CN109593110A

CN109593110A - 一种利用化橘红制备柚皮苷的方法

Info

Publication number: CN109593110A
Application number: CN201910123809.6A
Authority: CN
Inventors: 潘思轶; 彭颖; 卢琪
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: CN109593110B

Abstract

本发明提供了一种利用化橘红制备柚皮苷的方法，属于天然产物制备技术领域。本发明所述方法包括如下步骤：(1)将化橘红置于30～60％体积分数的乙醇水溶液中，30～60℃提取，得到化橘红乙醇提取液；(2)将所述化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩，得到浸膏；(3)将所述浸膏与水混合，所述浸膏与水的质量比为1：(4～6)；5～15℃静置5～8h，析出黄色沉淀，固液分离，得到柚皮苷。按照本发明提供的方法制备柚皮苷，工艺简单，且柚皮苷产物的纯度＞95％，得率＞9.0％。

Description

一种利用化橘红制备柚皮苷的方法

技术领域

本发明属于天然产物制备技术领域，具体涉及一种利用化橘红制备柚皮苷的方法。

背景技术

化橘红属于芸香科柑橘属柚类变种化州柚，入药成分为未成熟或近成熟的干燥外层表皮，临床用于治疗风寒咳嗽，痰多气逆，食积暖气和呕恶痞闷等症，是广东名贵特产药材。柚皮苷是化橘红的主要有效成分之一，除了具有分解肝脏内糖、降脂、抗氧化、抗病毒、抗菌、治疗肺炎等生物活性外，还有治疗HIV、防晒、治疗骨质疏松症、治疗椎间盘退变以及治疗卵巢癌等活性，还能合成高甜度、低能量、安全无毒的新型甜味剂柚皮苷二氢查尔酮。

目前对化橘红的开发主要在饮片、饮料、保健酒、保健茶、口服液、片剂与胶囊等。化橘红中的柚皮苷具有良好的抗氧化效果，然而，作为天然抗氧化剂的化橘红提取物并没有得到有效利用。因此，研制一种利用化橘红制备高纯度柚皮苷的方法，对化橘红资源的现代化应用具有重要意义。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用化橘红制备柚皮苷的方法，工艺简单，产物纯度高，得率高。

本发明提供了一种利用化橘红制备柚皮苷的方法，包括如下步骤：

(1)将化橘红置于30～60％体积分数的乙醇水溶液中，30～60℃提取，得到化橘红乙醇提取液；

(2)将所述化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩，得到浸膏；

(3)将所述浸膏与水混合，所述浸膏与水的质量比为1：(4～6)；5～15℃静置5～8h，析出黄色沉淀，固液分离，得到柚皮苷。

优选的，步骤(1)所述化橘红以5～6月份采摘的化州柚为原料，干燥后制得。

优选的，所述干燥的温度为80～95℃。

优选的，步骤(1)所述化橘红为化橘红粉末，所述化橘红粉末的粒径为20～100目。

优选的，步骤(1)所述化橘红的质量与乙醇水溶液的体积比例为1g：(30～120)mL。

优选的，步骤(3)所述浸膏与水混合后，混合液的密度为0.9～1.1。

优选的，步骤(2)所述旋蒸浓缩的温度为50～60℃。

优选的，步骤(3)所述固液分离后，还包括烘干，所述烘干的温度为45～50℃。

优选的，步骤(3)固液分离后，还包括对液相进行离心，所述离心的转速＞2000r/min，所述离心的时间＞10min，离心后固液分离，得到固相和上清液，将固相合并至柚皮苷。

优选的，本发明将所述上清液过AB-8大孔树脂，上柱浓度为2.0mg/mL，上柱液pH＝7，上柱流速为3BV/h，用60％-80％体积分数的乙醇洗脱，洗脱液旋蒸浓缩得到浸膏，浸膏加5倍体积蒸馏水，10℃静置12h，过滤收集黄色沉淀，将所述黄色沉淀合并至柚皮苷。

有益效果：本发明提供了一种利用化橘红制备柚皮苷的方法，包括如下步骤：(1)将化橘红置于30～60％体积分数的乙醇水溶液中，30～60℃提取，得到化橘红乙醇提取液；(2)将所述化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩，得到浸膏；(3)将所述浸膏与水混合，所述浸膏与水的质量比为1：(4～6)；5～15℃静置5～8h，析出黄色沉淀，固液分离，得到柚皮苷。按照本发明提供的方法制备柚皮苷，工艺简单，且柚皮苷产物的纯度＞95％，得率＞5.5％。本发明还对上述方法做了进一步改进，在步骤(3)水沉、固液分离后，对液相进行离心，收集离心后的固相，合并至柚皮苷；然后对离心后的上清液进行大孔树脂分离洗脱纯化，再进一步水沉得到黄色沉淀，合并至柚皮苷。经改进后的方法得到的柚皮苷总得率为9.19％。

附图说明

图1为本发明实施例4所述水沉产物的红外光谱分析结果图；

图2为本发明实施例4所述水沉产物的扫描电镜分析结果图；

图3为本发明实施例4所述液质联用分析结果中的柚皮苷标准品液相标准曲线图；

图4为本发明实施例4所述液质联用分析结果中的柚皮苷标准品的液相色谱图；

图5为本发明实施例4所述液质联用分析结果中的水沉产物的液相色谱图；

图6为本发明实施例4所述液质联用分析结果中的柚皮苷标品的一级质谱图；

图7为本发明实施例4所述液质联用分析结果中的柚皮苷标准品的二级质谱图；

图8为本发明实施例4所述液质联用分析结果中的水沉产物的一级质谱图。

具体实施方式

(2)将所述化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩，得到浸膏；

本发明先将化橘红置于乙醇水溶液中提取可溶性成分。

在本发明中，所述化橘红优选以5～6月份采摘的化州柚(正毛化州橘红幼果全果，茂名市地级市化州市平定镇本地果园产)为原料，干燥后制得；所述干燥的温度优选为60～80℃，更优选为70℃；所述干燥的时间优选为40～50h，更优选为45h。5～6月份采摘的化州橘红幼果因为其果肉还未开始发育，主要部分是内外果皮，而内外果皮中柚皮苷的含量较果肉中更高。在本发明中，所述化橘红优选为化橘红粉末，所述化橘红粉末的粒径优选为20～100目，更优选为30～80目，化橘红粉末相较于大块化橘红具有更大的比表面积，有利于醇溶性成分尤其是柚皮苷的浸出。本发明对所述化橘红粉末的制备方法不作特别限定，本领域常规切片、粉碎等方法制备得到均可。本发明优选采用先切片后粉碎的工艺，在本发明中，所述切片的厚度优选为2～5mm，更优选为3mm。在本发明中，所述化橘红优选还经过蒸气软化，所述蒸气软化的时间优选为8～10min，所述蒸气软化有利于后续的切片、粉碎操作以及提取过程中可溶性成分的溶出。

本发明利用乙醇水溶液提取化橘红中的可溶性成分，得到化橘红乙醇提取液。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度为30～60％，优选为40～55％，更优选为50.8％。乙醇作为溶剂能有效的萃取柚皮苷，当乙醇浓度低于60％，有大量水溶性物质溶出，导致抽滤困难，所以选用60％以下，优选为50.8％的乙醇作为溶剂，因为乙醇有易挥发的特点，因此可以回收乙醇重复利用。提取后抽滤的滤渣可以作为肥料。在本发明中，所述化橘红与乙醇水溶液的用量比例优选为1g：(30～120)mL，更优选为1g：(50～80)mL，更优选为1g：60.9mL，该用量比例的设置有利于提高柚皮苷产物的得率。所述提取的温度为30～60℃，优选为50～58℃，更优选为57.5℃。本发明优选使用超声辅助提取，所述超声辅助提取能利用超声波的空化效应，能使细胞中的柚皮苷更多的释放。在本发明中，所述超声的功率优选60～100W，更优选为80W。当使用超声辅助提取时，所述提取的时间优选为30～120min，更优选为50～100min，更优选为70～80min。

得到化橘红乙醇提取液后，本发明将所述化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩，得到浸膏。在本发明中，所述旋蒸浓缩的温度优选为50～60℃，更优选为55℃。

得到浸膏后，本发明将所述浸膏与水混合，析出黄色沉淀，固液分离，得到柚皮苷。在本发明中，所述浸膏与水的混合比例按质量份计，优选为1：4～6，更优选为1：5。混合液的密度优选为0.9～1.1，更优选为1.02～1.06，更优选为1.0482。混合后静置，所述静置的温度优选为5～15℃，更优选为10℃，所述静置的时间优选为5～8h，更优选为6h。本发明优选将析出的黄色沉淀物质烘干，所述烘干的温度优选为45～50℃，更优选为47～48℃，烘干后得到黄色粉末。本发明利用红外、电镜、液质表征柚皮苷，用液相测得柚皮苷的纯度在95％以上，得率＞5.5％。

本发明在步骤(3)固液分离后，还优选在步骤(3)水沉、固液分离后，对液相进行离心，收集离心后的固相，合并至柚皮苷；然后对离心后的上清液进行大孔树脂分离洗脱纯化，再进一步水沉得到黄色沉淀，合并至柚皮苷。在本发明中，所述离心的转速＞2000r/min，所述离心的时间＞10min，离心后固液分离，得到固相和上清液。在本发明中，所述固相即为纯度＞95％的柚皮苷，所述固相的得率为2.28％。在本发明中，所述大孔树脂优选采用AB-8。上柱浓度优选为2.0mg/mL，上柱液pH优选为7，上柱流速优选为3BV/h，优选用60％-80％体积分数的乙醇洗脱，洗脱液旋蒸浓缩得到浸膏，浸膏优选加5倍体积蒸馏水，优选在10℃条件下静置，静置时间优选为12h，过滤收集黄色沉淀。在本发明中，所述黄色沉淀即为纯度＞95％的柚皮苷，所述黄色沉淀的得率为1.34％。本发明将离心后的固相以及大孔树脂分离洗脱纯化后的黄色沉淀合并至柚皮苷，柚皮苷的总得率为9.19％。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种利用化橘红制备高纯度柚皮苷的方法：

A、化橘红的制备：采摘6月份未成熟新鲜正毛化州橘红幼果全果，清洗、晾干、65℃转小火干燥50h，烘干水分。

B、提取柚皮苷：化橘红蒸10分钟软化，切片至5毫米，乙醇回流提取柚皮苷。提取条件为：超声功率80W，提取时间120分钟，乙醇体积分数60％，提取温度60℃，料液比为1g：180ml。

C、制备高纯度柚皮苷：将化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩制备浸膏，回收乙醇，浸膏烘干后，加入6倍质量的蒸馏水，静置待黄色沉淀析出，过滤，烘干，得到黄色粉末用红外、电镜、液质表征，用液相测得柚皮苷纯度为95％以上，得率为5.4％。

实施例2

一种利用化橘红制备高纯度柚皮苷的方法：

A、化橘红的制备：采摘5月份未成熟新鲜正毛化州橘红幼果全果，清洗、晾干、75℃转小火干燥40h，烘干水分。

B、提取柚皮苷：化橘红蒸8分钟软化，切片至3毫米，乙醇回流提取柚皮苷。提取条件为：超声功率80W，提取时间30分钟，乙醇体积分数30％，提取温度30℃，料液比为1g：60ml。

C、制备高纯度柚皮苷：将化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩制备浸膏，回收乙醇，浸膏烘干后，加入4倍质量的蒸馏水，静置待黄色沉淀析出，过滤，烘干，得到黄色粉末用红外、电镜、液质表征，用液相测得柚皮苷纯度为95％以上，得率为4.5％。

实施例3

一种利用化橘红制备高纯度柚皮苷的方法：

A、化橘红的制备：采摘5月底，6月初的茂名市地级市化州市本地果园产的正毛化州橘红幼果全果，在70℃温度下干燥45h，烘干水分。

B、提取柚皮苷：化橘红蒸9分钟软化，切片至4毫米，然后粉碎至50目，乙醇回流提取黄酮。提取条件为：超声功率80W，提取时间80分钟，乙醇体积分数45％，提取温度45℃，料液比为1g：120ml。

C、制备高纯度柚皮苷：将化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩制备浸膏，回收乙醇，浸膏烘干(每500g化橘红得到约195～205g的浸膏)后，加入5倍质量的蒸馏水，调整混合液密度为1.0482，静置待黄色沉淀析出，过滤，烘干，得到黄色粉末用红外、电镜、液质表征，用液相测得柚皮苷纯度为95％以上，得率为5.57％。

实施例4

对实施例3制备得到的水沉产物(黄色粉末)利用红外、电镜、液质进行结构表征并用液相测定其纯度：

(1)水沉产物的红外光谱分析

使用美国Nicolet6700型红外光谱仪，采用KBr压片法制样，测定水沉产物红外图谱。相关参数为：KBr与样品置于WS70-1红外线快速干燥器烘干至少两小时；于干燥器门口以1:50的质量比取KBr与10mg样品于玛瑙研钵中研至颗粒细小、无反光为止；将研磨后的粉末置于压片装置中压片，压力为20-25MPa，压片时间为10s-1min。

测得的红外图谱见图1。图1表明：纯化产物红外特征吸收峰分析如下：1642.88cm^-1处有强吸收，为羰基的伸缩振动峰；3393.71cm^-1处有宽而强的吸收峰，为羟基的伸缩振动峰，由氢键缔合后的羟基引起；2919.28cm^-1为甲基不对称伸缩振动峰；1521.00cm^-1为苯环上碳碳双健的骨架振动。符合柚皮苷的红外图谱。

(2)水沉产物的扫描电镜分析

采用日本电子株式会社JSM-IT300型SEM设备观察加氢产物形貌，加氢产物进行表面喷镀金保护层处理。扫描电镜主要技术参数为二次电子像分辨率：3.0nm；背散射电子像分辨率：4.0nm；放大倍数范围：X300-5000；电子枪加速电压：20kV；图像种类：二次电子像；标尺长度5-50um。

水沉产物扫描电镜结果见图2。在图2中，a、b、c、d和e依次为放大5000倍，2000倍，1000倍，500倍和300倍的水沉产物电镜照片，a、b、c、d和e中的比例尺长度依次为5μm，10μm，10μm，50μm和50μm。由图2可以看出：加水静置过程中，柚皮苷以结晶的形式从水中析出。

(3)水沉产物的液质联用分析

采用Agilent Technologies Inc公司的Agilent 1100LC/MSD-TRAP-XCT液相色谱/质谱联用仪分析水沉产物。

液相色谱分析条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX XDB C18柱，4.6*150mm，5um；流动相：乙腈：0.1％甲酸水溶液＝18:82；柱温：30℃；检测器：DAD(190-600nm)；检测波长：282nm；流速：1.0ml/min。

样品处理：准确称取样品17.72mg，用流动相溶解并定容至3.0mL，稀释100倍后取20uL进样分析。标样：准确称取标样1.72mg，用流动相溶解并定容至3.0mL，用流动相逐级稀释至114.67ng/uL，57.333ng/uL，22.933ng/uL，11.467ng/uL，4.587ng/uL，取200uL测定。

质谱分析条件：进样方式：LC-MS；离子源：ESI；检测模式：负离子；扫描范围(m/z)：50-900；离子源温度(℃)：300；雾化气流速(psi)：40；干燥气流速(L/min)：10；毛细管电压(V)：3500；毛细管出口电压(V)：109；扫描方式：auto MS/MSn。

液质联用分析结果见图3～8。其中，图3～5显示：13.681min为柚皮苷出峰时间，此时峰面积为1776.1，由公式y＝33.651x+11.233(R2＝0.9999)可以得到柚皮苷样品测定浓度为52.4457ng/uL，由于柚皮苷对照品的纯度为93.4％，因此水沉样品实际测得的浓度为0.0524mg/mL/0.934＝0.0561mg/mL，而水沉样品的实际浓度为17.72mg/300mL＝0.059mg/mL，因此水沉样品纯度为0.0561/0.059×100％＝95.1％。图6～8显示：水沉产物的质谱图和柚皮苷标品的质谱图是一致的，说明水沉产物就是柚皮苷。

实施例5

对实施例3步骤C水沉、过滤后的滤液进行离心处理，离心转速＞2000r/min，离心时间＞10min，离心后固液分离，收集固相(固相即为纯度＞95％的柚皮苷，其相较化橘红原料的得率为2.28％)，1L滤液得到11.4g柚皮苷；

离心后的上清液过AB-8大孔树脂，上柱浓度为2.0mg/mL，上柱液pH＝7，上柱流速为3BV/h，用60％-80％体积分数的乙醇洗脱，洗脱液旋蒸浓缩得到浸膏，浸膏加5倍体积蒸馏水，10℃静置12h，过滤收集黄色沉淀(黄色沉淀即为纯度＞95％的柚皮苷，其相较于化橘红原料的得率为1.34％)，1L滤液得到6.7g柚皮苷。

化橘红柚皮苷的总得率为9.19％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用化橘红制备柚皮苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将所述化橘红乙醇提取液旋蒸浓缩，得到浸膏；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述化橘红以5～6月份采摘的化州柚为原料，干燥后制得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述干燥的温度为80～95℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述化橘红为化橘红粉末，所述化橘红粉末的粒径为20～100目。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述化橘红的质量与乙醇水溶液的体积比例为1g：(30～120)mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述浸膏与水混合后，混合液的密度为0.9～1.1。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述旋蒸浓缩的温度为50～60℃。

8.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述固液分离后，还包括烘干，所述烘干的温度为45～50℃。

9.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)固液分离后，还包括对液相进行离心，所述离心的转速＞2000r/min，所述离心的时间＞10min，离心后固液分离，得到固相和上清液，将固相合并至柚皮苷。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述上清液过AB-8大孔树脂，上柱浓度为2.0mg/mL，上柱液pH＝7，上柱流速为3BV/h，用60％-80％体积分数的乙醇洗脱，洗脱液旋蒸浓缩得到浸膏，浸膏加5倍体积蒸馏水，10℃静置12h，过滤收集黄色沉淀，将所述黄色沉淀合并至柚皮苷。