを作製した（図12）。PK/WRL細胞にpRacH-SE1/3-p430-H1avをトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1avをレスキューし2回プラーク精製を実施した。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域のハイフィデリティPCR生成物の配列決定によって立証した。感染細胞のトランスジーン発現は間接免疫蛍光アッセイ（IFA）および市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した（図13）。EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFAおよびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロットによって確認された（データは示していない）。H1avの正確なプロセッシングおよび輸送並びに感染細胞の形質膜における分布は、ニワトリ赤血球を用い血球吸着試験によってアッセイされた（データは示していない）。PK/WRL細胞のTCID50/mLとして決定したピーク力価は、親ウイルスのRacH-SEの力価と同じ範囲にあり、トランスジーン発現がウイルス複製に有害な影響を与えないことを示した（データは示していない）。
75kDaで泳動する広いバンドの抗体PA-34929による特異的検出は、その配列から想定される組換えHA糖タンパク質の予想される出現と一致する。モノクローナル抗体C102による細胞膜の明白な染色は、予想された細胞区域における分布と合致する。
発現された組換えヘマグルチニンが予想通りにプロセッシングされ輸送されたか否かを試験するために、VERO細胞をrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE（親）にMOI 0.01で感染させ、または感染させないままにした。感染後24時間で、生きている感染細胞または非感染細胞をPBS中のニワトリ赤血球懸濁物とともにインキュベートし、PBSで洗浄し、蛍光ヘキスト33342核染色で染色した。鳥類の赤血球は細胞核を含むので、それらはヘキスト33342で染色され、蛍光顕微鏡法で小さな青い斑点として出現することができ、ヘマグルチニンを発現しないrHEV-1 RacH-SEに感染した細胞と比較して、ニワトリ赤血球の吸着は、rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1avまたはrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3のどちらかに感染した細胞で顕著に増加した（データは示していない）。このことから、ヘマグルチニンは、あたかもそれらが本物のインフルエンザウイルス感染によって生成されたかのような態様で、翻訳されプロセッシングされ、ベクターウイルス感染細胞の形質膜に輸送されたと結論できる。この感染細胞の血球吸着表現型は、トランスジェニックタンパク質の効率的な発現を示すウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイを支持し（H1av、図13）、EHV-1ベクター感染細胞の細胞表面における機能的なHAトリマーの形成を示唆する。
市販のポリクローナル抗体の特異性及びH3（PA5-34930）およびH1（PA5-34929）に対する交差反応性の欠如は、単一挿入ウイルスrEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3およびrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1avを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって立証した（データは示していない）。
次に、2つの異なるインフルエンザAウイルスサブタイプ/血清型の2つの異なるヘマグルチニンを発現する組換えEHV-1 RacH-SEを作製した。
組換えBAC pRacH-SE-70-p455-H3から始めて、トランスファーベクターpU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH（図12）中でアッセンブルした発現カセットp430-H1av-BGHを二工程RED組換えによってorf1/3に挿入し、pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3を作製した。PK/WRL細胞にpRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3をトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3をレスキューし、プラーク精製を2回実施した。この組換えウイルスの省略呼称はrEHV-1 RacH-SE_Bである（図14）。発現カセットの正確な挿入は、フランキング配列を含む挿入領域のハイフィデリティPCR生成物の配列決定によって立証した。
感染細胞のトランスジーン発現は、間接免疫蛍光アッセイ（IFA、データは示していない）および市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって確認された（図15）。EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFA（データは示していない）およびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロットによって確認された（図15）。
H3およびH1avの両トランスジーンは、二重挿入組換え体rEHV-1 RacH-SE_Bを感染させた細胞培養物で並行して発現された。トランスジーン発現は安定であり、PK/WRL細胞での11継代まで試験したウイルス力価は損なわれなかった。
2つの挿入部位および2つの新しいプロモーターを有する強化EHV-1ベクターは、2つのインフルエンザウイルスヘマグルチニンを並行して発現することが示された。IFAおよびウェスタンブロットにより決定されたSDS-PAGEでの移動度で決定された細胞内分布は、文献に示されたインフルエンザAウイルス感染細胞で発現される本物のヘマグルチニンと一致した。
次に、ヘマグルチニンH1hu（配列番号:29；A/swine/Italy/4675/2003（H1N2）；GenBankアクセッション番号ADK98476.1）、およびヘマグルチニンH1pdm（配列番号:26；A/swine/Italy/116114/2010（H1N2）；GenBankアクセッション番号ADR01746.1）を発現する第二の二重挿入rEHV-1 RacHを作製した。
Hihuのコード配列を合成し、orf1/3挿入領域のためにトランスファーベクターでサブクローニングし、pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGHを作製した。H1huの発現をp430プロモーターおよびウシ成長ホルモン（BGH）ポリAシグナルの制御下に置き、orf1/3への挿入のために組換え領域とともにフレームに収めた（図21）。
Hipdmのコード配列を合成してサブクローニングし、トランスファーベクターpU70-p455-H1pdm-71K71を作製し、H1dpmを新しいp455プロモーターおよび新しい71pAポリアデニル化シグナルの制御下に置き、orf70への挿入のために組換え領域とともにフレーミングした（図22）。
続いて、RED組換え系を用いる変異導入の途中で、発現カセットp430-H1av-BGHおよびp455-H1pdm-71をpRacH-SEに挿入し、まず初めにpRacH-SE-1/3-p430-H1huを作製した。この改変BACを鋳型として用い、RED組換え系を用いる変異導入の途中でp455-H1pdm-71を挿入して、pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdmを作製した。pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdmをPK/WRL細胞にトランスフェクトし、rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdmをレスキューし、3回プラーク精製を実施した。この新しい組換えベクターウイルスの省略呼称はrEHV-1 RacH-SE_Dである（図23）。
感染細胞のトランスジーン発現は、間接免疫蛍光アッセイ（IFA、データは示していない）および市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって分析された（図24）。EHV-1 gpIIをコードするorf71の復元は、IFA（データは示していない）およびモノクローナル抗体Ai2G7（BI所有）を用いるウェスタンブロットによって確認された（図24）。
組換えrEHV-1の遺伝型及び表現型の安定性は、細胞培養で継代し5継代毎にウイルス力価を決定することによって示された。挿入領域の配列は、10継代毎にウェスタンブロットによるトランスジーンの発現とともに確認された（データは示していない）。発現フィデリティは、メトセルオーバーレイ下での二重IFAで抗EHV抗体およびトランスジーン抗体で染色して計測することによって評価された（データは示していない））。
幼若仔ブタにおけるベクター系ワクチンとしてのその特性を解明するために、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成るブタIAVワクチンをワクチン免疫チャレンジ試験で試験する。詳述すれば、ブタIAVに対する母体由来抗体を有する仔ブタ（母体由来抗体陽性）をrEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dで2回、ワクチン株あたり1x10^7 TCID50の用量で筋肉内に1週齢及び4週齢（2ショットワクチン接種、2x EHV-1）で、または4週齢でのみ（1ショットワクチン接種、1x EHV-1）ワクチン接種した。非ワクチン接種グループが陰性コントロールとして供された。11週齢で、陰性コントロールを除くすべての動物を1x10^6 TCID50のH3N2ブタIAVチャレンジ株の気管内適用投与によってチャレンジする（前記チャレンジ株はヨーロッパ野外ウイルス単離株R452-14であり、そのH3はrEHV-1 RacH-SE_Bで用いられたH3ワクチン抗原に対して異種である）。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性コントロールとして供され、一方、ワクチン接種せずにチャレンジした動物はチャレンジコントロールとして供される。ワクチン接種時および接種後並びにチャレンジ前およびチャレンジ後に、体温を測定し、血液サンプルを種々の時点で採取する。チャレンジから1日後に、各グループの動物の半分を殺し、肺をブタIAV感染に典型的な病巣についてスコアをつけ、各動物の左右の肺毎にそれぞれ3つの肺サンプルを採取して肺ホモジネート中の感染性ブタIAV力価を決定し、さらに気管支肺胞洗浄液（BALF）サンプルを採取する。チャレンジ後3日に各グループの残りの半分の動物で同じ手順を実施する。サンプル材料および収集データを分析しとりわけ以下を決定する：チャレンジ後の体温の変化、ブタIAV感染後の臨床徴候、肺スコア、ブタIAV肺力価、肺組織の組織学的変化、ブタIAV血清中和力価、BALFのサイトカインレベル、IFNγ-ELISpotにより測定されるPBMCSの再刺激、およびB細胞活性化。
二価rEHV-1 RacHベクターワクチン接種マウスの2抗原に対する中和抗体応答の誘発
rEHV-1 Rac SE B（rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-7-p455-H3（図14参照））をBalb/cマウスの免疫に用い、発現されるトランスジーンがブタ以外の別の種で免疫原性であること、および鼻内適用により2つの抗原のどちらの1つに対しても中和抗体が誘発されること示した。
詳述すれば、各グループ5匹のBalb/cマウスの3グループ（3−5週齢）の鼻内に試験0日目および21日目に、40μLのrEHV-1 RacH SE B（rEHV-1 RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3、グループ1）、または40μLの空ベクター（rEHV-1 RacH-SE、グループ2、ベクターコントロール）、または40μLの組織培養液（グループ3、陰性コントロール）をそれぞれ接種した。グループ1および2について、感染性組換えEHV-1の投与をそれぞれ1x10^5 TCID50/40μLで実施した。試験0日目（1回目接種の前）、7、14、21日目（2回目接種の前）、28日目および35日目にマウスから採血した。血清を血液サンプルから調製し、-80℃で凍結保存した。
ベクターウイルスに対する抗体検出のための免疫蛍光アッセイ
AI-ST細胞にrEHV-1 RacH-SE1212を感染多重度（MOI）0.001で感染させ、空ベクターBAC pRacH-SE1からウイルスをレスキューした。感染後24時間で特有のプラークが観察され、細胞を間接免疫蛍光アッセイ（IFA）のために処理した。3グループ全ての最終血液の血清（2回目のワクチン接種から14日後に得られる）をPBSで1：50に希釈し試験した。EHV-1ワクチン接種したウマの陽性コントロール血清を1：500希釈で用いた。二次抗体は、マウス血清については市販のFITC結合ウサギ抗マウスIgG、ウマ血清についてはCy5結合ヤギ抗ウマIgGであり、1：200希釈で用いた。抗体の結合は蛍光顕微鏡法で評価した。全てのワクチン接種マウスがrRHV-1 RacH-SE感染細胞によるIFAで抗体反応を生じた。非感染細胞はいずれの被検血清とも結合しなかった。マウスの陰性コントロールグループの血清は、感染細胞に対しても非感染細胞に対しても特異的結合は全く示さなかった。データは下記の表に要約されている。
表3：抗EHV-1抗体についてのIFA蛍光顕微鏡法の結果
Figure 2021176307

前記から、rEHV-1のマウス鼻孔への接種は感染およびウイルス複製をもたらし、したがってマウス免疫系が刺激されて抗EHV-1抗体を産生すると結論できる。
ウイルス中和試験（VNT）
インフルエンザAウイルス（IAV）（A/swine/Italy/7680/2001（H3N2）またはA/swine/Gent/132/2005（H1N1））を起源とするトランスジーンの発現に対する防御免疫の誘発を示すために、マウス血清を対応するウイルスに対する中和活性について試験した（Allwinn et al.2010；Trombetta et al.2014）。中和試験のために用いられるIAVは、2014年からドイツでブタから単離された株、特にA/swine/Germany/AR452/2014（H3N2）およびA/swine/Germany/AR1181/2014（H1N1）である。これらはワクチン標的が由来する株とは異種であるので、マウス血清によるこれらウイルスの中和はいずれも、rEHV-1ワクチン免疫による防御免疫の広範囲で有効な誘発の指標となるであろう。陰性コントロール血清として、インフルエンザウイルスに陰性であることが示されたブタの血清が用いられた。
インフルエンザAウイルス中和試験：
ウイルスの中和とともに逆滴定のためにMDCK細胞を使用前に96ウェルプレートで2日間37℃/5％CO2でインキュベートした。対応するIAVストックH3N2およびH1avN1を氷上で融解しゲンタマイシンおよび2倍濃度のトリプシンを含むMEM（MEM/Genta/2xトリプシン）で希釈した。
被検血清は、グループ1（rEHV-1 RacH SE B）、グループ2（空ベクター）、陽性コントロール（不活化多価IAVワクチンを接種したブタの血清）、および陰性コントロールの最終採血から得られた。
血清を熱不活化し、それぞれ独立した2つの試験および3つの試験で、1：16から始まり1：4096まで連続1：2希釈した。IAVを約100TCID50/中和試験に希釈した。中和反応物を37℃、5％CO2で2時間インキュベートした。使用ウイルスの逆滴定は4つ組で実施した。増殖培養液を除去し、MDCK細胞をゲンタマイシン及びトリプシン含有培養液で洗浄した後、中和反応物または逆滴定のウイルス希釈物を添加した。MDCK細胞に中和反応物または逆滴定のウイルス希釈物をそれぞれ添加したあと、VNTおよび力価測定プレートを37℃/5％ CO2で1時間インキュベートした。その後、接種物を除去し、ゲンタマイシン及びトリプシンを含む新しい培養液を重層した。感染5日後、CPEをモニターし、文書化した。試験で実際に用いられたウイルス力価をReed and MunchにしたがってTCID50/mLとして算出し、インフルエンザ特異的CPEの誘発を防御した被検血清の希釈を報告した。下記の表を参照されたい。
表4：インフルエンザH1avN1 VNTの結果
Figure 2021176307
表5：インフルエンザH3N2 VNTの結果
Figure 2021176307

独立した試験の結果を比較するために、血清希釈の逆数およびそれによって中和された対応する力価の掛け算によって中和能力を算出した。続いて、3つの試験の平均を100で割って、100 TCID50の中和を表した（表3、4および5）。データを要約し、図25にグラフで示す。
rEHV-1 RacH SE Bワクチンを接種された全マウスが、対応するIAV（H3N2およびH1avN1サブタイプ異種株）に対して中和抗体を生じた。したがって、p455プロモーターの制御下でorf70挿入部位から（H3）、およびp430プロモーターの制御下でorf1/3挿入部位から（H1av）並行してIAVのヘマグルチニンを発現するrEHV-1 RacH-SEの2倍の鼻内適用は、BALB/cマウスで防御免疫応答を上首尾で刺激した。
2つの異なるトランスジーンの並行発現のためにベクターrEHV-1 RacH-SEを用いて、鼻内ワクチン接種後に免疫応答を刺激できると結論することができる。
畜牛用EHV-1ベクター系シュマーレンベルクウイルス（SBV）ワクチンの作製、in vitro特徴づけおよびin vivo試験
新興のブンヤウイルスの1つは、シュマーレンベルクウイルス（SBV）（最初のヨーロッパシンブ（Simbu）血清型ウイルス、オルトブンヤウイルス（Orthobunyavirus）属）である。このウイルスは、重要な妊娠期に妊娠動物が感染すると流産、死産および重篤な致死性奇形を引き起こすことがあり、さらにオルトブンヤウイルスの研究用モデルとしてますます用いられている（Bilk et al., 2012）。シンブウイルスは媒介昆虫によって伝播され、利用可能な治療選択肢がないので、ワクチン接種は疾患制御の主要な要素である。SBVおよびさらに別のシンブウイルス（例えばアカバネウイルス（AKAV）またはアイノウイルス）に対しては完全体ウイルスワクチンが利用可能であり、SBVに対して生弱毒化ワクチンが開発された（著者不詳、2013、2015；Kraatz et al., 2015；Wernike et al., 2013b）。しかしながらこれらのワクチンのいずれも野外感染動物とワクチン接種動物を弁別することができない（DIVA原理）。つい最近、DIVA適合サブユニットワクチン（SBV糖タンパク質Gcのアミノ末端234アミノ酸（aa）に基づく）が、致死的小動物チャレンジモデルおよび畜牛で試験された（Wernike et al., 2017）。発現プラスミドとしてデリバリーされるか、または哺乳動物細胞培養系で発現されるとき、Gcドメインは66％までの動物に防御を付与し、一方、関連するAKAVの対応するドメインに連結されたSBVのGcドメインで免疫された全ての動物を完全に防御した（Wernike et al., 2017）。ワクチンベクターとしてのrEHV-1 RacH-SEの畜牛への適用を調査するために、SBG-Gcのアミノ末端234aaをorf70(US4)挿入部位に挿入し、新規なp455プロモーターおよび71pAポリAシグナルの制御下で発現させ、畜牛のワクチン接種チャレンジ試験で試験した。
シュマーレンベルクウイルス（SBV）糖タンパク質c（Gc)由来抗原を発現する組換えEHV-1の作製
シュマーレンベルクウイルス（SBV）糖タンパク質c（Gc）のコード領域の234アミノ酸部分についてEHV-1での発現のためにコドン使用頻度最適化を実施し、さらに追加の改変を実施して感染細胞の形質膜への効率的輸送および挿入を達成した。この目的のために、インフルエンザAウイルス（IAV）ヘマグルチニン（HA）サブタイプH1N2（A/swine/Italy/116114/2010（H1N2）、GenBankアクセッション番号ADR01746.1）由来のシグナルペプチドコード配列とともに、当該HAのトランスメンブレンアンカー（TM）および細胞質C-末端をそれぞれ5’および3’末端に結合させた。加えて、GSリンカーHMGGSGGGGSGGGGSGGGT（配列番号:30）をGc部分とHA-TMドメインとの間に挿入した。DNA（配列番号:31）を合成し、pU70-455-71K71のNotI/KpnI部位でサブクローニングした（pU70-455-71K71は、BAC pRacH-SEのRED媒介組換えによる、トランスジーン発現カセットのEHV-1 orf70（US4）への挿入のためのトランスファーベクターである）。得られたプラスミドpU70-455-SBVGc_71K71（図26）をXbaIで切断し、3056bpのDNAフラグメント（配列番号:32）を遊離させ、前記を用いてpRacH-SEを有する大腸菌K12 GS1783を形質転換した。
配列番号:31：サブクローニングのための制限部位を含む合成DNA配列
GCGGCCGCATGAAGGCGATCCTGGTTGTGCTGCTGTACACCTTTGCCACCGCCAACGCCGATACGCTGATCAACTGCAAGAACATCCAGAGCACCCAGCTGACAATCGAGCACCTGAGCAAGTGCATGGCCTTCTACCAGAACAAGACCAGCAGCCCCGTCGTGATCAACGAGATCATCTCCGACGCCAGCGTGGACGAACAGGAACTGATTAAGTCTCTGAACCTGAACTGCAACGTGATCGACCGGTTCATCAGCGAGTCCAGCGTGATCGAGACACAGGTGTACTACGAGTATATCAAGAGCCAGCTGTGTCCACTGCAAGTGCACGATATCTTCACCATCAACAGCGCCAGCAACATCCAGTGGAAGGCCCTGGCCCGCAGCTTTACCCTGGGCGTGTGCAACACCAACCCCCACAAGCACATCTGCCGGTGCCTGGAATCCATGCAGATGTGTACCAGCACCAAGACCGACCACGCCAGAGAGATGAGCATCTACTACGACGGCCACCCCGACAGATTCGAGCACGACATGAAGATTATCCTGAATATCATGCGGTACATCGTGCCCGGCCTGGGCAGAGTGCTGCTGGACCAGATCAAGCAGACCAAGGACTACCAGGCCCTGAGACACATCCAGGGCAAGCTGAGCCCCAAGTCCCAGAGCAACCTGCAGCTGAAGGGCTTCCTGGAATTCGTGGACTTCATCCTGGGCGCCAACGTGACCATTGAGAAAACCCCCCAGACCCTGACCACCCTGAGCCTGATTCATATGGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGCACCATACTGGCCATTTACAGCACAGTTGCGAGCAGCCTGGTCCTGATCGTGAGCCTGGGTGCTATATCATTCTGGATGTGCAGCAACGGCTCTCTCCAGTGCCGCATCTGTATCTGAGGTACC
配列番号:32：pRacH-SE-70-455-SBVGcを作製するためにRED組換えに用いられるDNAフラグメント
（制限酵素切断位置は星印（*）によって示される
T * CTAGACTCGAGCGCAAGCCCTACACGCGCTACCCCTGCTTTCAACGCGTCAACCTGCACATTGACGGGGAGTTTCTGGTTCACAAGATGCTAGCGTTCAATGCCGCGATGCGCCCATCGGCCGAGGAGCTGCTGTCATACCCAATGTTTGCTCAACTTTAGGATGACTAACCTGTTTCTGGGAGGAGACAGCGTGGGCGACGGTGTATAAAGTTGGTCTGCTTTCAAGCCCTGCCACTGCGCTACAGTGCCACCAACTGTAAAGCGGTAGTAAGCTGCAGTGGTCGACTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATAGGATCCGATCCATGGGCGGCCGCATGAAGGCGATCCTGGTTGTGCTGCTGTACACCTTTGCCACCGCCAACGCCGATACGCTGATCAACTGCAAGAACATCCAGAGCACCCAGCTGACAATCGAGCACCTGAGCAAGTGCATGGCCTTCTACCAGAACAAGACCAGCAGCCCCGTCGTGATCAACGAGATCATCTCCGACGCCAGCGTGGACGAACAGGAACTGATTAAGTCTCTGAACCTGAACTGCAACGTGATCGACCGGTTCATCAGCGAGTCCAGCGTGATCGAGACACAGGTGTACTACGAGTATATCAAGAGCCAGCTGTGTCCACTGCAAGTGCACGATATCTTCACCATCAACAGCGCCAGCAACATCCAGTGGAAGGCCCTGGCCCGCAGCTTTACCCTGGGCGTGTGCAACACCAACCCCCACAAGCACATCTGCCGGTGCCTGGAATCCATGCAGATGTGTACCAGCACCAAGACCGACCACGCCAGAGAGATGAGCATCTACTACGACGGCCACCCCGACAGATTCGAGCACGACATGAAGATTATCCTGAATATCATGCGGTACATCGTGCCCGGCCTGGGCAGAGTGCTGCTGGACCAGATCAAGCAGACCAAGGACTACCAGGCCCTGAGACACATCCAGGGCAAGCTGAGCCCCAAGTCCCAGAGCAACCTGCAGCTGAAGGGCTTCCTGGAATTCGTGGACTTCATCCTGGGCGCCAACGTGACCATTGAGAAAACCCCCCAGACCCTGACCACCCTGAGCCTGATTCATATGGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGTGGCACCATACTGGCCATTTACAGCACAGTTGCGAGCAGCCTGGTCCTGATCGTGAGCCTGGGTGCTATATCATTCTGGATGTGCAGCAACGGCTCTCTCCAGTGCCGCATCTGTATCTGAGGTACCAATAAACGCGGTATGTCTACCTTCAAGCCTATGATGAACGGATGTTTGGTGTTTGCGGCTATTATAACGCTCTTGAGTTTTATGCTATCTCTGGGAACATGCGAAAATTACAGGCGTGTGGTTCGGGATCCTAGGGATAACAGGGTAATCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAAATAAACGCGGTATGTCTACCTTCAAGCCTATGATGAACGGATGTTTGGTGTTTGCGGCTATTATAACGCTCTTGAGTTTTATGCTATCTCTGGGAACATGCGAAAATTACAGGCGTGTGGTTCGGGATCCGACCCTGTTGGTGGGTGCGGTTGGACTCAGAATCTTGGCGCAGGCATGGAAGTTTGTCGGTGACGAAACATACGACACCATCCGCGCAGAAGCAAAGAATTTAGAGACCCACGTACCCTCAAGTGCTGCAGAGTCGT * CTAGA
組換えpRacH-SE-70-455-SBVGc DNAを調製し、発現カセットの正確な挿入および配列同一性は、ハーキュラーゼTM（HerculaseTM）およびPCR生成物のサンガー配列決定を用いて高フィデリティPCRによって確認した。使用プライマーは表6を参照されたい（配列番号:33から配列番号:37）。
表６：PCRおよび配列決定に用いたプライマー
Figure 2021176307
組換えEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGcのレスキューおよび特徴付け
BAC DNAをpRacH-SE-70-455-SBVGcの4つの異なるクローンから調製した。AI-ST細胞（ベーリンガー-インゲルハイム所有ブタ精巣細胞株）を、10％のFBS（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, SAFC, Cat 12003C-1000ml）を含むMEM（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, SAFC62892-1000M3056）中に105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート（Corning Incorporated Life Sciences, One Becton Circle, Durham, NC 27712, USA; REF 353046）に播種した。細胞が60−70％コンフルエントになったとき（通常は次の日）、細胞に2μgのBAC DNAをトランスフェクトした。MirusTMmRNAトランスフェクションキット（Mirus Bio LLC, 545 Science Drive, Madison, WI 53711 USA）を供給者の指示にしたがって用いた。簡単に記せば、200μLのOptimenTM（Thermo Fisher Scientific）培養液を5mLのポリスチレンチューブに添加した。DNAを添加し混合した。次に3μLのブースト試薬を添加し旋回させて混合し、続いて同じ体積のトランスフェクション試薬を添加し、再び旋回させて混合した。混合物を3分間室温でインキュベートし、続いて細胞培養物に滴下して直接添加した。細胞を37℃/5％CO2で5日間インキュベートした。細胞をリンスして培養液中に落とし込み、-80℃での保存のために収集した。レスキューウイルスの連続1:10希釈をMEMで調製し、6ウェルプレートのコンフルエントAI-ST細胞単層にプレートした。37℃/5％CO2で1時間吸着させた後、接種物を除去し、0.5％メトセル（Methocel）（メチルセルロース、Ph.Eur., Fluka 64632-500G）および5％FBSを含む半固形培地（MEM-メトセル）を細胞に重層した。37℃/5％CO2で2から3日インキュベートした後（継代1）、隣のプラークからできるだけ遠くに位置する個々のプラークを10μLの体積で吸引し、6ウェルプレートの新しいAI-ST細胞培養に接種した。感染細胞を2から3日、多数のCPEが観察されるまでインキュベートした（継代2）。細胞をリンスして培養液中に落とし込み、-80℃での保存のために収集した。プラーク精製のこの手順を2回繰り返した。3回プラーク精製したウイルスを感染させたAI-ST細胞を間接免疫蛍光アッセイまたはウェスタンブロットのためにそれぞれ処理した。
感染細胞から調製したウイルスDNAをハーキュラーゼTM使用高フィデリティPCRのための鋳型として用いた。得られたPCR生成物をサンガー配列決定および理論的配列を有する挿入領域の同一性によって分析し、BACの対応するPCR生成物の配列を確認した。
間接免疫蛍光アッセイ
24ウェルプレート（Corning Incorporated-Life Sciences, One Becton Circle, Durham, NC 27712, USA; REF 353047）のAI-ST細胞に、MEMで連続希釈した3回プラーク精製ウイルスを感染させた。増殖培養液を細胞から吸引除去し、細胞に250μLの希釈ウイルス（10-2から10-7希釈）を重層した。ウイルスの吸着のために細胞を37℃/5％CO2で1時間インキュベートし、続いて接種物を除去した。細胞にウェル当たり1000μLのMEM-メトセルを重層し、37℃/5％CO2で2日間インキュベートした。顕微鏡でプラーク形成が観察されたときに、IFAのために細胞を処理した。培地を吸引し、細胞をウェル当たり1mLのPBS（Gibco Life Technologies, Paisley PA49RF, UK, DPBS (1x) REF 14190-136）で1回洗浄した。PBSを除去し、-20℃の冷エタノール（Carl Roth GmbH, Schoemperlenstr.3-5, D-76185 Karlsruhe, Art.Nr.5054.1）を1mL/ウェルで添加しRTで30分インキュベートすることによって細胞を固定した。エタノールを吸引し、細胞を風乾した。1mL/ウェルのPBSで10分間RTにて再水和した後、PBS希釈一次抗体を添加し（150μL/ウェル）、RTで1時間インキュベートした。一次抗体を除去し、細胞をウェル当たり1mLのPBSで2分間、3回洗浄してから二次抗体希釈物を添加した（150μL/ウェル）。光を遮断して1時間RTでインキュベートした後、二次抗体希釈物を除去し、細胞を1mL PBS/ウェルで2分間、3回洗浄し、最後に蛍光顕微鏡による精査のためにウェル当たり500μLのPBSを重層した。使用抗体を表7に示す。
表7：
Figure 2021176307
ウェスタンブロット
1．感染：6ウェルプレート中の各々コンフルエントな3ウェルのAI-ST細胞に、2つの異なる単離株、rEHV-1 RacH-SE-455-SBVGc（#121.131 P6および#121.232 P6）およびrEHV-1 RacH-SE1212 P9（親の空BAC pRacH-SE1.2からレスキュー）をMOI約1で感染させた。感染は、それぞれ50μLおよび10μLの融解ウイルスストックを増殖培養液に直接添加することによって実施した。3ウェルを感染させずに残した。感染および非感染細胞を2日間インキュベートし、続いてウェスタンブロットのために処理した。
2．溶解物の調製：プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したRIPA緩衝液（RIPA+PI）を以下のように調製した: 0.7mlの10xRIPA溶解緩衝液（Millipore Cat#20-188）を6.3mlのH20（Fisher Scientific Cat# BP2470-1）に添加し、CompleteTM Miniプロテアーゼ阻害剤カクテルの1錠剤（Roche cat#11 836 153 001）を7mlの1xRIPA緩衝液に溶解させた。非感染コントロールを培養液中に剥ぎ取り、3つの複製ウェルから懸濁物を15mLの遠心管にプールし、氷上に置いた。感染細胞をリンスして培養液中に落とし込み、3つの複製ウェルから懸濁物を15mLの遠心管にプールし、氷上に置いた。1000ｘgで5分間、4℃で遠心分離して細胞を沈殿させた。上清を注意深く吸引し、細胞ペレットをRIPA+PIに再懸濁させた（非感染細胞は300μL、感染細胞は150μL）。懸濁物を氷上で30分間インキュベートし、10分ごとにボルテックスした。懸濁物を1.5mLの微量遠心管に移し、1500rpmで10分間、4℃で微量遠心分離して不溶物質を沈殿させた。清澄な上清を新しい1.5mLの微量遠心管に移して使用まで-80℃で保存した。
3．SDS-PAGEおよびナイロン膜への転写：材料：BioRad標準TGXステインフリープレキャストゲル（BioRad Criterion TGX Stain Free Precast Gel）、4−20％、26ウェル（Cat#_567-8095）；バイオラドプレシジョンプラス二重カラーマーカー（Bio Rad Precision Plus Dual Colour Marker）（Cat#161-0374）；バイオラドプレシジョンプラスオールブルーマーカー（Bio Rad Precision Plus All Blue Marker）（Cat# 161-0373）；バイオラドトランスブロットターボ（Bio Rad Trans Blot Turbo）トランスファーキット（Midi format Cat# 170-4159）；バイオラド4xレムリ（Laemmli）サンプル緩衝液（Cat no.161-0747）（Bio Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 Munchen)；TGS泳動緩衝液（Sambrook et al.）、遮断溶液1：PBST中に5％FBS（Sambrook et al.）；PBST。
サンプルは還元剤を添加しないで調製した。サンプルを氷上で融解させ、1体積の4ｘレムリ緩衝液と混合し、96℃で6分間沸騰させ、ゲルにロードするまで室温で維持した。ゲルを230mAで30分間泳動させ、続いてバイオラドトランスブロットターボ系を用いる電気的転写のために組み立てた。転写は2.5A、25Vで10分に設定した。膜を無菌的蒸留水ですすぎ、25mLの遮断溶液、PBST中の5％FBSとともに4℃で30分間インキュベートした。
抗体のインキュベーションと検出
材料：イミュン-スターウェスタンC化学発光キット（Immun-Star WesternC Chemiluminecent Kit）（Bio Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 Munchen）（Cat#170-5070）
一次抗体：
A：SBV-Gc-タンパク質特異的モノクローナル抗体（Wernike et al., 2015a）、1:20
B：EHV-1 gpIIに対するマウスモノクローナル抗体Ai2G7（ベーリンガーインゲルハイム所有）
二次抗体：ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス（Jackson Immune Research #115-035-146）、1:5000
全てのインキュベーションを定常的振盪下に十分な体積で実施した。抗体は5％FBS/TBSTで希釈した。一次抗体は4℃で一晩インキュベートした。抗体溶液を除去し、ブロットをTBSTで5−10分間3回洗浄した。希釈二次抗体をブロットとともに1時間RTでインキュベートし、除去し、さらにブロットをTBSTで5−10分間3回洗浄した。ブロットを清澄なプラスチック保護シート上に置いた。過酸化物およびルミノ/エンハンサー溶液を1mL＋1mL混合し（各ブロットに対して合計2mL）、ブロットにピペットで加え、3から5分インキュベートした。その後で、膜をChemiDocXRS画像化系（Bio Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 Munchen）に置き、シグナルをイメージラブ（Image Lab）ソフトを用いて記録した。
ウイルス力価測定
感染1日前に、AI-ST細胞を2x104 細胞/ウェルで10％FBS補充MEMに播種した。96ウェルプレート（Corning Incorporated−Life Sciences, One Becton Circle, Durham, NC 27712, USA; REF 353072）を用いた。ウイルスストックを手早く融解し、氷上に置いた。10の1:10連続希釈物を、各希釈につき1.2mLの体積でMEMを用いて調製した。ウェル当たり100μLのウイルス希釈物を細胞に添加した。各希釈につき縦1列の8ウェルであった。各プレートの縦11列および12列を、100μL/ウェルのMEM添加によって培養液コントロールとして供した。力価測定は3つ組で実施し、細胞を37℃/5％CO2で5日間インキュベートした。細胞培養物を顕微鏡で精査し、EHV-1 RacHに典型的なCPEが観察されたウェルを記録した。Reed and Muench（1938）の方法にしたがって、力価をTCID50/mLとして算出した。
ワクチン接種に用いた組換えEHV-1の特徴付け
改変SBVGc234の感染細胞での発現が、rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc 121.232のプラーク単離株でウェスタンブロットおよび二重免疫蛍光アッセイ（DIFA）によって示された。ポリクローナルウマ抗EHV抗血清およびモノクローナル抗SBV抗体によるDIFAはほぼ100％のrEHV-1感染細胞でトランスジーンの発現を確認した。rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232を感染させた細胞のDIFAを実施すると、ウマ抗EHV抗血清（紫）で染色されたEHV-1抗原陽性細胞はまたSBVGcに対するモノクローナル抗体と結合した。非還元条件下で泳動させたウェスタンブロットにより、組換えEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc感染細胞で改変SBVGc234の発現が確認された。SBVGcに対するモノクローナル抗体またはEHV-1gpIIに対するモノクローナル抗体を用いてプローブする、感染または非感染細胞溶解物のウェスタンブロットを実施した。EHV-1gpIIが全ての感染細胞で発現されたが、一方、SBVGcはrEHV-1RacH-SE-70-455-SBVGc感染細胞でのみ発現され、空ベクターrEHV-1 RacH-SE1212感染細胞では発現されなかった。ウイルスタンパク質は模擬感染細胞の溶解物でもまた検出されなかった。EVH-1のgpIIに対するモノクローナル抗体による並行ブロットインキュベーションは、トランスフェクション後の組換えウイルスレスキュー時の自己切出し工程によるorf71（US5）の復元を確認した。3回プラーク精製単離株rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232から生じたP7ウイルスストックは、AI-ST細胞で1.85x109 TCID50/mLの非常に高力価で複製し、トランスジーンの発現はこの細胞株でのEHV複製を妨げないことを示した。rEHV-1RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232の6回の力価測定のTCID50/mLとしての平均は、1.28 x109 TCID50/mLの標準偏差で1.85x109 TCID50/mLであった。
動物および実験設計
ドイツ家畜品種の4頭の畜牛に108 TCID50のrEHV-SBV-Gcを3週間離して2回ワクチン接種し、別の4頭の畜牛を非ワクチン接種コントロールとして維持した。2回目の免疫から3週間後に、全動物の皮下にSBVの野外株の2ｘ0.5mLを接種した（前記株はもっぱら畜牛で継代された（Wernike et al., 2012））。実験を通して、直腸体温を毎日測定し、獣医が臨床徴候について検査した。1週間間隔で血清を採取し、市販のN-系ELISA（ID Screen(商標) Schmallenberg virus Competition, ID vet, France）およびSBV単離株BH80/11に対する微量中和試験によって分析した（以前に記載された通り（Wernike et al., 2013a））。判定は3日後の細胞変性効果の評価によって実施した。全てのサンプルを4つ組で試験し、抗体力価はBehrens and KaerberにしたがってND50として算出した。免疫日、チャレンジ感染日および試験終了日に採取した血清をそれぞれまた別にEHV株RacHに対する微量中和試験によって分析した（rEHV-SBV-Gcグループおよび非ワクチン接種コントロール動物）。
チャレンジ感染後最初の10日間の間、血液サンプルを追加的に毎日収集した。これらのサンプルから、キングフィッシャー96フレックス(King Fisher 96 Flex；Thermo Scientific, Braunschweig, Germany)をマグアトラクトウイルスミニM48キット（MagAttract Virus Mini M48 Kit；Qiagen, Hilden, Germany）と一緒に製造業者の指示にしたがって用いてウイルスRNAを抽出し、S-セグメント系リアルタイムRT-PCRによって試験した（Bilk et al., 2012）。
実験プロトコルは該当する州の倫理委員会によって審査され、監督当局によって承認された（State Office for Agriculture, Food Safety and Fisheries of Mecklenburg-Vorpommern, Rostock, Germany, ref.LALLF M-VTSD/7221.3-1.1-004/12）。
臨床観察及びウイルスRNA検出
全実験を通して、動物のいずれも対応するSBV特異的臨床徴候を全く示さず、体温は直腸で測定したところ、全ての動物について正常範囲内にあった。
チャレンジ感染後1日目または2日目からウイルスRNAが、各非ワクチン接種コントロール動物の血清サンプルで連続して4日間検出できた。rEHV-SBV-Gcの全ワクチン接種動物では、全サンプリング期間を通して減少濃度のウイルスRNAが定量的RT-PCRで示された(図27A)。試験したrEHV-SBV-Gcグループの2頭の動物は、定量的RT-PCRで全サンプリング期間を通して完全に陰性であった（図27A）。rEHV-SBV-Gcで免疫した2頭の動物で、SBGゲノムがそれぞれ3日または5日に減少したレベルで検出された。
抗体応答
非ワクチン接種コントロール動物では、SB特異的抗体はチャレンジ感染前には血清中和試験で検出されなかった。感染の1または2週間後に、高力価の中和抗体が全ての非ワクチン接種動物で検出された（図27B）。
非ワクチン接種コントロールグループとは対照的に、SBV特異的中和抗体が、チャレンジ感染の日にrEHV-SBV-Gcで免疫した4頭の畜牛のうち2頭で検出された。このグループの残りの2頭ではチャレンジ感染前にSBV特異的中和抗体は検出されなかったが、感染後2週間から中和抗体が存在した（図27B）。4頭のワクチン接種動物の全てのSBV特異的中和抗体の力価はチャレンジコントロールの力価よりも低く、チャレンジウイルスの効率の低いウイルス複製を示し、定量的RT-PCRデータを支持する。
EHV中和試験
1:5から開始して血清の2倍希釈列をMEMで調製した。SBVの100 TCID50を含む50μLのMEMおよび希釈血清の50μLを96ウェルの細胞培養プレートで2時間インキュベートした。その後、100μLの新しく調製した（10％ウシ胎児血清を含むMEM中の）BHK細胞懸濁物を添加し、培養プレートを3−4日間37℃/5％CO2でインキュベートした。細胞変性効果を光学顕微鏡で判定した。全ての血清を2つ組で試験し、抗体力価をKaerber（1931）にしたがって（Behrenによって修正（個人的通信））ND50として算出した。図28に示す結果は、rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGcによる畜牛のワクチン接種は特異的免疫応答を誘発するために十分に有効なベクターウイルスの複製をもたらしたことを示している。EHV-1の4頭の動物のうち1頭では、非常に低い力価の中和抗体（1:4）が一次ワクチン接種から3週間後に検出された。2ワクチン接種後、二回目の適用から3週間後に、4頭の畜牛の全てが中和抗体を1:128の力価で産生した。この結果から、EHV-1 RacHはまた畜牛でワクチンベクターとして機能的である可能性があると結論できる。
rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンのブタIAV H3N2チャレンジに対する仔ブタにおける有効性
幼若仔ブタにおけるベクター系ワクチンとしてのその特性を解明するために、rEHV-1 RacH-SE_B（rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3（図14参照））およびrEHV-1 RacH-SE_D（rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm（図23参照））から成る四価ブタIAVワクチンを、第二のワクチンチャレンジ実験で試験した。
この第二の実験では、非ワクチン接種雌ブタに由来する仔ブタであって、H3特異的ELISAの使用（図23）および中和試験（データは示していない）によって、一回目のワクチン接種時にブタIAV特異的抗体について血清学的に陰性であった仔ブタに、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ワクチンを二回接種した。動物に生後第一週で（試験0日目、SD0）1回目のワクチン接種、および生後第四週で（試験21日目、SD21）2回目のワクチン接種をそれぞれ以下のように実施した：筋肉内に続いて筋肉内に（2X IM）、または初回鼻内続いて筋肉内に（IN+IM）、または2回鼻内に（2X IN）、それぞれワクチン株につき2mLで1x10^7 TCID50用量。非ワクチン接種グループを陰性コントロールとして供し、別の非ワクチン接種グループを生後11週のチャレンジコントロール（試験69または70日目、SD42/43）として供した。陰性コントロールを除くすべての動物を、H3N2ブタIAVチャレンジ株（前記チャレンジ株はヨーロッパ野外ウイルス単離株R452-14であり、そのH3はrEHV-1 RacH-SE_Bで用いられたH3ワクチン抗原に対して異種である）の2x10^7 TCID50の用量の鼻内適用によってチャレンジした。非ワクチン接種非チャレンジ動物は陰性コントロールとして供され（neg.ctrl）、一方、非ワクチン接種チャレンジ動物はチャレンジコントロール（chall.ctrl）として供された。ワクチン接種時および接種後並びにチャレンジ前に、種々の時点で血液サンプルを採取した。
チャレンジ1日後に、各グループの動物の半分を殺し、各動物の左右の肺についてそれぞれ3つの肺サンプルを採取した。続いて、1グラムの肺ホモジネートの感染性ブタIAV力価を、各動物の左右の肺の平均として各動物について決定した。前記力価の各々は、左右の肺のプールした3つのサンプルのホモジネートから入手し、左右の肺の3つのサンプルの総重量に対してそれぞれ正規化した。チャレンジ3日後に、各グループの残り半分の動物を用いて同じ手順を実施した。全てのワクチン接種グループについて、グループの個々の動物から得られた感染性ブタIAVの力価の中央値は、チャレンジコントロールと比較したところ、チャレンジ1日後（CH+1）で採取したサンプルで統計的に有意に減少し、一方、陰性コントロールグループの全動物はそれらの肺ホモジネートで感染性ブタIAVウイルス力価を示さなかった（図29）。さらにまた、全てのワクチン接種グループについて、グループの個々の動物から得られた感染性ブタIAVの力価の中央値は、チャレンジコントロールと比較したところ、チャレンジ3日後（CH+3）で採取したサンプルで統計的に有意に減少し、一方、陰性コントロールグループの全動物はそれらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタIAVウイルス力価を示さなかった（図30）。したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによるワクチン接種は、仔ブタの異種ブタIAV H3N2株によるチャレンジの1日および3日後の肺のブタIAV量を、それぞれ統計的に有意に減少させた。結果として、本明細書に記載するワクチンはブタIAVに対してブタで有効である。
さらにまた、試験0日目（SD0、最初のワクチン接種前）、試験21日目（SD21、第二のワクチン接種前）、および試験42日目または43日目（SD42/43、チャレンジ材料適用前）に試験動物から採取した血清を、組換え発現ブタIAV H3抗原（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）に対して得られるブタ免疫グロブリンG（IgG）に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって分析した。陰性コントロールグループの血清の平均OD値は測定した全ての時点で非常に低い値しか提示しなかったが、一方、ワクチン接種グループの血清は、2回の筋肉内適用後に（2X IM；SD21およびSD42/43）、初回鼻内続いて筋肉内適用後に（IN+IM；SD42/43）、さらに2回の鼻内適用後に（2X IN；SD42/43）OD値の高い増加を示した（図32）。したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによるワクチン接種は、ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるブタIAVヘマグルチニンH3に対して仔ブタで血清学的免疫応答をそれぞれ引き起こした。
加えて、末梢血単核球（PBMC）を試験動物から試験28日目（SD28）に採取した血液から精製した。続いてPBMCを、感染多重度1のH3N2ブタIAVチャレンジ株R452-14で（H3N2 MOI 1）、または1μg/mLの濃度の組換え発現ブタH3抗原（rH3 1μg/mL）（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）で再刺激した。この再刺激PBMCを用いて、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（IFNγELISpot）を実施し、得られた値を10^6細胞に対して正規化し、それぞれグループ当たりの平均として算出した（図34）。チャレンジコントロールグループ（この試験の陰性コントロールとして供された；動物は非ワクチン接種）の再刺激PBMCは、どちらの再刺激後でもグループ当たり45未満の平均スポットを示したが、一方、ワクチン接種動物の再刺激PBMCは、2回筋肉内適用後に85より多い、初回に鼻内続いて筋肉内適用後に（IN+IM）100スポットを超える、および2回鼻内適用後に（2X IN）150スポットを超えるグループ当たりの平均スポットをどちらの再刺激後にもそれぞれ示した（図34）。このように、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによるワクチン接種は、ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるブタIAVヘマグルチニンH3に対して、および異種チャレンジウイルス感染に用いたブタIAV H3N2 R452-14に対して仔ブタで細胞性免疫応答をそれぞれ引き起こした。
したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによる仔ブタのワクチン接種は、検出可能な血清学的および細胞性免疫応答を仔ブタで誘発し、異種ブタIAVチャレンジの1日および3日後の肺ホモジネートにおいて統計的に有意に減少するブタIAV量によってワクチンの有効性を示した。
rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンのブタIAV H3N2チャレンジに対する母体由来抗体保有仔ブタにおける有効性
幼若仔ブタにおけるベクター系ワクチンとしてのその特性を解明するために、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンを、第三のワクチンチャレンジ実験で試験した。
この第三の試験では、ブタIAVに対する市販の不活化ワクチンを用いて妊娠中に2回ワクチン接種された雌ブタから生まれ、その初乳および乳で育てられた仔ブタを用いた。仔ブタは、最初のワクチン接種時にブタIAV特異的抗体について検査で血清学的に陽性であった。前記検査では、H3特異的ELISA（図33）および市販ブタIAV特異的抗体ELISA（IDEXX Influenza A (Virus Antibody Test)(商標)；IDEXX, Westbrook, Maine 04092, USA）が製造業者の検査推奨にしたがって用いられた。rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ワクチンで、前記仔ブタを2回ワクチン接種した。動物に生後第一週で（試験0日目、SD0）1回目のワクチン接種、および生後第四週で（試験21日目、SD21）2回目のワクチン接種をそれぞれ以下のように実施した：筋肉内に続いて筋肉内に（2X IM）、または初回鼻内続いて筋肉内に（IN+IM）、または2回鼻内に（2X IN）、それぞれワクチン株、動物およびワクチン接種につき2mL用量で1x10^7 TCID50の投与量。非ワクチン接種グループを陰性コントロールとして供し、別の非ワクチン接種グループをチャレンジコントロールとして供した。生後11週で（試験69または70日目、SD42/43）、陰性コントロールを除くすべての動物を、H3N2ブタIAVチャレンジ株（前記チャレンジ株はヨーロッパ野外ウイルス単離株R452-14であり、そのH3はrEHV-1 RacH-SE_Bで用いられたH3ワクチン抗原に対して異種である）の2x10^7 TCID50の筋肉内適用投与量によってチャレンジした。非ワクチン接種非チャレンジ動物は陰性コントロールとして供され（neg.ctrl）、一方、非ワクチン接種チャレンジ動物はチャレンジコントロール（chall.ctrl）として供された。ワクチン接種時および接種後並びにチャレンジ前に、種々の時点で血液サンプルを採取した。
チャレンジ5日後に、動物を殺し、各動物の左右の肺について3つの肺サンプルをそれぞれ採取した。続いて、1グラムの肺ホモジネートの感染性ブタIAV力価を、各動物の左右の肺の平均として各動物について決定した。前記力価の各々は、左右の肺のプールした3つのサンプルのホモジネートから入手し、左右の肺の3つのサンプルの総重量に対してそれぞれ正規化した。全てのワクチン接種グループについて、グループの個々の動物から得られた感染性ブタIAVの力価の中央値は、チャレンジコントロールと比較したところ、チャレンジ5日後（CH+5）で採取したサンプルで統計的に有意に減少し、一方、陰性コントロールグループの全動物はそれらの肺ホモジネートで感染性ブタIAVウイルス力価を示さなかった（図31）。したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによるワクチン接種は、仔ブタの異種ブタIAV H3N2株によるチャレンジ5日後の肺のブタIAV量をそれぞれ統計的に有意に減少させた。結果として、本明細書に記載するワクチンはブタIAVに対してブタで有効である。
さらにまた、試験0日目（SD0、最初のワクチン接種前）、試験21日目（SD21、第二のワクチン接種前）、および試験35日目（SD35、第二のワクチン接種後2週間）に試験動物から採取した血清を、組換え発現ブタIAV H3抗原（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）に対して得られるブタ免疫グロブリンG（IgG）に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって分析した。陰性コントロールグループの血清の平均OD値はSD21およびSD34について非常に低い値しか提示しなかったが、一方、ワクチン接種グループの血清は、2回の筋肉内適用後に（2X IM；SD35）、初回鼻内続いて筋肉内適用後に（IN+IM；SD35）、および2回の鼻内適用後に（2X IN；SD42/43）OD値の高い増加を示した（図33）。したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによるワクチン接種は、ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるブタIAVヘマグルチニンH3に対して仔ブタで血清学的免疫応答をそれぞれ引き起こした。
加えて、末梢血単核球（PBMC）を試験動物から試験28日目（SD28）に採取した血液から精製した。続いてPBMCを、感染多重度1のH3N2ブタIAVチャレンジ株R452-14で（H3N2 MOI 1）、または1μg/mLの濃度の組換え発現ブタIAV H3抗原（rH3 1μg/mL）（ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるH3と同種）で再刺激した。この再刺激PBMCを用いて、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（IFNγELISpot）を実施し、得られた値を10^6細胞に対して正規化し、それぞれグループ当たりの平均として算出した（図35）。チャレンジコントロールグループ（この試験の陰性コントロールとして供された；動物はワクチン接種されなかった）の再刺激PBMCは、どちらの再刺激後でもグループ当たり15未満の平均スポットを示したが、一方、ワクチン接種動物の再刺激PBMCは、2回筋肉内適用後に30より多い、初回に鼻内続いて筋肉内適用後に（IN+IM）55スポットを超える、および2回鼻内適用後に（2X IN）65スポットを超えるグループ当たりの平均スポットをどちらの再刺激後にもそれぞれ示した（図35）。したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによるワクチン接種は、ワクチン株rEHV-1 RacH-SE_Bによって発現されるブタIAVヘマグルチニンH3に対して、および異種チャレンジウイルス感染に用いたブタIAV H3N2 R452-14に対して仔ブタで細胞性免疫応答をそれぞれ引き起こした。
したがって、rEHV-1 RacH-SE_BおよびrEHV-1 RacH-SE_Dから成る四価ブタIAVワクチンによる仔ブタのワクチン接種は、検出可能な血清学的および細胞性免疫応答を仔ブタで誘発し、異種ブタIAVチャレンジの5日後の肺ホモジネートで統計的に有意に減少するブタIAV量によってワクチンの有効性を示した。
本明細書および特許請求の範囲に示される組成物および方法のいずれも、本開示に照らせば過度の実験を実施することなく作製及び実施可能である。本発明の組成物および方法を好ましい実施態様の関係でこれまで記載してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法並びに方法の工程または一連の工程に変更を加え得ることは当業者には明白であろう。より具体的には、化学的および生理学的に関係を有するある種の薬剤を本明細書に記載の薬剤の代用として、同じまたは類似の結果を達成できることは明白であろう。当業者に明白なそのような全ての類似の代用物および改変は、本特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲および概念内に存在すると考える。
参考文献
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Claims (26)

  1. 以下を含む発現カセット：
    （i）対象とする少なくとも1つの外因性ヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、前記対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が作動できるようにプロモーター配列に連結されているもの、および
    （ii）配列番号:13およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:15およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:17およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの左ORF70フランキング領域、および
    （iii）配列番号:14およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:16およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:18およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの右ORF70フランキング領域。
  2. 請求項1に記載の発現カセットを含む、ウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、好ましくはRacH株。
  3. 以下を含むウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、好ましくはRacH株：
    （i）対象とする少なくとも1つの外因性ヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、前記対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が作動できるようにプロモーター配列に連結されているもの、および
    （ii）配列番号:13およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:15およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:17およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの左ORF70フランキング領域、および
    （iii）配列番号:14およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、配列番号:16およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列、並びに配列番号:18およびその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つの右ORF70フランキング領域。
  4. ORF70に挿入された、対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む、ウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、好ましくはRacH株。
  5. ORF70に挿入された、対象とする第一のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列および第二の挿入部位、好ましくはORF1/3に挿入された、対象とする第二のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列を含む、ウマアルファヘルペスウイルス1（EHV-1）ベクター、好ましくはRacH株。
  6. ORF70への挿入がORF70における部分的欠失、切詰め、置換、改変などを特徴とし、ORF71は機能的なままである、請求項2から5に記載のEHV-1ベクター。
  7. ORF70への挿入が、RacHのORF70内の約801bp部分（配列番号:20）またはその70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列の欠失を特徴とする、請求項2から6に記載のEHV-1ベクター。
  8. EHV-1ベクターが、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、および配列番号:18、並びにこれらの配列のいずれか1つの70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同および/または同一の配列から成る群から選択される少なくとも1つのフランキング領域を含む、請求項2から7に記載のEHV-1ベクター。
  9. EHV-1ベクターが、（i）配列番号:13、配列番号:15および配列番号:17から成る群から選択される少なくとも1つの左ORF70フランキング領域、および（ii）配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18から成る群から選択される少なくとも1つの右ORF70フランキング領域を含む、請求項2から8に記載のEHV-1ベクター。
  10. 対象とするヌクレオチド配列、好ましくは対象とする遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、天然には存在しないかおよび/または組換え体である、請求項2から9に記載のEHV-1ベクターまたは請求項1に記載の発現カセット。
  11. 対象とするヌクレオチド配列が組換え体および/または異種および/または外因性である、請求項2から10に記載のEHV-1ベクターまたは請求項1若しくは10に記載の発現カセット。
  12. 抗原コード配列が、食料生産動物（例えばブタまたは畜牛）に感染する病原体と関係がある、請求項2から11に記載のEHV-1ベクターまたは請求項1若しくは10から11に記載の発現カセット。
  13. さらに追加の調節配列（例えば終了シグナルまたはポリアデニル化配列）を含む、請求項2から12に記載のEHV-1ベクターまたは請求項1若しくは10から11に記載の発現カセット。
  14. 対象とする少なくとも1つのさらに別のヌクレオチド配列、好ましくは対象とする別の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を、場合によって別の挿入部位（例えばORF1/3）に挿入されて追加的に含む、請求項2から13に記載のEHV-1ベクター。
  15. 対象とする遺伝子が調節配列、好ましくはプロモーター配列に作動できるように連結されている請求項4から14に記載のEHV-1ベクター、または、対象とする少なくとも2つの遺伝子が調節配列、好ましくはプロモーター配列に作動できるように連結されている請求項5から14に記載のEHV-1ベクター。
  16. 対象とする1つ若しくは2つ若しくは3つ以上の配列または遺伝子に作動できるように連結されているプロモーター配列が以下から成る群から選択される、請求項2から15に記載のEHV-1ベクターまたは請求項1若しくは10から11若しくは13に記載の発現カセット：SV40ラージT、HCMVおよびMCMV前初期遺伝子1、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、4pgG600（配列番号:1）の機能性フラグメント（好ましくは前記機能性フラグメントはp430（配列番号:3））、4pgG600（配列番号:1）の相補性ヌクレオチド配列の機能性フラグメント、4pMCP600（配列番号:2）の機能性フラグメント（好ましくは前記機能性フラグメントはp455（配列番号:4））、4pMCP600（配列番号:2）の相補性ヌクレオチド配列の機能性フラグメント。
  17. 対象とする少なくとも2つの遺伝子に作動できるように連結されているプロモーター配列が異なる、請求項5から16に記載のEHV-1ベクター。
  18. 対象とする少なくとも1つの遺伝子に作動できるように連結されている当該プロモーター配列が、p455（配列番号:4）またはその機能的フラグメントまたはその相補性ヌクレオチド配列であり、対象とする別の遺伝子に作動できるように連結されている当該プロモーター配列がp430（配列番号:3）またはその機能的フラグメントまたはその相補性ヌクレオチド配列である、請求項2から17に記載のEHV-1ベクター。
  19. 請求項2から18に記載のベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞。
  20. 免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、請求2から18に記載のベクターまたは請求項19に記載の哺乳動物宿主細胞の使用。
  21. 免疫原性組成物であって、
    a．請求項2から18に記載のベクター、および/または
    b．請求項2から18に記載のベクター、例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（VLP）などによって発現されるポリペプチド、および
    c．場合によって医薬的または獣医的に許容できる担体または賦形剤を含み、
    好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻内適用に適切であり、
    好ましくは前記免疫原性組成物がウイルス、例えば感染性ウイルスを含む、
    前記免疫原性組成物。
  22. ワクチンまたは医薬組成物であって、
    a．請求項2から18に記載のベクター、および/または
    b．請求項2から18に記載のベクター、例えば改変生ウイルス、ウイルス様粒子（VLP）などによって発現されるポリペプチド、および
    c．医薬的または獣医的に許容できる担体または賦形剤を含み、好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻内適用に適切であり、
    d．場合によって前記ワクチンがさらにアジュバントを含む、
    前記ワクチンまたは医薬組成物。
  23. 以下の工程を含む、感染と関連するかまたは感染によって引き起こされる1つ以上の徴候の発生率または重篤度を軽減するための免疫原性組成物またはワクチンの調製方法：
    a．請求項19に記載の哺乳動物宿主細胞に請求項2から18に記載のベクターを感染させる工程、
    b．当該感染細胞を適切な条件下で培養する工程、
    c．感染細胞培養物を収集する工程、
    d．場合によって工程c）の収集感染細胞培養物を精製する工程、
    e．前記収集感染細胞培養物を医薬的に許容できる担体と混合する工程。
  24. 病原体による感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を動物で軽減若しくは予防する方法に使用する、または病原体による感染を動物で治療または予防する方法に使用する、好ましくは前記動物が食料生産動物（例えばブタ）である、請求項21に記載の免疫原性組成物または請求項22に記載のワクチン。
  25. 動物、例えば食料生産動物（ブタを含む）を病原体によって前記動物で引き起こされる臨床疾患に対して免疫する方法であって、請求項21に記載の免疫原性組成物または請求項22に記載のワクチンを当該動物に投与する工程を含み、それによって前記免疫原性組成物またはワクチンが感染の臨床徴候を引き起こすことなく、前記病原体の病原型に対して当該動物を免疫する免疫応答を誘発することができる、前記方法。
  26. 動物、好ましくは食料生産動物（例えばブタまたは畜牛）を、動物の病原体と関係する疾患に対してワクチン免疫し、および/または動物の病原体と関係するかまたは動物の病原体によって引き起こされる1つ以上の臨床徴候の発生率または重篤度を軽減するためのキットであって、
    a）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
    b）請求項21に記載の免疫原性組成物または請求項22に記載のワクチン、および
    c）場合によって指示小冊子
    を含む、前記キット。
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